Secvenierea acizilor nucleici

-Principii generale-

Determinarea secnveelor de AND implic folosirea metodelor biochimice pentru stabilirea ordinii bazelor azotate dintr-o secven oligonucletidic. Metodele de lucru au evoluat de la procedurile laborioase bazate pe migrarea n gel de poliacrilamid pan la cele modern care utilizeaz colorani i detecie prin electroforez capilar. Astfel s -a putut ajunge ca n prezent s se poat cunoate genomuri i transcriptomuri ntregi. Datorit vitezei cu care se pot secveia n prezent cantiti mari de AND, aceast tehnic a nceput s fie folosit n tot mai multe domenii , precum : criminalistic , medicin, ecologie i taxonomie. Folosirea tehniclor moleculare cunoate o dezvoltare mare, iar echipamentele devin mai upr de folosit i ofer o productivitate sporit. Dac n anii 70 era nevoie de ani de zile de foarte mult munc pentru a secvena numai cteva zeci de perechi de baze, n prezent se poate determina nlnuirea bazelor pe lungimi de un milliard de baze ntr-o singur zii. nainte de dezvoltarea tehnicilor rapide de secveniere, la nceputul anilor 1970 Frederick Sanger, Allan Maxam i Walter Gilbert au folosit diferite metode laborioase pentru determinarea secvenelor de baze azotate din acizii nucleici. De exemplu, Gilbert i Maxam (1973) o secven de 24pb, obinut prin metoda de analiz (wandering-spot). Metoda secvenierii cu un terminator al lanului nucleotidic a fost dezvoltat de Sanger i colaboratorii si n 1975, metod care a devenit rapid cea preferat de marea majoritate datorit uurinei cu care se poate efectua i a rezultatelor satisfctoare obinute. Dificultile de prezentate de dimensiunile mari ale AND-ului a fcur ca initial atenia cercetrilor s fie ndreptat nspre ARN , mai precis ARNt care are dimensiuni considerabil mai mici. Moleculele de ARN erau tiate cu enzimele potrivite n fragmente mai mici , a cror secven era apoi determinate, apoi structura molecule ntregi era dedus. Aceast metod consuma foarte mult timp i implica foarte mult munc, fiind nevoie de digestii i de fractionri succesive. S-au obinut i cteva secvene semnificative de AND , de 50bp, dar era nevoie de o alt abordare a problemei pentru a descira fragmente mai mari.

Urmtorul pas a fost folosirea metodelor care implicau copierea materialului genetic. Metoda a fost initial dezvoltat prin sintetizarea noilor catene de pe un fragment de ARN, folosnd nucleotide marcate radioactive. Folosirea metodelor de copiere pentru AND, implic folosirea unei AND polimeraze, care copiaz AND-ul monocatenar n direcia 3-5 . Enzima sintetizeaz o nou caten pe baz de complementaritate, dar are nevoie de un capt 3 liber, astfel fiind nevoie de o amors (primer). Prin folosirea nucleotidelor trifosfatate marcate radioactive cu 32p n poziia alfa, ADN-ul nou sintetizat paote fi marcat. Nucleotidele marcate radioactiv cu avantajul c pot fi vizualizate prin autoradiografie. Iniial primerii erau oligonucleotide sintetizate chimic, dar apoi au fost folosite fragmente obinute prin tierea cu nou descoperitele endonucleaze de restricie. Aceste enzime sunt capabile de recunoaterea unui situs specific din secvena de ADN, iar apoi s taie n interiorul acesteia sau imediat adiacent. Prin folosrea procedurii de sintez a unei noi catene se obine o regiune specific a ADN, marcat radioactiv, care apoi poate fi supus procedurilor de digestie parial. Nu se cunoateau enzime specifice care s recunoasc un situs de tiere de o singur nucleotid, astfel fiind nevoie folosirea unei alte metode pentru obinerea unor fragmente mici. Problema a fost rezolvat prin ncorporarea ribonuleotidelor n catena nou format, n locul deoxiribonucleotidelor. Se folosea un ribonucleotid trifosfatat i alte trei trei dezoxiribonucleotide trifosfatate. Astfel dac se folosete un exemplu riboCTP i dATP, dGTP, dTPP se poate sintetiza o caten nou, n care C este n form ribo. Legturile cu riboNTPs pot fi desfcute n condiii de alcalinitate, astfel ca se poate obine o fragmentare la resturile de C. Folosind aceast metod au putut fi extinse studiile de secveniere, totui fiind nc nevoie de fracionari i de analize extensive. Metoda terminrii lanului Pentru a crea copii ADN de o radioactivitate specific a fost nevoie de

substratul marcat sa fie n concentraii mai mici e celelalte dNTPs. Frecvent se observa n urma analizelor c lanurile se termin la situsurile la care ar fi fost nevoie sa se ncorporeze nucleotidele marcate radioactiv. Prin fracionarea produilor de diferite lungimi, avnd acelai capt 5 i cu finalul la un nucleotid cunoscut, se poate obine un pattern de fracionare, proporional cu distribuia nucleotidului marcat radioactiv de-a lungul secvenei. Prin aflarea pattern-urilor i pentru celelalte

nuleotide se poate determina secvena de nucleotide pentru un fragment de ADN. Viteza de lucru a fost crescut prin migrarea simultan a fraciunilor n geluri de poliacrilamid. Metoda aceasta a avut un succes limitat, dar a servit ca baz pentru alte metode, ajungndu-se la tehnica plus i minus, folosit pentru a obine genomul aproape complex al fagului X174, de 5386 nucleotide. O metod similar celei de mai sus este cea care folosete dideoxinuleotide pentru a termina sinteza lanului ADN. Metoda este mai rapid i mai precis dect cea anterioar i a fost folosit pentru a completa secvena fagului X174, a o determina pe cea a fagului G4 i a mai multor genomuri mitocondriale. Dideoxinucleotidele nu au captul 3-OH necesar adugrii de noi nucleotide, astfel c dup ncorporarea lor acioneaz ca i terminatori, fiind imposibil pentru ADN polimeraz s adauge noi nucleotide. Reaciile au loc n patru amestecuri diferite, fiecare cu cte unul din cele patru dideoxinucleotide. Apoi cele patru amestecuri sunt fracionate n paralel prin electroforez pe gel de poliacrilamid, sub condiii de denaturare. Acest sistem separ fragmentele n funie de mrime. Secvena poate fi astfel citit pur i simplu de pe o autoradiografiere a gelului. Metoda este relativ rapid i secvene de o lungime de aproximativ 300 nucleotide de la captul 3 al primerului pot fi determinate. Secvene mai lungi de 300 nucleotide pot fi citite, dar sunt mult mai puin sigure. Aceast metod a fost dezvoltat prin folosirea primerilor marcai fluorescent, metod cunoscut drept dye primer sequencing. Metoda a fost dezvoltat mai departe prin folosirea ddNTPs marcate fluorescent, fiecae cu cte un colorant diferit. Avantajul acestei tehnici este evitarea folosirii materialelor radioactive i creterea vitezei de lucru fiind nevoie de un singur amestec de reacie, fiecare colorant florescent oferind rspuns la o lungime diferit de und. Aceast abordare a secvenierii este cunoscut drept dye terminat or sequencing . Aceste noi dezoltri au deschis calea spre automatizarea secevenierii i nceputul secvenierilor genomice high-throughput. n timpul separrii polinucleotidelor marcate, o raz laser excit floroforii. Fluorescena emis este colectat de ctre detectoare ( tuburi fotomultiplicatoare , elemente CCD sau camere) i apoi trimise ctre computer, unde un software convertete datele n secevene nucleotidice.

Apariia tehnicilor bazate pe detecia fluorescenei a elimina t folosirea markerilor radioactivi pentru secvenierea materialului genetic, datorit siguranei sporite, mentenanei reduse, abilitatea de muliplexa i de a achiziiona datele n timp real. n ultimii ani au fost dezvoltate protocoale noi pentru pregtir ea probelor pentru secveiere prin amplificare PCR(polymerase chain reaction), care prezint mult interes datorit avantajelor pe care le prezint fa de tehnicile tradiionale cu dideoxinucleotide. Avantajele principale sunt: folosirea oricrei secvene ADN mono sau dublucatenar drept matri, reaciile se pot desfura n microplci sau micro reactoare n cazul PCR-ului de emulsie, manipularea manual este minim, este nevoie de cantiti infirme de matri, de ordinul picomolilor. n cazul secvenierii ciclice, o singur amors este folosit pentru a amplifica liniar o caten matri n prezena Taq polimerazei i a unui amestec de dNTPs i ddNTPs. Majoritatea protocolurilor create recomand folosirea radioizotopilor sau a fluoroforilor la captul 5 al amorsei. Protocoale folosite n cazul amplificrii cu Taq polimeraz s-au dovedit foarte utile n obinerea secvenelor de 400 -500 nucleotide, dar i cu proiecte de secveniere la scal mai mare. Pirosecvenierea n 1996 metoda de secveniere prin pirosecveniere a fost dezvoltat la Institutul Regal pentru Tehnologie din Stockholm. Metoda se bazeaz pe secvenierea prin sintez. Procesul implic sintetizarea unei catene de pe o matri de ADN i secvenierea acesteia n acelai timp. Activitatea de n corporare a nucleotidelor de ctre polimeraz este evideniat printr-o reacie luminescent. ADN-ul matri este imobilizat pentru un substrat i nucleotidele trifosfatate sunt adugate i eliminate secvenial. Reacia cu producere de lumin are loc numai cnd este ncorporat una dintre nucleotide. Prin emiterea de lumin numai la ncorporarea unui nucleotid se determin secvena. Ciclul de reacii: -eliminarea unui pirofosfat la ncorporarea unui nucleotid -transformarea pirofosfatului n ATP de ctre ATP sulfurilaz, n prezena adenozin 5 fosfosulfatului

-ATP particip n conversia luciferinei n oxiluciferin, reacie mediat de luciferaz, cu eliminare de lumin. -nucleotidele nencorporate sunt degradate de ctre apiraz, astfel putnd ncepe un nou ciclu de reacii. Secveniatoarele care folosesc acest metod sunt cele mai performante n prezent, ajungnd pn la 1 miliard de perechi de baze secveniate pe zi. n prezent se lucreaz la alte metode noi de secveniere, inta fiind de 1000 USD pentru secvenierea unui genom uman complet. Exist i un premiu de 10 milioane USD pentru prima echip care va reui s secvenieze 100 de genomuri n maxim 10 zile, cu o acuratee de cel puin de o eroare la 100.000 de baze azotate, cuprinznd cel puin 98% din genom i cu un cost mai mic de 10000 USD/genom.