XVI. TRANSPORTUL DE ELECTRONI XVI.1.

CLASE DE ENZIME TRANSPORTOARE DE ELECTRONI La fluxul electronilor particip patru tipuri de enzime de oxidoreducere sau proteine care transport electroni de la substrate organice la oxigen. Ele sunt dehidrogenaze legate de nucleul piridinic (piridindependente, care necesit NAD sau NADP drept coenzime), dehidrogenaze legate de nucleul flavinic (flavin-dependente, care conin flavinadenindinucleotidul, FAD, sau flavinmononucleotidul, FMN, ca grupare prostetic, proteinele cu fier i sulf i citocromii (care conin inelul porfirinic cu fier ca i grupare prostetic. n plus fa de aceste proteine, n transportul de electroni funcioneaz i coenzima solubil n lipide numit ubiquinon sau coenzima Q. XV.1.1. Hidrogenaze legate de piridin Ei se mai numesc piridinodepentente. Se cunosc peste 200 de enzime din aceast categorie, care funcioneaz n diferite ci metabolice i catalizeaz n general reaciile: Substrat redus + NAD+ Substrat redus + NADP+ substrat oxidat + NADH + H+ substrat oxidat + NADPH + H+

n funcie de piridinnucleotidul preferat. Aceste reacii implic transferul reversibil a doi echivaleni reductori de la substrat , sub forma unui ion de hidrur (H-), la poziia 4 a inelului nicotinic (n form oxidat) a nucleotidului piridinic. Cellat atom de hidrogen este eliberat de pe substrat ca i proton. Perechea de electroni care se elibereaz de pe substrat se va lega de nucleul piridinic.
65

Piridinnucleotidele sunt legate necovalent i slab de dehidrogenaza proteic. NAD i NADP trebuie deci privite nu ca grupri prostetice fixe, ci ca substrate, deoarece n cele mai multe cazuri, ele se leag i se disociaz de centrul activ n timpul ciclului catalitic. Nucleotidele piridinice servesc astfel ca transportori disociabili de electroni. Multe dehidrogenaze piridin-dependente au fost obinute n stare pur, de exemplu, glicerinaldehid-3-fosfat dehidrogenaza, lactat dehidrogenaza i malat dehidrogenaza. Unele dehidrogenaze piridin dependente sunt localizate n mitocondrii (-hidroxi-butirat dehidrogenaza), altele n citoplasm (lactat dehidrogenaza) iar altele (malat dehidrogenaza) se gsesc n ambele compartimente. n celulele animale NAD se gsete n cantitate mai mare dect NADP. n ficat cel puin 60% din NAD se afl n mitocondrii, iar restul se gsete n citoplasm. NH2 N N N N OO OCH2-O-P-O-P-O-CH2 O O O OH
NAD
+

COON
+

HO-C-H CH2 COO-

OH

OH

OH

COOC=O CH2 COOoxalilacetat

H + N R
NADH

H CONH2 + H+

Alte piridin dehidrogenaze conin strns legai ioni metalici divaleni; alcool dehidrogenaza (conine Zn+2). Aproape toate dehidrogenazele piridin dependente au o comportare cinetic tipic pentru reacii cu dou substrate, n care exist o secven obligatorie pentru aezarea substratului i a coenzimei la centrul activ. Nucleotidul piridinic este substratul coordonator
66

i trebuie s se aeze primul pe centrul activ dup care se leag i substratul. Dup transferul echivalenilor reductori de la substrat la coenzim (transferul are loc pe centrul activ al enzimei) substratul oxidat se desprinde primul urmat de coenzima redus. Datorit acestei secvene obligatorii de interaciune exist n mod normal dou complexe binare, E-NAD+ i ENADH, i dou complexe ternare care particip n ciclul catalitic. XVI.1.2. Hidrogenaze legate de flavin (flavin dependente) i oxidaze Aceste enzime conin strns legate ca i grupri prostetice, fie flavin mononucleotidul (FMN), fie flavin adenin dinucleotidul (FAD). Partea activ a FMN i FAD, care particip la reacii de oxidoreducere, este ciclul aloxazinei din partea riboflavinei, care este redus reversibil. n aceast reacie are loc transferul direct a unei perechi de atomi de hidrogen de la substrat pentru a genera formele reduse ale FMN i FAD notate cu FMNH2 i FADH2. SH2 + E-FMN SH2 + E-FAD
O H3C H3C N N CH2 H-C-OH H-C-OH H-C-OH OCH2-O-P-OO
FMN FAD

S + E-FMNH2 S + E-FADH2
O N N CH2 H-C-OH H-C-OH H-C-OH OO OO OH OH N N N N

NH N O

H3C H3C

NH O NH2 N

CH2-O-P-O-P-O-CH2 O

67

O H3C H3C N N R
forma oxidat

NH N O

H3C H3C

H N N R

O NH N H O

forma redus

Cele mai importante dehidrogenaze flavin dependente se gsesc n curentul principal al respiraiei i a transportului de electroni, toate localizate n mitocondrii: 1) NADH-dehidrogenaza, care conine FMN i catalizeaz transferul de electronilor de la NADH la urmtorul membru al lanului transportor de electroni; 2) succinat dehidrogenaza, activ n ciclul acidului tricarboxilic; 3) dehidrolipoil dehidrogenaza, un component al sistemului piruvat i -cetoglutarat dehidrogenazelor; 4) acil-CoA dehidrogenaza, care catalizeaz prima etap de dehidrogenri din oxidarea acizilor grai. Exist nc multe alte enzime care conin flavina i care catalizeaz alte oxido-reduceri n afar de cele din fluxul principal al transportului de electroni, ca de exemplu, D-aminoacid oxidaza, xantin oxidaza, orotat oxidaza i aldehid oxidaza. Dehidrogenazele flavin dependente difer semnificativ de cele piridin dependente prin aceea c flavin nucleotidul este strns legat de molecula enzimei i astfel funcioneaz, mai de grab, ca i grupare prostetic dect ca o coenzim, flavin nucleotidul nu prsete enzima n timpul sau dup efectuarea ciclului catalitic. n cele mai multe flavin dehidrogenaze, incluznd NADH dehidrogenaza, flavin nucleotidul este legat necovalent, constantele de disociere sunt n domeniul 10-8 - 10-11 M. Astfel de flavin enzime pot fi disociate dac sunt supuse aciunii electroliilor tari sau la pH cobort. n alte flavinenzime, ns, cum ar fi succinat dehidrogenaza, flavin nucleotidul este legat covalent printr-o legtur ntre ciclul izoaloxazinic al FAD i un rest imidazolic al proteinei.

68

O H3C H2C N N CH2 -OC-CH-NHEnzimele de oxidoreducere flavin dependente pot fi plasate n dou clase, i anume, dehidrogenaze i oxidaze, n funcie de capacitate lor de a reaciona cu acceptorii de electroni. La flavindehidrogenazele de tipul NADH dehidrogenazei i succinil dehidrogenazei exist o tendin foarte slab sau deloc, a reoxidrii formei reduse a flavinnucleotidului de ctre oxigenul molecular. Spre deosebire de acestea flavinoxidazele reduse sunt reoxidate de oxigenul molecular cu formare de ap oxigenat. Unele flavoproteine conin, pe lng flavinnucleotid, i metale n special fier i molibden. Flavoproteinele cu fier conin, de asemenea, atomi de sulf reactivi. Cnd flavoproteinele cu fier i sulf sunt tratate cu acizi, se degaj hidrogen sulfurat. Deoarece nu exist hem n aceste proteine, fierul este numit fier nehemic. Atomii de fier din aceste flavoproteine sufer tranziia Fe(II) - Fe(III) i par s participe la transferul de electroni ctre i de la gruparea prostetic flavinic. XVI.1.3. Proteine cu fier - sulf. Proteinele cu fier-sulf conin n molecula lor fier i sulf liberabil cu acizi, n cantiti echimoleculare. Prima protein cu fier-sulf descoperit a fost ferodoxina, identificat ntr-o bacterie anaerob Clostridium pasteurianum capabil de a fixa azotul atmosferic. Masa molecular a proteinei fier-sulf este n domeniul 6000 - 100000 sau mai mare. N N R N NH O

XVI.1..4. Citocromi
69

Citocromii sunt proteine transportoare de electroni care conin grupri porfirinice cu fier, fiind prezeni numai n celulele aerobe. Unii sunt localizai numai n membrana mitocondrial intern, unde acioneaz secvenial pentru a transporta electonii provenii de la diferite sisteme ale dehidrogenazelor pn la oxigenul molecular. Ali citocromi se afl n reticolul endoplasmatic, unde joac un rol important n reaciile de hidroxilare specializate. Toi citocromii sufer tranziii reversibile de valen Fe(II) - Fe(III) n timpul ciclului lor catalitic. Formele reduse nu pot fi oxidate de oxigenul molecular, cu excepia citocromului terminal al respiraiei mirocondriale i anume citocromul a3 sau citocrom c oxidaza, care conine, de asemenea, cupru strns legat. n mitocondriile animalelor superioare, unde lanul respirator a fost cel mai bine studiat, cel puin cinci citocromi diferii au fost identificai n membrana intern: citocromii b, c1, c, a i a3. Cel puin unul dintre acetia, citocromul b, se gsete n dou sau mai multe forme. n plus fa de citocromii gsii numai n membrana intern mitocondrial, un alt tip, citocromul b5, se gsete n n reticulul endoplasmatic.
2 3

H H

porfirina

Inelul porfirinic nu este prezent numai n diferite proteine cu hem, ci i n clorofila plantelor verzi. Porfirinele pot fi considerate ca i derivai tetrapirolici.

70

CH=CH2

CH3

H3C

H H

CH=CH2

H3C

CH3

CH2 CH2 COOH

CH2 CH2 COOH

protoporfirina IX

Porfirinele sunt denumite i clasificate pe baza substituienilor lanului lateral, de exemplu, etioporfirin, mezoporfirin, uroporfirin, coproporfirin i protoporfirin. Dintre acestea protoporfirinele sunt cele mai abundente. Protoporfirina conine patru grupri metil, dou grupri vinil i dou grupri de acid propionic. Se pot scrie 11 izomeri diferii ai protoporfirinei prin poziiile ocupate de substituienii de mai sus. Dintre toate, numai una singur se gsete n natur i anume protoporfirina IX. Aceast structur se afl n hemoglobin, mioglobin i n mai muli dintre citocromi. Protoporfirina formeaz compleci chelai quadridentai cu ionii de fier, magneziu, zinc, nichel, cobalt i cupru, n care metalul este legat prin patru legturi coordinative. Un astfel de complex chelat al protoporfirinei cu Fe(II) se numete protohem sau simplu hem; un complex similar cu Fe(III) se numete hemin. n hem cei patru liganzi ai porfirinei formeaz un complex plan-patratic cu fierul. Poziiile de coordinare 5 i 6 ale fierului sunt perpendiculare pe planul porfirinei. Cnd poziiile de cordinare 5 i 6 sunt ocupate, structura care rezult este un hemocrom sau hemocromogen. n mioglobin sau hemoglobin poziia a 5-a este ocupat de gruparea imidazolic a unui rest de histidin, iar poziia a 6-a este fie neocupat (dezoxihemoglobin, dezoximioglobin), fie ocupat cu oxigen (oxihemoglobin, oximioglobin) sau cu ali liganzi, de exemplu, monoxidul de carbon.
71

X N Fe N N X (sau Y) n funcionarea normal a hemoglobinei i a mioglobinei, atomul de fier nu sufer modificri ale valenei n timp ce oxigenul este prins i desprins, el rmne Fe(II). Att hemoglobina ct i mioglobina pot fi oxidate la Fe(III) de ctre agenii oxidani cum ar fi fericianura de potasiu, cu schimbarea culorii de la rou la brun. Produii respectivi care nu funcioneaz ca i transportori de oxigen se numesc methemoglobine. La citocromi, atomul de fier sufer transformri reversibile Fe(II) - Fe(III); citocromii servesc la transport de electroni, iar hemoglobina acioneaz ca transportor de liganzi (oxigen). Citocromii cu o singur excepie, sunt foarte strns legai de membrana mitocondrial i deci sunt dificil de obinui n stare solubil i purificat pn la omogenitate. Citocromii c se extrag uor cu soluii saline. Citocromul c din multe specii a fost obinut n stare cristalizat i i s-a determinat secvena de aminoacizi. Gruparea protoporfirinic cu fier a citocromului c este legat covalent de protein prin puni de tioesteri ntre inelul porfirinic i dou resturi de cistein de pe lanul polipeptidic. n hemoglobin i mioglobin ca i n citocromii b inelul porfirinic este legat necovalent i poate fi izolat prin extracie din proteina acidulat cu piridin sau cu ali solveni. Citocromii a i a5, denumii mpreun citocrom c oxidaz, enzim respiratorie, sau ferocitocromul c oxigen oxidoreductaza, merit o atenie deosebit. n loc de protohem, aceti citocromi conin hem A, care difer de protohem prin aceea c n loc de gruparea metil din poziia 8 are grupare formil i n poziia 2 o caten hidrofob izoprenic cu 17 atomi de carbon n locul grupei vinil. N

72

HO CH3

H3C

N Fe N

CH=CH2

H3C CH2 CH2 COOH

CH3

CH2 CH2 COOH

Hemul A (gruparea prostetica a citocromului aa3)

XVI.1.5. Ubiquinona (Coenzima Q) Pe lng proteinele care particip la transferul de electroni, descrise mai sus, o coenzim liposolubil, numit ubiquinon sau coenzim Q, particip, de asemenea, la transportul electronilor de la substrate organice la oxigen n lanul respirator a mitocondriei. Aceast coenzim, este o chinon reductibil n mod reversibil, are o caten lateral lung, izoprenoid. Se cunosc mai multe ubiquinone care difer ntre ele prin lungimea catenei izoprenoide (ntre 6 i 10 uniti).

73

O H3CO H3CO O CH3 (CH2-CH=C-CH2)nH CH3

+2e- +2H+ -2e -2H
+

OH H3CO H3CO OH CH3 (CH2-CH=C-CH2)nH CH3

XVI.2. TRANSPORTUL DE ELECTRONI, LANUL RESPIRATOR O. Warburg descoper c anionul CN- chiar n cantiti extrem de mici inhib aproape total consumul de oxigen al celulelor i esuturilor, deoarece CN- nu inhib dehidrogenazele, ns formeaz compleci foarte stabili cu fierul (un exemplu este fericianura). Warburg a postulat c oxidarea biologic necesit prezena unei enzime cu fier (enzima respiratorie) i dup opinia sa activarea oxigenului de ctre aceast enzim reprezint mecanismul de baz implicat n oxidarea biologic. Pe de alt parte H. Wieland a postulat c activarea atomilor de hidrogen este procesul de baz implicat n oxidarea biologic i c nu este nevoie ca oxigenul molecular s fie activat pentru a reaciona cu hidrogenii activai de dehidrogenaze. Vederile opuse ale lui Wieland i Warburg i anume activarea oxigenului fa de activarea hidrogenului, au fost, mai trziu, unificate de A. Szentgyrgyi, care a postulat c ambele procese au loc i c flavoproteinele joac un rol intermediar n transportul de electroni ntre dehidrogenaze i enzima respiratorie. Secvena de reacii ale transferului de electroni din lanul respirator de la NAD la oxigen este bine cunoscut. Electronii sunt trecui prin lanul respirator prin intermediul flavoproteinelor (NADH-dehidrogenaz), NADH este forma sub care electronii sunt colectai de la diferitele substrate, cu ajutorul dehidrogenazelor NAD-dependente. Pe de alt parte, alte substrate ale respiraiei sunt dehidrogenate de dehidrogenazele flavin-dependente, cum sunt succinat dehidrogenaza i Ac-CoA dehidrogenaza, care vars electronii n lan prin intermediul ubiquinonei. Astfel, NAD+ i ubiquinona servesc la colectarea echivalenilor reductori de la substrate ale respiraiei, oxidate de dehidrogenaze priridin, respectiv flavin dependente, ilustrnd, nc o dat, principiul convergenei n cile metabolice.

74

Existena secvenelor de reacie de la NAD la oxigen prezentat mai jos este sprijinit de mai multe dovezi experimentale.
alfa-Cetoglutarat Piruvat Succinat Malat FP5 FP6 Izocitrat NAD ATP FP2
locul I locul II

NADH + H+ + FMN FMNH2 + 2Fe.S(III) 2Fe.S(II) + 2H+ + Q QH2 + 2citocrom b(III) 2citocrom b(II) + 2citocrom c(III) 2citocrom c(II) + 2citocrom a(III) 2citocrom a(II) + 2citocrom a3(III) 2citocrom a3(II) + 1/2O2 + 2H+

NAD+ + FMNH2 FMN + 2Fe.S(II) + 2H+ 2Fe.S(III) + QH2 Q + 2H+ + 2citocrom b(II) 2citocrom b(III) + 2citocrom c(II) 2citocrom c(III) + 2citocrom a(II) 2citocrom a(III) + 2citocrom a3(II) 2citocrom a3(III) + H2O

FP1(4Fe.S)

(2Fe.S)

ATP cyt b(Fe.s)cyt c1

Rotenona Amital

Antimicina A

FP3 Glutamat 3-Hidroxiacil-CoA Acid gras- CoA Glicerofosfat

FP4

cyt c

cyt aa3

locul III

ATP

n primul rnd este n concordan cu valorile potenialelor standard de oxidoreducere ale diferiilor transportori de electroni, care devin mai pozitive pe msur ce electronii de la substrat la oxigen. n al doilea rnd experiena reconstruirii n vitro cu transportori de electroni izolai din celul au artat c NADH poate reduce NADH-dehidrogenaza, dar nu poate reduce direct citocromul c, ci necesit prezena ubiquinonei i citocromilor b i c1 i o protein fier-sulf, ct i un complex de NADH-dehidrogenaz i una sau mai multe proteine cu fier-sulf. XVI.3. ENERGETICA TRANSPORTULUI DE ELECTRONI Modificarea energiei libere standard are loc atunci cnd dou perechi conjugate redox, cu potenial de oxidoreducere cunoscute reacioneaz ntre ele este dat de ecuaia:
G o = nFE 'o
75
=

unde n este numrul de electroni transferai, F este numrul lui Faraday (23062 cal/V) i Eo este potenialul cuplului donor-acceptor de electroni. Aceast ecuaie ne permite calcularea schimbrii de energie liber standard care are loc atunci cnd o pereche de echivaleni reductori este transferat de la NADH (Eo = -0,32 V) la oxigenul molecular (Eo = +0,82 V), adic dealungul ntregului lan respirator: Go = -2,23062[0,82 - (-0,32)] = -52700 cal/mol = -52,7 kcal/mol Acest calcul termodinamic, evident, este independent de calea urmat de electroni i nu necesit cunoaterea moleculelor transportoare i nici mecanismul de transport. Pentru sinteza unui mol de ATP, la pH 7,0 din ADP i fosfat avem:
Pa + ADP ATP + H 2O

Go = +7,3 kcal/mol Scderea energiei libere n timpul trecerii unei perechi de electroni de la NADH la oxigen molecular este suficient pentru a permite sinteza nu numai a uneia ci a mai multor molecule de ATP din ADP. Se tie astzi c trei molecule de ATP sunt generate n timpul trecerii unei perechi de electroni dealungul lanului respirator de la NADH la oxigen molecular, proces numit fosforilare oxidativ sau lan respirator. XVI.4. TRANSHIDROGENAZE, PIRIDIN-NUCLEOTIDE esutul animal i microorganismele conin enzime care catalizeaz reacia: NADPH + NAD+ NADP+ + NADH

Aceast reacie permite utilizarea echivalenilor reductori ai NADPH de ctre lanul respirator, care, n mod normal, accept electroni de la NADH ca donor apropiat. Prin reacia invers se permite reducerea NADP+ n scopuri biosintetice. Astfel de enzime se numesc piridin-nucleotid sau NAD(P)+ transhidrogenaze. n esuturile animale NAD(P)+ transhidrogenaza este localizat n membrana mitocondrial, de unde se poate extrage cu detergeni. Sensul reaciei de transhidrogenare n mitocondria intact depinde de energia
76

produs de transportul de electroni i de prezena ATP. Viteza de reacie de la NADPH la NAD+ este de obicei mai mare dect viteza n sens invers. Dei mecanismul acestui efect este neclar, NADPH generat n acest fel joac un rol important ca reductor n reaciile biosintetice. XVI.5. UTILIZAREA OXIGENULUI DE CTRE OXIGENAZE Dei cea mai mare parte a oxigenului molecular consumat de celulele aerobe este redus cu formare de ap, pe seama electronilor care circul pe lanul respirator mitocondrial, mici cantiti de oxigen sunt folosite n reacii enzimatice n care unul sau ambii atomi de oxigen sunt direct introdui pe substrate organice cu formare de grupe hidroxil. Enzimele care catalizeaz astfel de reacii se numesc oxigenaze i sunt incluse n dou clase. Dioxigenazele catalizeaz introducerea a amblor atomi de oxigen pe diferite substrate, n timp ce monoxigenazele introduc numai un hidroxil. XV.5.1. Dioxigenaze Dioxigenazele numite i oxigen-transferaze, catalizeaz reacii de tipul: AH2 + O2 A(OH)2

n care, AH2 este molecula de substrat, iar A(OH) 2 este forma sa hidrolizat, de obicei, cele dou grupe hidroxil introduse sunt fie adiacente fie vicinale. n astfel de reacii, produsul A(OH)2 este adesea ori instabil i are loc ruperea legturii C - C ntre grupele hidroxil vicinale. Toate enzimele par s conin fier, cteva conin i cupru. Un exemplu important este triptofan-2,3dioxigenaza, unic prin faptul c fierul este legat sub form de hem. Enzima catalizeaz o etap din degradarea oxidativ a triptofanului. O2 CH2-CH-COOH N H
triptofan

CO-CH2-CH-COOH NH-CHO NH2

N-formilkinurenin

NH2

XVI.5.2. Monoxigenaze.
77

Monoxigenazele sau hidroxilazele, catalizeaz introducerea unui singur atom de oxigen pe un substrat organic, cellalt atom de oxigen este redus la ap. Monoxigenazele necesit un al doilea substrat care s cedeze electroni pentru reducerea celui de al doilea atom de oxigen. Ecuaia general a reaciei este: AH + XH2 + O2 AOH + HOH + X

n care AH este substratul ce va fi hidroxilat, XH 2 este donor de electroni, AOH este substratul hidroxilat, iar X donorul de electroni oxidat. Cele mai simple monoxigenaze, acelea din bacterii, sunt flavoproteinele care conin FAD i catalizeaz secvena de reacii: NAD(P)H + E-FAD E-FADH2 + AH + O2 NAD(P)+ + E-FADH2 E-FAD + AOH + HOH

unde E reprezint oxigenaza. O reacie ceva mai complicat, catalizat de monoxigenaz, este aceea catalizat de enzima hepatic, fenilalamin hidroxilaz sau cu numele nou fenilalanin-4-monoxigenaz. n aceast reacie ultimul donor de electroni necesar pentru a reduce atomul de oxigen la ap este NADPH, dar echivalenii reductori sunt transferai intermediarului tetrahidrobiopterinei, o coenzim a crei structur seamn cu a acidului tetrahidrofolic. XVI.6. TRANSPORTUL DE ELECTRONI MICROZOMAL Multe reacii de hidroxilare din esutul animal sunt catalizate de sisteme enzimatice mai complexe dect mono i dioxigenazele descrise mai sus. Reticulul endoplasmatic, fraciunea microzomal, conine, legat de el, sisteme de transport de electroni nefosforilante, care particip nu numai la hidroxilri, dar i n reacii de desaturare. Unul din sistemele microzomale de transport ale electronilor n ficat este format dintr-o flavoprotein numit NADPH-citocrom P450 reductaz i un citocrom specializat, citocrom P450, adesea numit simplu P450, n unele organisme particip, de asemenea, o protein cu fier i sulf. Microzomii hepatici catalizeaz hidroxilarea multor tipuri de substrate printre care steroizii, acizii grai, squalenul i anumii aminoacizi. Tot n fraciunea microzomal sunt hidroxilate o serie de medicamente, ca de
78

exemplu, fenobarbitalul, morfina, codeina, amfetamina i hidrocarburile cancerigene. Flavoproteina i P450 sunt inductibile, concentraiile lor crete mult n ficatul animalelor tratate cu barbiturice sau cu alte medicamente. Microzomii hepatici au i al doilea tip de lan nefosforilant transportor de electroni, care include flavoproteinele citocrom b5 reductaza i citocrom b5, un citocron gsit n reticulul endoplasmatic dar nu i n membrana mitocondrial intern. Aceste dou proteine au fost purificate i studiate n amnunt. Acest tip de lan transportor de electroni microzomal este foarte activ n desaturarea acizilor grai. XVI.7. SUPEROXID DISMUTAZA I CATALAZA n timpul transportului de electroni spre oxigenul molecular pe calea lanului mitocondrial, ca i n diferite reacii de oxidare i hidroxilare, se pot forma produi toxici rezultai prin reducerea parial a oxigenului. Cei mai importani produi toxici sunt anionul superoxid O22- i peroxidul de hidrogen, care sunt extrem de reactivi i capabili de a distruge activitatea biologic a unor macromolecule. Cercetrile lui I. Fridovich au pus n eviden, n celulele aerobe, o enzim, superoxid dismutaze, care catalizeaz reacia: 2O2-2 + 2H+ H2O2 + O2

Superoxid dismutaza se gsete n dou forme, una n citoplasma extramitocondrial i alta n mitocondrie. Superoxid dismutaza mitocondrial a celulelor eucariote este asemntoare superoxid dismutazei din multe bacterii att n ce privete coninutul de Mn2+ ct i n secvena aminoacizilor. Forma de superoxid dismutaz din poriunea lichid a citoplasmei are o structur diferit i conine Cu2+ i Zn2+. Aceste enzime se gsesc n cantitate mare i sunt foarte active, ceea ce sugereaz c radicalul superoxid este produs n mod continu n timpul reducerii enzimatice a oxigenului de ctre diferite enzime i sisteme enzimatice i de aceea este necesar ndeprtarea lui rapid. Peroxidul de hidrogen format de superoxid dismutaz i de oxidazele flavin dependente este descompus de ctre o hemoprotein numit catalaz, n reacia: H2O2 H2O + 1/2O2

79

Catalaza se gsete n microcorpusculii celulelor animale, care se denumesc i peroxizomi. Aciunea protectoare a superoxid dismutazei i catalazei este completat de acidul ascorbic, glutationul redus, vitamina E, care accept uor electroni i sunt un mijloc eficient pentru eliminarea radicalilor liberi. XVI.8. FOSFORILAREA OXIDATIV Vom examina procesul de cuplare a energiei n lanul respirator, avnd ca rezultat formarea de ATP din ADP i fosfat anorganic pe socoteala energiei produs prin transportul electronilor la oxigen. XVI.8.1. Cuplarea fosforilrii oxidative cu transportul de electroni Transportul de electroni de la NADH la oxigen este sursa direct a energiei folosite pentru fosforilarea cuplat a ADP. NADH pur a fost incubat n condiii aerobe cu mitocondrii tratate cu ap, fosfat i ADP, n absena intermediarilor din ciclul acidului tricarboxilic sau a altor metabolii organici. NADH a fost rapid oxidat la NAD+ pe seama oxigenului molecular, n acelai timp s-au format molecule de ATP pe seama consumului de ADP i fosfat. n lanul transportor de electroni de la NADH la oxigen, n trei puncte, energia este transformat n legturi macroergice. Din acest motiv, fosforilarea oxidativ ar putea fi denumit fosforilarea lanului respirator. Ecuaia global pentru fosforilarea lanului respirator poate fi scris: NADH + H+ + 3ADP + 3Pa + 1/2O2 NAD+ + 4 H2O + 3ATP

Aceast ecuaie poate fi separat ntr-un component exoterm: NADH + H+ + 1/2O2 NAD+ + H2O

Go = -52,7 kcal/mol i un component endoterm: 3ADP + 3Pa 3ATP + 3H2O

Fosforilarea cuplat a trei molecule de ATP conserv, astfel, 21,9/52,7x100, sau 42% din scderea enrgiei libere totale n impul tranferului unei perechi de electroni.
80

n diagram se vede c exist trei locuri n lan, n care se produc scderi relativ mari a energiei libere, fiecare suficient pentru a pune la dispoziie energie pentru formarea ATP din ADP i fosfat. Acestea sunt denumite locul I (poriunea ntre NADH i coenzima Q), locul II (poriunea ntre citocromul b i citocromul c) i locul III (poriunea dintre citocromul a i oxigen). Astfel, lanul respirator poate fi privit ca un dispozitiv pentru desfacerea n poriuni mai mici a masei de scderi de energie liber.
ADP + Pa NADH Fe.S FMN ADP + Pa b c1 ATP + H2O

Fe.S ATP + H2O c

Q ADP + Pa ATP + H2O

a3

O2

XVI.8.2. Bilanul energetic al oxidrii glucozei

81

Din datele pe care le-am parcurs se vede c pentru fiecare molecul oxidat de piruvat se formeaz 12 molecule de ATP, n cele patru etape n care particip i NAD, de exemplu, oxidarea piruvatului, izocitratului, cetoglutaratului i malatului, 2 molecule de ATP sunt formate n timpul oxidrii succinatului (oxidare catalizat de flavin) i 1 molecul de ATP se formeaz prin fosforilarea la nivel de substrat pe socoteala succinil-CoA pentru a da n total 15 ATP formai pe molecula de piruvat oxidat. Deci oxidarea complet a piruvatului rspunde la ecuaia: Piruvat + 2O2 + 15Pa + 15ADP 3CO2 + 15ATP + 17H2O

Se poate scrie acum un set de reacie pentru oxidarea aerob a glucozei la dioxid de carbon i ap i conservarea energie libere sub form de adenozintrifosfat. Pentru secvena glicolitic pn la piruvat avem ecuaia:
Glucoza + 2Pa + 2ADP + 2NAD+ 2 piruvat + 2NADH + 2H+ + 2ATP + 2H2O

iar pentru ciclul acidului tricarboxilic: 2Piruvat + 5O2 + 30ADP + 30Pa 6CO2 + 30ATP + 34H2O

La aceasta se adaug ecuaia pentru oxidarea a 2 molecule de NADH extramitocondrial formate n timpul conversiei glucozei n piruvat. Oxidarea extramitocondrial a glucozei mai poate genera 2 sau 3 molecule de ATP pentru o pereche de electroni, depinznd de modul n care NADH intr n mitocondrie. Dac presupunem c dou molecule de ATP sunt generate de acest proces, avem: 2NADH + 2H+ + O2 + 4Pa + 4ADP Suma ecuaiilor va fi: Glucoz + 6O2 + 36Pa + 36ADP Componenta exoterm: Glucoza + 6O2
82

2NAD+ + 4ATP + 6H2O

6CO2 + 6H2O + 36ATP

6CO2 + 6H2O

Go = -686 kcal/mol Componenta endoterm: 36Pa + 36ADP 36ATP + 36H2O

Go = -263 kcal/mol Eficiena global a recuperrii energiei n cursul oxidrii complete a glucozei este astfel 263/686x100 = 38% n condiii standard. n condiii intracelulare eficiena este mult mai mare. XVI.8.3. Decuplarea i inhibiia fosforilrii oxidative Mecanismul la nivel molecular al fosforilrii oxidative a fos problema care a inut treaz atenia cercettorilor. Fosforilarea oxidativ este influenat de o serie de ageni chimici.

XVI.8.3.1. AGENI DE DECUPLARE Agenii de decuplare permit transportul electronilor, dar blocheaz fosforilarea ADP la ATP, adic decupleaz reaciile de producere de energie de acelea care conserv energia. Caracteristica lor este aceea de a stimula viteza de absorbie a oxigenului de ctre mitocondria intact n absena ADP. n plus, ei stimuleaz foarte mult activitatea de hidroliz a ATP n mitocondrie; n absena agenilor decuplani, mitocondria are foarte puin activitate ATP-azic. Primul agent de decuplare, 2,4-dinitro-fenolul, a fost descoperit de W. F. Loomis i F. Lipmann n 1948. Astzi se cunosc foarte muli ageni decuplani. Cei mai muli sunt substane solubile n lipide care conin o grupare acid i un nucleu aromatic. Aceti ageni nu decupleaz fosforilarea glicolitic i nu afecteaz alte reacii celulare n afara fosforilrilor oxidative. Agenii decuplani pot facilita trecerea ionilor H + prin membrana mitocondrial, care este impermeabil n mod normal. XVI.8.3.2. INHIBITORI
83

A doua clas de ageni, inhibitorii fosforilrii oxidative, difer de agenii decuplani; ei mpiedec att stimularea consumului de oxigen de ctre ADP, ct i fosfatilarea ADP la ATP. Aceti inhibitori, ns, nu inhib direct nici unul dintre transportorii de electroni al lanului respirator. n schimb, ei mpiedec mecanismul de formare a ATP, de a utiliza intermediarul macroergic sau starea generat de transportul de electroni. n consecin, transportul de electroni nu poate continua dac intermediarul macroergic nu este consumat. Antibioticul oligomicina este prototipul acestei clase de inhibitori din care mai fac parte rutamicina, aurovertina, trietiltina etc. XVI.8.3.3. AGENI IONOFORI A treia clas de ageni, ionoforii, produc descompunerea strii intermediare macroergice numai n prezena unui cation monovalent. Reprezentantul tipic al acestei clase este antibioticul valinomicina care necesit prezena ionului de potasiu pentru ai exercita efectul inhibitor. Ali ageni ai acestei clase sunt antibioticele negericina i nonantina. Prezena ionului de sodiu este cerut de aciunea gramicidinei.

84