Welcome to Scribd, the world's digital library. Read, publish, and share books and documents. See more
Download
Standard view
Full view
of .
Save to My Library
Look up keyword
Like this
500Activity
0 of .
Results for:
No results containing your search query
P. 1
Técnica de ELISA (Enzyme Linked Inmuno Sorbent Assay)

Técnica de ELISA (Enzyme Linked Inmuno Sorbent Assay)

Ratings:

2.46

(13)
|Views: 58,472 |Likes:
Published by José Manuel
FES Zaragoza, QFB Bioquímica Clínica, 2009-2, 2802, Inmunología Clínica, Técnica de ELISA (Enzyme Linked Inmuno Sorbent Assay).
http://ark461.wordpress.com
FES Zaragoza, QFB Bioquímica Clínica, 2009-2, 2802, Inmunología Clínica, Técnica de ELISA (Enzyme Linked Inmuno Sorbent Assay).
http://ark461.wordpress.com

More info:

Categories:Comics
Published by: José Manuel on May 27, 2009
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

05/17/2014

pdf

text

original

 
Técnica de ELISA (Enzyme Linked Inmuno Sorbent Assay)Mayo 20, 2009
1.
Elaboro
,
2
 
Reviso
,
1
Técnica de ELISA (Enzyme Linked InmunoSorbent Assay)
Universidad Nacional Autónoma de México.
 Facultad de Estudios Superiores ZaragozaLaboratorio de Inmunología L-121, Campus IPérez Pérez José Manuel
1
____________ Pérez Sevilla Alma Beatriz
2
____________ Equipo 3, Grupo 2802
 
Introducción:
 
La técnica de ELISA (Enzyme Linked InmunoSorbent Assay) es un procedimiento de ensayoinmunoenzimático. Se basa en la detección antígeno(Ag) o anticuerpo (Ac), inmovilizado sobre una fasesólida y mediante anticuerpos que directa oindirectamente producen una reacción, la pruebarecurre al empleo de inmunógenos, haptenos óanticuerpos marcados con una enzima cuyo productocolorido, puede ser medido espectrofotométricamente.Este principio tiene las propiedades de uninmunoensayo ideal: es versátil, robusto, simple en surealización, emplea reactivos económicos y consigue,mediante el uso de la fase sólida, de una separaciónfácil entre la fracción retenida y la fracción libre. Lasenzimas utilizadas se muestran en el cuadro 1.
Cuadro 1 Cromogenos utilizados para las enzimas fosfatasaalcalina y Peroxidasa y el color que se obtiene
Enzima Cromogeno ColorFosfatasaAlcalinap-nitrofenil fosfato (pNPP) amarillo5-bromo-4-cloro-3indolil fosfato/nitroazul de tetrazolium (BCIP/NBT)PurpuraNaftol AS-TR fosfato/fast red RC RojoPeroxidasa 2,2-azino-bis (3-etilbenziazoline-6acido sulfonicoverdeo-fenilamino (OPD) Naranja
3,3’5,5’
-tetrametilbencidina base odihidrocloruro (TMB)Azul
3,3’
-deaminobencidina (DAB) Marrón3-amino-9-etilcabazole (AEC) Rojo4-cloro-1-naftol (4C1N) Azul
Fases de realización de una ELISA
 
Sensibilización de la placa.
 
Bloqueo de espacios vacíos.
 
El Ag o el Ac se fija a una superficie.
 
Aplicación del espécimen de prueba.Controles positivo y negativo
 
Detección y caracterización por Ac. 2°marcado.
 
Incubación con la muestra.
 
Incubación con el sistema de detección.
 
Adición del sustrato.Los diferentes tipos de ELISA son los que seenumeran a continuación:Anticuerpos Marcados
 
ELISA Directo
 
ELISA Indirecto
 
ELISA Sandwich
o
 
Doble (DAS)
o
 
Heterologo (HADAS)Antígenos Marcados
 
ELISA CompetitivoELISA Directo.Consta de las siguientes etapas:
Fijación al soporte insoluble (“tapizado”) de antígenos
específicos. Lavado para eliminar los antígenosfijados deficientemente o no fijados. Adición de
anticuerpos marcados (“conjugados”) con una
enzima; si los anticuerpos reaccionan con losantígenos, el complejo quedará solubilizado. Lavado
 
Técnica de ELISA (Enzyme Linked Inmuno Sorbent Assay)Mayo 20, 2009
1.
Elaboro
,
2
 
Reviso
,
2para eliminar los anticuerpos marcados que no hayanreaccionado. Adición de un substrato sobre el que seacapaz de actuar la enzima marcadora. Se puede pararla reacción si se desea. Lectura visual o colorimétricadel producto final coloreado.ELISA Indirecto.Consta de las siguientes etapas:
Fijación al soporte insoluble de antígenos
específicos para los anticuerpos objeto de estudio.Lavado para eliminar los antígenos fijadosdeficientemente o no fijados. Adición del sueroproblema, de tal forma que sus anticuerposreaccionarán específicamente con los antígenosfijados al soporte. Lavado para eliminar losanticuerpos marcados que no hayan reaccionado.Adición de anti-anticuerpos conjugados con unaenzima, los cuales reaccionan con los anticuerposespecíficos añadidos en el paso anterior y que seencuentran fijados a los antígenos. Lavado paraeliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayanreaccionado. Adición de un substrato sobre el que seacapaz de actuar la enzima marcadora. Se puede pararla reacción si se desea. Lectura visual o colorimétricadel producto final coloreado.ELISA
Sándwich “DAS” (Double Antibody
Sandwich).Consta de las siguientes etapas:
Fijación al soporte insoluble de anticuerpos
específicos del agente patógeno a detectar. Lavadopara eliminar los anticuerpos fijadosdeficientemente o no fijados. Adición de la muestraproblema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma,etc.), de tal forma que si está presente el agentepatógeno de diagnóstico (antígeno), reaccionaráespecíficamente con los anticuerpos fijados al soporte.Lavado para eliminar los antígenos que no hayanreaccionado y los restos de la muestra no fijados.Adición de anticuerpos específicos del antígeno adetectar (deben tener un epítopo diferente de losanticuerpos con los que se han tapizado el soporte)conjugados con una enzima, los cuales reaccionan conlos antígenos añadidos con la muestra problema y quese encuentran fijados a los anticuerpos. Lavado paraeliminar los anticuerpos marcados que no hayanreaccionado. Adición de un substrato sobre el que seacapaz de actuar la enzima marcadora. Se puede pararla reacción si se desea. Lectura visual o colorimétricadel producto final coloreado.
ELISA Sándwich “HADAS”.
Consta de las siguientes etapas:
Fijación al soporte insoluble de anticuerpos
específicos del agente patógeno a detectar. Lavadopara eliminar los anticuerpos fijadosdeficientemente o no fijados. Adición de la muestraproblema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma,etc.), de tal forma que si está presente el agentepatógeno de diagnóstico (antígeno), reaccionaráespecíficamente con los anticuerpos fijados al soporte.Lavado para eliminar los antígenos que no hayanreaccionado y los restos de la muestra no fijados.Adición de anticuerpos específicos del antígeno adetectar (deben tener un epítopo diferente de losanticuerpos con los que se han tapizado el soporte),los cuales reaccionan con los antígenos añadidos conla muestra problema y que se encuentran fijados a losanticuerpos. Lavado para eliminar los anticuerpos queno hayan reaccionado. Adición de anticuerposconjugados con una enzima anti-anticuerposempleados en el paso anterior. Lavado para eliminarlos anti-anticuerpos marcados que no hayanreaccionado. Adición de un substrato sobre el que seacapaz de actuar la enzima marcadora. Se puede pararla reacción si se desea. Lectura visual o colorimétricadel producto final coloreado.ELISA Competitivo.Consta de las siguientes etapas:
Fijación al soporte insoluble de anticuerpos
específicos del agente patógeno a detectar. Lavadopara eliminar los anticuerpos fijadosdeficientemente o no fijados. Adición enconcentración conocida de una mezcla de antígenosdel anticuerpo utilizado en el paso anterior, marcadoscon una enzima y antígenos desconocidos objeto deestudio. Paralelamente, añadir únicamente antígenosdel anticuerpo usado en el paso anterior, marcadoscon una enzima. Lavar para eliminar los antígenos queno hayan reaccionado. Adición de un substrato sobreel que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Sepuede parar la reacción si se desea. Lectura visual ocolorimétrica del producto final coloreado de ambaspruebas y comparar los resultados. Si las lecturas de
 
Técnica de ELISA (Enzyme Linked Inmuno Sorbent Assay)Mayo 20, 2009
1.
Elaboro
,
2
 
Reviso
,
3ambas pruebas son análogas, el antígeno a estudiono tienen nada que ver con los anticuerposempleados para tapizar el soporte. Si haydiferencia en las lecturas de ambos pocillos, elantígeno objeto de estudio, está relacionadoserológicamente con el anticuerpo empleado paratapizar el soporte y la diferencia de densidad óptica,es proporcional a la concentración del antígenoproblema en la muestra.Todos los tipos de ELISAs descritos se puedenresumir en dos grandes grupos:
• ELISAs para detectar antígenos: ELISAs sándwich.• ELISAs para detectar anticuerpos: ELISAs
indirectos.La fase sólida debe ser de un tipo que permita un fácilmanejo (especialmente en los procesos de lavado) y lareproducibilidad de la unión de antígenos oanticuerpos sobre su superficie. Las microplacas de 96pocillos y un volumen de 350µL son especialmenteventajosas para procesar un elevado número demuestras y un vez tapizadas, el material inmovilizadopermanece reactivo mucho tiempo siempre que semantenga seco y a baja temperatura. Normalmente seutilizan microplacas de poliestireno de fondo planoque pueden adquirirse estériles y con o sin tapa. Lastécnicas de ELISA se realizan mediante la adiciónsecuencial de todos los reactivos necesarios separadospor etapas de lavado. Cada una de las operacionespuede realizarse manualmente con micropipetas o conequipamiento para la automatización de todas y cadauna de las etapas. Esta completa automatización se justifica por la necesidad de procesar y analizarun gran número de muestras y necesitar unaelevada repetibilidad de resultados.La enzima escogida como marcador debe unirsefácilmente a antígenos y anticuerpos, encontrarse enestado puro a un precio razonable y tener un substratocromogénico o fluorogénico conveniente y de fácilpreparación. Las enzimas más utilizadas son fosfatasalcalina, peroxidasa de rábano y ß-galactosidasa; acontinuación se muestra una tabla con las ventajas ydesventajas de cada una así como los substratos quese emplean con cada una de ellas.La búsqueda de la concentración óptima de usodepende ligeramente del tipo de ELISA empleado;para cualquier ELISA que utilice anti-anticuerposconjugados, se suele probar diferentes dilucionesdel conjugado (desde 1:100 hasta 1:2000) frente asucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadascon antígeno a concentración idóne a. Aquelladilución del conjugado que produzca menor reacción
inespecífica (menor color de fondo o “background”)
con muestras negativas e implique una claradistinción de las muestras positivas, será la óptima. Laelección de una concentración de conjugado óptimava completamente ligada a planteamientoseconómicos en los que se ha de procurar el mayor ahorro del conjugado aún a costa de aumentar el tapizado.La elección del substrato es de gran importancia parala estandarización del método ELISA y hay que tenervarios factores en cuenta, como son sensibilidad,especificidad, repetibilidad, facilidad de lectura ycomplejidad de preparación, así como estabilidaddespués de la parada de la reacción.Hoy en día existen muchas variaciones en cuanto a lossubstratos y, por lo tanto, el método de detección delos complejos antígeno-anticuerpo como los sistemasde detección colorimétricos, fluorescentes yluminiscentes. Este método ha tenido una enormeaplicación en todos aquellos campos en los que seprecisaba la cuantificación de productos medianteanticuerpos: diagnóstico clínico, detección viral,clasificación de anticuerpos en isotipos, búsqueda deanticuerpos monoclonales, etc.
Objetivo:
 
 
Cuantificar el contenido de antígeno(gammaglobulina humana) y la dilución delconjugado del Anticuerpo (anti-gammaglobulina) para ésta técnica.
 
Conocer el fundamento y las fases en larealización de la técnica de ELISA, y cuálesson las variantes de este método.

You're Reading a Free Preview

Download
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->