PROCEDIMIENTO MUESTREO MICROBIOLGICO DE AIRE

DRA. MARA TERESA VALENZUELA BRAVO DIRECTORA INSTITUTO DE SALUD PBLICA DE CHILE

Fecha

Departamento de Salud Ocupacional

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Subdepto. Higiene y Seguridad Industrial

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JUSTIFICACIN

Los microorganismos presentes en el aire son un riesgo potencial de contaminacin de materias primas, productos semi terminados, de procesos, de pacientes, y personal que trabaja en reas que requieran calidad de aire controlado. 2.OBJETIVO

Describir el procedimiento de muestreo microbiolgico de aire en reas biolimpias, salas blancas, y/o de contaminacin controlada, utilizando el equipo MAS 100 NT

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CAMPO DE APLICACIN

Aplica para los muestreos microbiolgicos del aire con recuento de microorganismos aerbicos, y hongos o levaduras, en cabinas de seguridad biolgicas, reas biolimpias, salas blancas, y/o de contaminacin controlada. 4.TERMINOLOGA

Agar: El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparacin de medios de cultivo. Se lica completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 C. Con mnimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en l. Aire Limpio: es aqul libre de partculas sucias y de microorganismos. Existe una serie de tratamientos para obtener aire libre de contaminantes. - El aire de entrada atraviesa un prefiltro (retiene partculas grandes); luego pasa por un precipitador electrosttico (atraccin de partculas cargadas elctricamente); luego atraviesa un filtro HEPA (retiene microorganismos y partculas en suspensin en el aire de tamao superior a 0,3 micrones).

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El otro tratamiento es el sistema Kathabar (combustin de superficie) el cual limpia el aire de entrada por lavado con una solucin asptica y adems controla la humedad. El aire limpio y asptico se introduce al rea asptica y se mantiene bajo presin positiva.

rea Biolimpia: Se llama rea de contaminacin controlada o rea biolimpia o zona limpia a aquella rea o espacio delimitado en el cual la contaminacin ambiental, en trminos de partculas y de microorganismos, as como la carga microbiana en las superficies (murallas, cielos, pisos, equipos) y la carga microbiana sobre el personal (mscaras, gorros, delantales, cubre calzados, guantes) se encuentran dentro de los lmites especificados para ella. Colonia: Cuando una clula aislada e inmvil comienza a crecer sobre un substrato slido, el resultado del crecimiento al cabo del tiempo es una colonia. Corte de partculas (d50): es el dimetro de las partculas, donde el 50% de las partculas llegan al agar (es decir pueden formar una colonia). Est determinado por la velocidad de retencin y el tamao y forma del orificio. Estufa de Incubacin: Es un equipo utilizado en los laboratorios, para incubar los medios de cultivo en un ambiente de temperatura controlados. Utiliza una resistencia elctrica que genera calor al interior de una cmara a manera de un horno. La temperatura generada es controlada por un termostato. La temperatura a la que se realice este proceso condiciona crticamente la calidad del medio. Estufa con aire forzado con doble puerta, una de vidrio interna y otra externa, con termostato preciso y un sistema de circulacin interna del calor, son una buena alternativa. El equipo debe tener: -Selector de temperatura. Un termostato que mantenga la temperatura en el rango de 0-100 C, con una precisin de 1 C o mayor. -Termmetro preciso, preferentemente con indicador externo que permita controlar la temperatura interior del equipo sin abrirlo. Filtros de Alta Eficiencia: Estos filtros denominados HEPA y ULPA por sus iniciales en ingls (High Efficiency Particulate Air y Ultra Low Penetration Air), son los filtros mas eficientes conocidos por el hombre, retienen el 99.97 y el 99.999% respectivamente, de partculas tan pequeas como 0.3 micrones y fueron desarrollados por la Comisin Atmica de los EE.UU. durante la segunda guerra mundial, para remover el polvo radioactivo de los ductos de ventilacin de las plantas atmicas. Estos filtros se componen de fibras, compuestas por fibra de vidrio y con dimetros entre 0.2 y 0.5 micrones, entrelazadas de forma aleatoria y espaciadas entre s ms de 0.3 m. Los filtros HEPA y ULPA evitan la propagacin de bacterias y virus a travs del aire y, por tanto, son muy importantes para prevenir infecciones.

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ISO 14698:2003: Establece los principios y la metodologa bsica de un sistema formal de control de la contaminacin biolgica para evaluar y controlar biocontaminantes, cuando la tecnologa de salas blancas se aplica a tal efecto. En l se especifican los mtodos requeridos para vigilancia de las zonas de riesgo en una forma coherente y de aplicacin de las medidas de control adecuadas para el nivel de riesgo. En las zonas donde el riesgo es bajo, puede ser utilizado para obtener informacin. Medios de Cultivos: El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presin de oxgeno adecuada, as como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. Un nivel mnimo de humedad, tanto en el medio como en la atmsfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las clulas vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mnimas en las estufas de cultivo a 32,5 2,5C para el caso de aerobios y 22,5 2,5C para hongos y levaduras, con tiempos de incubacin de 48 y 72 horas respectivamente, proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar as que se deseque el medio. Unidad Formadora de Colonia (UFC): Se denomina a una clula bacteriana viva y aislada que si se encuentra en condiciones de substrato y ambientales adecuadas da lugar a la produccin de una colonia en un breve lapso de tiempo. En el caso de los hongos filamentosos que tienen un crecimiento trfico no se producen colonias aisladas sino formaciones ms difusas o miceliares. Velocidad de retencin: Es la velocidad de la partcula cuando llega al agar. Viene determinada por la velocidad del flujo, el nmero de orificios y el dimetro del orificio.

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PROCEDIMIENTO

El equipo MAS-100 NT es un instrumento de alto rendimiento que est basado en el principio de muestreador de aire Andersen, el cual aspira aire a travs de una placa perforada. El flujo de

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aire resultante es dirigido sobre una placa estndar de agar. Despus del ciclo de coleccin, la placa Petri es incubada y las unidades formadoras de colonias (UFC) son contadas. El MAS 100 NT opera con un dispositivo de succin de alto rendimiento y el volumen aspirado es continuamente monitoreado. El sistema mide el flujo de aire que ingresa y regula el volumen aspirado a un valor constante estndar de 100 litros por minuto. Este equipo regula automticamente el volumen de acuerdo a la presin y temperatura ambiental arrojando resultados comparables de forma constante. Para mediciones en rea biolimpias y/o de contaminacin controlada, el volumen de muestra recomendado de acuerdo a parmetros internacionales debe ser de 1000 litros.
Entrada de aire Placa Petri

Anemmetro Ventilador Salida de Aire

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Metodologa

5.1.1.- Materiales, Insumos y Equipos: Estufa de Cultivo: Marca JOUAN. N Inventario 01683. 32,5 2,5C. Ubicada en el Laboratorio Nacional de Control del Depto. Control Nacional. Estufa de Cultivo: Marca NAPCO. N Inventario 16148. 22,5 2,5C. Ubicada en el Laboratorio Nacional de Control del Depto. Control Nacional. Placas Petri estriles: estndares con un dimetro de 90 mm. Se pueden usar para determinar de forma activa los microbios en suspensin en el aire con el sistema MAS-100. Como estas placas tienen una triple cobertura y estn irradiadas con rayos gamma, ofrecen un alto grado de fiabilidad para usarse en aisladores y salas blancas, y se pueden almacenar en las instalaciones a temperatura ambiente. Vida til de hasta 9 meses.

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Agar Soya Tripticase: Medio de cultivo libre de inhibidores e indicadores, contiene digerido pacretico de caseina, digerido papanico de harina de soja, cloruro de sodio y agar. Incubacin : 2 das a 32,5 2,5 C Caractersticas del medio: medio deshidratado, fino, homogneo, libre de material extrao. Color beige claro. Almacenamiento: Medio deshidratado: a 10-35 C. Medio preparado: a 2-8 C. Agar Saboraud: Medio utilizado para el aislamiento, identificacin y conservacin de hongos patgenos y saprfitos. En el medio de cultivo, la pluripeptona y la glucosa, son los nutrientes para el desarrollo de microorganismos. El alto contenido de glucosa, la presencia de cloranfenicol y el pH cido, favorecen el crecimiento de hongos por sobre el de bacterias. Adems, al medio de cultivo, pueden agregarse otros agentes selectivos de crecimiento. Incubacin: 5 a 7 das, 22,5 2,5 C. Caractersticas del medio: Medio preparado: mbar claro, ligeramente opalescente sin ningn precipitado. Almacenamiento: Medio deshidratado: a 10-35 C. Medio preparado: a 2-8 C. Equipo muestreador microbiolgico de aire MAS 100 NT: Especificaciones Tcnicas: Velocidad de Flujo: 100 litros por minuto 2,5 % Volmenes de muestreo estndares: 50, 100, 250, 500, 1000 litros. Volmenes de muestreo elegidos libremente: 1 a 2000 litros. Cabezal de muestreo: Dimetro: 10,9 cm Peso: 190 gramos Material: aluminio anodizado Autoclavable: 15 minutos a 121 C MAS 100 NT: Altura: 26 cm

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Dimetro: 11 cm Peso: 2,38 Kg Maleta de transporte: Plstico Informacin Adicional: Tornillo del trpode: para uso con tornillo normal de cmara. Paquete de Bateras: Li-Ion Motor: 6 V Cargador de Bateras: 110-240 Volt, 1,5 A 50-60 Hz Tiempo de carga: tiempo total aproximado de 3,5 horas. Tiempo de Operacin: Total aproximado de 7 horas. Volumen total de aspiracin: aproximado de 42000 litros Pantalla: Grfica alfanumrica. Vida media de las bateras: aproximadamente 10 aos. Condiciones Ambientales: Altitud: Hasta 2000 m o superior. Temperatura: -20 C a 40 C Humedad Relativa Mxima: 80% para temperatura de hasta 31C, disminuyendo linealmente a 50% de humedad relativa a 40 C. Fuente de Voltaje Principal: Fluctuaciones no deben exceder 10% de voltaje nominal. Componentes Incluidos: Maleta de traslado Cargador de bateras y enchufes Cable de conexin USB de 1,5 m CD con PC-Software y Manual de Usuario, USB Driver y certificado en Excel para manual de ajuste y calibracinLlave de Allen Cuidados y Mantencin: Debe ser calibrado en forma peridica. La tapa perforada y la tapa cubre polvo son autoclavables a 121 C por 15 minutos. Asegurarse que los orificios de la tapa perforada no estn tapados. La suciedad puede ser removida del exterior del MAS-100 NT usando un pao humedecido con mezcla de alcohol/agua al 70% o una solucin isopropanol/agua. El exterior del equipo tambin puede ser limpiado con una solucin alcohol/agua. Evitar derramar lquido sobre las conexiones elctricas/electrnicas. La desinfeccin de las partes internas del equipo puede ser realizada en un gabinete de flujo laminar con una solucin de etanol al 70% o isopropanol. Dejar que el instrumento complete al menos 2 ciclos de 100 litros cada uno en el gabinete de flujo laminar. Al comienzo de cada ciclo, rociar con una solucin de etanol al 70% o isopropanol frente a la cabeza del muestreador con la tapa perforada instalada. Secar el equipo con una toalla estril y usar una bolsa plstica para guardar o transportar al rea de muestreo. No se recomienda el uso de gases para la desinfeccin del equipo.

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Certificado de Calibracin y Trazabilidad: Originalmente son calibrados con el anemmetro DA-100 NT en la SCS (Swiss Calibration Service), que es uno de los servicios autorizados por la EA Multilateral Agreement (Acuerdos Multilaterales) de reconocimiento de certificados de calibracin. Tapa perforada: de 300 * 0,6 mm orificios diseada para placas Petri estndares mejorando la velocidad de impactacin < 20 m/s, anodizada de color azul. Debe ser autoclavada a 121C * 15 minutos, para ser esterilizada en autoclave, antes de su uso.

5.1.2.- Desarrollo: Revisar la carga del equipo. La seal de la batera tiene 4 niveles. Si la seal de la batera est enteramente de color negro, significa completamente cargada. Cuando la carga de la batera disminuye, la seal de la batera se muestra transparente. Cuando la transparencia en la seal de la batera alcanza , la batera debera ser recargada, conectando el cargador a la corriente y al equipo. Asegurarse que el punto rojo del cargador se enfrente con el punto negro del brazo del equipo. Instalacin de la Placa de cultivo: Para el primer ciclo se utiliza el agar nutritivo y para el segundo el agar Saboraud, de la manera siguiente:

Girar la tapa, abrir, e instalar la placa Petri destapada. Tapar, y girar para fijar.

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Encendido del MAS-100 NT: Presionar ambas teclas a la vez ubicadas bajo la pantalla (START y MENU) durante 2 segundos, hasta que el LED azul (run) se encienda. El programa ya programado se iniciar.

run

Stop Programa del proceso de muestreo seleccionado: Se debe elegir el Modo Estndar (STD) presionando las teclas con las figuras si es necesario. En la parte superior aparece la fecha y la hora, y en el centro el Programa (Mode) que corresponde al estndar (STD) y el Volumen (Volume) a muestrear (1000 l). 00.00.2010 00:00 Mode: STD Volume: 1000 l START MENU
Estado de la carga

Enseguida se presiona START, y comienza el muestreo. Se puede observar el tiempo en la parte superior indicando el volumen de aire muestreado y el tiempo ocurrido. Measuring Volume: Time rem: State: Abort

Presionar si se desea detener el ciclo

Una vez terminado el ciclo de 10 minutos, retirar la placa Petri con medio de cultivo nutritivo, tapar, dar vueltas rotular y guardar para incubacin. El mismo procedimiento para la placa de cultivo con agar saboraud para hongos y levaduras. Apagado: Se debe presionar Menu, seleccione Shut Down y presionar select nuevamente, aparecer en la pantalla la consulta Shut down device?, presione ok y el instrumento se apagar. Si no hay modificaciones futuras en el instrumento y no se realiza otro muestreo, ste se apagar automticamente despus de 5 minutos. Posteriormente se procede a incubar las placas de cultivo en las estufas a las temperaturas correspondientes.

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5.2.-

Clculo de resultados:

El nmero total de microorganismos contados (U.F.C.), se modifica basado en la tabla de correccin estadstica de Feller`s, para convertirlas a partculas contaminantes por metro cbico. La Tabla de correccin (Anexo N 1) est basada en la posibilidad que varios microorganismos entren por el mismo orificio en la tapa perforada a medida que existan ms microorganismos en el ambiente a muestrear.

Pr = es el nmero esperado de partculas viables para producir r orificios positivos. N = es el nmero total de orificios de la placa (300) Una mejor alternativa de clculo es la siguiente:
N 0 .5 1

Pr N

N r 0 .5

dX N ln(( N 0 . 5 ) /( N r 0 . 5 ))

Donde: r es el nmero de colonias bacterianas en la placa del instrumento de muestreo. N es el total de orificios de la tapa, a travs de la cual se dispara el aire del rea que se muestrea, en direccin a la Petri con el medio de cultivo. Los nmeros de orificios suelen ser: 200, 300, 400. Ejemplo: N= 300 r= 150 colonias

Pr 300 * ln(( 300 0 . 5 ) /( 300 150 0 . 5 )) 207 . 4

La tabla de Feller da el valor: 207 lo cual es obviamente un resultado de redondeo de cifras pues, como las partculas bacterianas no constituyen una variable continua sino Poissoniana, es prcticamente imposible que salgan resultados enteros. 5.3.Control de Calidad

Se realiza a travs de la certificacin del equipo, y el control de temperatura de las estufas de incubacin (registros).

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REFERENCIAS Feller, Williams (1950) An introduction to probability theory and its applications third edition. Volume I .A Wiley International Edition. ISO 14698-1: reas Limpias y ambientes controlados asociados- Control de biocontaminantes. Parte 1: Principios y mtodos generales. ISO 14698-2: reas Limpias y ambientes controlados asociados- Control de biocontaminantes. Parte 2: Evaluacin e interpretacin de los datos de biocontaminacin. MBV AG. Microbiology and Bioanalytic. Manual de Usuario. MAS-100 NT Muestreador Microbiolgico de Aire. www.mbv.ch Microbiological Evaluation of Clean Rooms and other Controlled Environments. USP 29 (1116). Ministerio de Salud. Norma General Tcnica N 59. Manipulacin de Medicamentos Estriles en Farmacias de Hospitales. Chile. 2001. The Journal of American Medical Association. JAMA. Secondary Aerosolization of Viable Bacillus anthracis Spores in a Contaminated US Senate Office. Vol 288 N 22. Diciembre 11, 2002.

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PARTICIPANTES: MSc. Ing. Edith Rodrguez Alfaro

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ANEXOS:

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ANEXO N 1: Tabla de conversin de Feller para Tapa del orificio.

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ANEXO N 2: Vestimenta de Proteccin Personal: Considera Elementos de Proteccin Personal y Ropa de Trabajo, destinados a proteger al trabajador de riesgos laborales, utilizados con un enfoque preventivo y de adaptacin a los riesgos y a los factores personales de los/as trabajadores/as. Forman parte de las barreras primarias. Se requiere el uso de: Antiparras/Gafas: si se trabaja fuera de la Cabina de Seguridad Biolgica. Barbijos: si existe barba. Cubrepelo desechable (opcional, pues si se usa traje Tyvek, no requiere) Guantes de ltex: No deben utilizarse guantes delgados de cloruro de polivinilo (PVC), puesto que son permeables a ciertos preparados, ni tampoco guantes empolvados ya que atraen las partculas de citostticos. Cubrecalzado desechable. Mascarilla de alta eficiencia: La proteccin respiratoria personal (respiradores) es la ltima lnea de defensa para el personal de salud contra la infeccin nosocomial. Resistente a la humedad, protege contra partculas slidas y lquidas. De forma convexa, posee una lmina metlica de aluminio para ajuste nasal y elstico, o doble elstico para ajuste al rostro. Las conocidas mascarillas tipo "cirujano" no ofrecen proteccin alguna. La mscara, ya sea media mscara o mscara facial, puede resultar til en caso de muestreos de reas con contaminantes qumicos. Mascarilla con Filtro de Alta Eficiencia (HEPA) Mscara o Respirador segn agente de riesgo

Cubrecalzado

Traje Tipo Tyvek con Cubrecabello

Guantes ltex

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