Purifikasi Enzim Amilase Pengendapan dengan Amonium Sulfat Presipitasi protein dapat dilakukan dengan penambahan amonimum sulfat

pada konsentrasi tinggi secara bertahap Protein yang mengendap akibat penambahan larutan amonium sulfat tidak mengalami denaturasi. Protein dalam larutan buffer mengalami hidrasi, dengan kata lain gugus ionik pada permukaan protein menarik dan mengikat banyak molekul air dengan kuat. Gambar berikut menunjukkan hidrasi molekul protein oleh air (Anonymous, 2007) Ekstrak kasar enzim ditambah dengan ammonium sulfat untuk memisahkan fraksi-fraksi protein dari ekstrak hasil isolasi. Penambahan ammonium sulfat dilakukan secara perlahan dengan bantuan stirrer supaya lebih homogen dan hasil pengendapan lebih optimal. Kemudian didiamkan selama 30 menit pada suhu refrigerator untuk menjaga kestabilan enzim protease, selain itu supaya proses pengendapan lebih efisien. Endapan yang diperoleh kemudian dilakukan dialisis untuk menghilangkan sisa garam ammonium sulfat. Selanjutnya dilakukan presipitasi secara bertingkat (dengan konsentrasi ammonium sulfat 060%) untuk memperoleh hasil pengendapan protease yang maksimal. Dialisis Enzim merupakan protein, sehingga setelah tahap isolasi, dapat dilakukan tahap pemurnian. Protein dapat dipisahkan dari senyawa dengan berat molekul rendah yang ada dalam ekstrak sel atau jaringan dengan proses dialisis. Molekul besar seperti protein ditahan dalam dalam kantong yang terbuat dari senyawa berpori dan amat halus seperti selofan. Jika kantong yang mengandung ekstrak sel atau jaringan dimasukkan ke dalam air, molekul kecil di dalam ekstrak jaringan, seperti garam, akan melalui pori-pori, tetapi protein dengan berat molekul tinggi akan tertahan di dalam kantong (Lehninger, 1982).

Masing-masing fraksi hasil pengendapan ammonium sulfat (I,II, dan III) dilarutkan dalam buffer fosfat 0,2 M pH 8 untuk menjaga kondisi pH bagi protease selama dialisis. Dialisis dilakukan dengan memasukkan fraksi enzim hasil pengendapan amonium sulfat tersebut diatas dalam kantong selofan. Penggunaan kantong selofan untuk mengeluarkan garam dari fraksi yang didialisis. Kemudian kantong selofan dimasukkan dalam larutan buffer fosfat 0,1 M pH 8 dan dilakukan dialisis dengan bantuan stirrer pada kondisi dingin selama semalam. Penggunaan buffer fosfat 0,1 M pH 8 kondisi dingin dengan stirrer selama semalam untuk proses pemisahan garam amonium sulfat dari enzim dan menjaga agar enzim tidak terdenaturasi. Konsentrasi buffer fosfat dalam kantong selofan lebih tinggi dibandingkan di luar kantong selofan (salting out). Setelah dialisis semalam, larutan buffer dan enzim dalam kantong selofan dipindahkan pada tabung sentrifuse dan dilakukan penambahan etanol absolut dan diinkubasi dalam refrigerator selama 1 jam atau sampai terbentuk endapan. Penambahan etanol absolute dingin 750 l (1:1) untuk mengendapkan protein (enzim). Inkubasi pada suhu refrigerator dilakukan untuk memberikan waktu pengendapan etanol terhadap protein. Sentrifuse dilakukan untuk memisahkan protein yang mengendap dari supernatannya. Protein yang mengendap (pellet) dikeringanginkan pada suhu refrigerator dan ditambah dengan buffer trisCl (1:1) dan disimpan pada suhu -20 oC untuk menjaga kestabilannya. Purifikasi dengan Kolom Sephadex G75 Pemurnian protein juga dapat dilakukan dengan menggunakan metode kromatografi. Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Pada kromatografi, komponen-komponennya akan dipisahkan antara dua buah fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam akan menahan komponen campuran sedangkan fase gerak akan melarutkan zat komponen campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal. Sedangkan komponen yang

mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat (Anonymous, 2009). Purifikasi enzim yang selanjutnya menggunakan kromatografi kolom sephadex G75. Sebelumnya disiapkan terlebih dahulu sephadex G75, dimana sebanyak 1 gr sephadex G75 direndam dengan aquadest secukupnya selama semalam (swelling). Kemudian disiapkan kolom dimana disusun pada bagian kolom paling bawah adalah kertas saring dan kemudian ditambahkan glass wool diatasnya. Tujuan penggunaan kertas saring dan glass wool adalah untuk menahan sephadex dalam kolom. Selanjutnya kolom disterilisasi dengan tujuan untuk menghilangkan kontaminasi. Setelah dilakukan sterilisasi, kolom dirangkai pada statif dan sephadex yang telah direndam semalam dimasukkan kedalamnya. Kemudian dalam kolom ditambahkan buffer tris-Cl dan laju alirannya diatur sampai didapat sekitar 750 l per menit. Selanjutnya sebanyak 0,25 ml sampel enzim hasil dialisis dimasukkan dalam kolom dan dilakukan purifikasi. Purifikasi dalam kolom sephadex dilakukan dengan melakukan elusi sampel sampai didapat 15 fraksi hasil elusi masingmasing sebanyak 750 l, dimana 4 fraksi awal dibuang dan hanya digunakan 11 fraksi selanjutnya untuk dilakukan elektroforesis. Selama elusi ditambahkan buffer Tris-Cl ke dalam kolom agar fase gerak tidak kurang.

Pustaka Anonymous. 2007. Basic Biochemical Techniques. Wilburl H. Campbell. Anonymous. 2009. http://.wikipedia.org/wiki/Chromatography. Lehninger. 1982. Principles Of Biochemistry.