ANALISIS PROXIMAL.

METODO DE WEENDE

Generalidades Podra definirse el anlisis prximo como un esquema de anlisis qumico mediante el cual se determina la composicin de un alimento en trminos de sus principales grupos de nutrientes . En otras palabras, evala la calidad de un alimento en funcin de grupos de compuestos con caractersticas fsico-quimicas semejantes, pero con diferente valor nutritivo. Este mtodo ideado hace mas de 100 aos por HENNEBERG y STOHMANN en la estacin de Weende Alemania, con pequeas modificaciones se sigue utilizando. Este mtodo determina los siguientes componentes: a. b. c. d. e. Residuo seco (Materia Seca) Protena bruta (Nitrgeno Total) Ceniza bruta Grasa bruta (Extracto Etreo) Fibra bruta

Resultado de restar del total de la muestra los componentes descritos se obtiene el extracto libre de nitrgeno, que comprende fundamentalmente carbohidratos solubles. A pesar de las limitaciones que tiene el anlisis proximal ha sido por mas de un siglo el punto de partida en la evaluacin de un alimento y aunque los mtodos de anlisis hayan cambiado, el fundamento permanece intacto. El anlisis proximal consta de las siguientes determinaciones: humedad, protena cruda, materia mineral cenizas, grasa cruda o extracto etreo y por diferencia a cien, extracto libre de nitrgeno . En la aplicacin de los mtodos para el anlisis prximo debe tenerse cuidado en seguir el mtodo lo ms fielmente que se pueda a lo sugerido, ya que algunos de ellos, como la fibra cruda, son empricos y en cualquier cambio en la concentracin de los reactivos o en el tiempo de digestin va alterar los resultados. Un incremento en la temperatura de ignicin de la muestra para la determinacin de ceniza o material mineral (se sugiere 550 600 C) nos puede provocar volatilizacin de sale minerales y dar resultados errneos. MATERIA SECA Este mtodo sirve para determinar nicamente la cantidad de materia seca presente de una sustancia y no es una medida exacta del contenido de humedad puesto que en desecacin ocurren una serie de reacciones qumicas que ocasionan variaciones en esta determinacin. La determinacin exacta del contenido de agua es un problema para ciertos productos, que an no han sido solucionados.

Para la interpretacin clara de los resultados es necesario conocer la terminologa empleada en su obtencin, por ello se incluye en este manual lasa definiciones de ellas. BASE FRESCA (BF) = Resultados obtenidos de una muestra con su humedad original BASE PARCIALMENTE SECA (BPS) = Resultados obtenidos de una muestra, cuya humedad es menor al 15%, proceso ms usual en el laboratorio. BASE SECA (BS) = Resultados obtenidos de une muestra cuya humedad es cero, proceso que se hace por mtodos matemticos

Cualquiera que sea el mtodo empleado para presentar los resultados, est basado en un material que se llama MATERIA SECA, pero es necesario aclarar si este contiene o no agua, para lo cual se usa las siguientes denominaciones. MATERIA SECA PARCIAL (MSP) = Materia residual que contiene la muestra despus de la desecacin a menos de 75C hasta peso constante ( 48horas) . MATERIA SECA (MS) = Material residual que contiene la MSP despus de desecarse a 110C por tres horas.

Por lo anterior para calcular la materia seca real (MSR) de una determinada sustancia es necesario proceder de la siguiente manera: 1. Determinar el porcentaje de materia seca parcial de la muestra fresca 2. Determinar el porcentaje de materia seca de la muestra seca parcialmente 3. calcular el porcentaje de materia seca real de la muestra fresca, con la siguiente frmula % MATERIA SECA REAL (MSR) = % MSP x %MST 100 Hay que tener en cuenta que este procedimiento es necesario para expresar los resultados de las dems determinaciones (protena, gras, fibra, etc.) en cualquier base que desee, con las siguiente frmulas: 1. % en BS = % en BPS x 100 MS 2. % en BPS = % en BS x %MS 100 Ejemplo: El porcentaje de protena del raigrs en base parcialmente seca es de 20%, el porcentaje de humedad de la muestra es de 5%. Cul es el porcentaje de protena de dicha muestra en base seca? %MS de la muestra parcialmente seca = 100 5 = 95 %

% de protena del raigrs en base seca = 20 x 100 = 21.05 % 95 3. % en BF = % en BSP x % en MSR % en MST % MS en BF = MSR Ejemplo: Si la protena de la alfalfa verde en base parcialmente seca es del 22% y el contenido de materia seca en base fresca es del 25%. Cul es el porcentaje de protena en base fresca si la materia seca en parcialmente seca es del 95%? %MS de la muestra parcialmente seca = 100 5 = 95 % % de protena base fresca (BF) = 22% x 25 % = 5.79% 95% DETERMINACIN DE MATERIA SECA PARCIAL Este tipo de determinacin solo es necesario realizarlo en aquellas muestras que tengan un contenido superior al 15% de agua. Aquellas que contiene menos de esta cantidad pueden analizarse inmediatamente despus de que lleguen al laboratorio previa molienda del material. Al primer caso pertenecen sustancias como pastos frescos, heces y otros forrajes verdes que deben secarse parcialmente, antes de iniciar cualquier tipo de proceso en el laboratorio. Este proceso se conoce como MSP porque permite bajar la humedad a un contenido menor del 15%, osea que no se elimina totalmente el agua. Estas consideraciones dan lugar a clasificar las muestras en dos tipos: 1. Aquellas con un contenido de humedad inferior al 15%, que permiten ser procesadas inmediatamente llegan la laboratorio. 2. Las que necesitan secarse parcialmente por contener ms de 15% de humedad. OBTENCIN DE MSP EQUIPO Y MATERIALES: estufa con graduacin de temperatura (en lo posible con extractor de aire), molino de tejido vegetal con tamiz de 1mm de malla., frasco de vidrio con tapa o bolsa plstica, embudo para recoleccin de muestras.

PROCEDIMIENTO Corte la muestra (si es necesario) en trozos pequeos y coloque en unos 300 gramos en bolsas de papel previamente pesadas. Seque en la estufa a 60C (ver preparacin de las muestras) hasta obtener un peso constante de 48 horas, si es necesario prolongue el tiempo de desecacin. Saque de la estufa y deje equilibrar la muestra con la humedad ambiente durante 24 horas. Pese nuevamente y calcule el porcentaje de materia seca parcial, que lo obtiene del promedio de las 3 submuestras. Mezcle las submuestras y pselas por el molino con tamiz de 1mm de malla. Homogenice. De la mezcla extraiga unos 100 gramos aproximadamente y consrvelos en un frasco de vidrio bien tapado o en bolsas plsticas para los dems anlisis. CLCULOS % MSP = Peso de la muestra parcialmente seca x 100 Peso de la muestra fresca

DETERMINACIN DE HUMEDAD La medida de humedad es de gran importancia no solo para establecer su cantidad en una alimento, sino que es inversa al contenido de materia seca, adems de que influye en la calidad y estabilidad de ellos, constituye un elemento de trascendencia econmica. La gran variedad de mtodos a seguir para determinar el contenido de agua en una sustancia se basan principalmente en tres factores: presin, tiempo y temperatura y dependen de un tipo de alimento en cuestin. A continuacin se describen brevemente algunos sistemas utilizados para este tipo de determinacin: CALENTAMIENTO A 110C: es el mtodo ms simple, rpido y el ms usado en los laboratorios, sin embargo, no es el ms aconsejable pues a esta temperatura pueden perderse otros componentes o presentarse reacciones que alteran su composicin. VACIO PARCIAL Y BAJA TEMPERATURA: (25mm, 70 90 C)constituye el mtodo ms preciso para la mayora de alimentos, aunque no es un procedimiento que permite la medida exacta de la humedad, es mucho ms confiable que la anterior. DESTILACIN CON UN SOLVENTE (Xilol): las reacciones qumicas que se producen con los procedimientos anteriores se reducen ; sin embargo tiene sus dificultades como: lectura en el menisco, adherencia de gotas de agua; destilacin de otros componentes, evaporacin incompleta del agua, etc.

Adems de los descritos existen mtodos qumicos muy rpidos y eficientes que se realizan en laboratorios especializados, como lo son Mtodo de Karl Fischer, especial para sustancias con bajo contenido de agua. Conductividad elctrica especial para granos.. La asociacin europea para reproduccin animal (Van Es-Van-Der-Meer, 1980), sugiere que el contenido de agua de alimentos secos al aire se realice por secado por estufa a 103 1C durante 4 horas y que aquellas muestras ricas en azcares o grasas debern secarse al vaci a 80 2C durante 4 horas. En ambos casos podra ser necesario prolongar el tiempo de sedo por un rato ms para asegurar que el secada fue completo. SECADO EN ESTUFA EQUIPO Y MATERIALES: estufa con graduacin de temperatura (en lo posible con extractor de aire), campana para desecacin, cajas de petri. PROCEDIMIENTO Peso de 2 a 5 gramos de muestra. Seque en estufa durante tres horas a 110C, enfra en desecador y pese. Repita el calentamiento y enfriamiento hasta obtener diferencia de pesos menor de 5mg en dos pesajes sucesivos. Para muestras con menos del 15 % de humedad, tres horas es suficiente, haga este proceso con replica para verificar sus resultados. CLCULOS % MS = muestra seca x 100 muestra hmeda % HUMEDAD = 100 - % Materia Seca

DETERMINACIN DE CENIZA La ceniza se considera como el producto inorgnico obtenido po la incineracin de una sustancia. Esta determinacin nicamente sirve para conocer en formar aproximada el contenido mineral, mas no es un indicativo claro del valor o calidad mineral de ella. Este proceso encierra la posibilidad de un buen nmero de errores, por lo que debe hacerse en forma cuidadosa, las temperaturas inadecuadas(bajas), generalmente conllevan a que se formen carbonatos, carbonos, carbono de los cuales no pertenece a la fraccin inorgnica que se pretende determinar. Las temperaturas altas ( 700C) si bien obvian el error anterior, adems de que aceleran el proceso, permiten la volatilizacin de sales alcalinas (KCl, NaCl, etc.) que hacen parte de la fraccin en cuestin.

Otro error puede deberse a la contaminacin del alimento con elementos propios para animales, en estos casos debe realizarse un proceso adicional para diferenciar de la cenizas bruta, la ceniza pura. EQUIPO Y MATERIALES: horno de mufla con graduacin de temperatura, campana de desecacin, crisoles de vidrio y porcelana. PROCEDIMIENTO En un crisol previamente calentado al rojo, enfriado y tarado, coloque un gramo de muestra slida, si la muestra es lquida pese 25 gramos y evapore en bao de vapor hasta sequedad aparente. Incinere en la mufla a temperatura de 550C para obtener ceniza blanca y en casos excepcionales de color gris claro. Si observa puntos negros, enfre y aada unas gotas de nitrato amnico, se evapora en estufa hasta desecacin y se calienta de nuevo en estufa a 550C. el crisol se enfra en desecador y se pesa. El proceso termina cuando obtiene peso constante (3 horas) CLCULOS % Ceniza = Peso ceniza x 100 Peso muestra % de Materia Orgnica (BS) = 100 - % Ceniza (BS)

DETERMINACIN DE GRASA BRUTA (E.E) Este proceso es vlido en caso de sustancias relativamente ricas en gras, cuando se trata de productos con bajo contenido, este proceso puede dar resultados con amplia margen de error. Esto es debido a que los solventes utilizados, generalmente ter, cloroformo, benceno, etc., arrastran consigo en el proceso otras sustancias diferentes a las grasas, como carbohidratos, vitaminas o ciertos lpidos que carecen de valor prctico. Por esto el nombre generalizado de extracto etreo. Para determinar en forma apropiada el contenido real de grada es necesario complementar este mtodo con procesos especficos, los cuales no son el objetivo de este documento. Para la determinacin de grasas en sustancias ricas en azcar, levaduras, leche o harina de huesos debe utilizarse procesos diferentes, dan mayor confiabilidad a los resultados. EQUIPO Y MATERIALES: extractor Soxhlet o goldfish, estufa con graduacin de temperatura, granallas de zinc, papel filtro o dedales de celulosa. REACTIVOS: ter etlico, de petrleo o hexano.

PROCEDIMIENTO Para esta determinacin es indispensable utilizar una muestra libre de humedad ya que el agua disminuye la accin del solvente. Pese con precisin alrededor de 2 gramos de muestra seca en un papel filtro previamente tarado, entrchelo para que la muestra quede en el fondo. Pese el baln de destilacin con 2 o 3 granalla de zinc, asegrese de que el baln este limpio y seco, vierta sobre l 200 mL de ter etlico o de petrleo. Coloque la muestra en la unidad de extraccin. Acople el baln al equipo extractor, conecte las planchas de calefaccin y controle la temperatura (40C) . Extraiga por un tiempo mnimo de 8 horas; en caso de muestras con mayor contenido de grasa prolongue el tiempo 24 horas. Una vez transcurrido el tiempo necesario, recupere el solvente, seque los balones en la estufa a 50C para permitir que los vapores de ter desaparezcan, enfre y pese. Conserve la muestra desengrasada para la determinacin de fibra bruta. CLCULOS % Extracto Etreo = Peso extracto etreo x 100 Peso muestra Peso extracto etreo = Peso del baln mas el extracto Peso del baln vaco. NOTAS: 1. En caso de hacer esta determinacin en el aparato de goldfisch son necesarios los dedales de celulosa y vasos adecuados para e proceso que sustituyen el papel filtro balones descritos en el anterior proceso. 2. Grandes cantidades de componentes solubles en agua como carbohidratos, urea, cido lctico, glicerina y otros pueden interferir con la extraccin de grasa; si ese es el caso, extraer dos gramos de muestra sobre un papel filtro en un embudo con 5 porciones de mL de agua antes de secar la muestra para determinar el extracto etreo. 3. Si va a determinar la grasa a heces o dietas que contiene sale de Ca o Mg probablemente haya formacin de jabones los cuales no son solubles en los mismos disolventes, en tal caso es necesario hacer una hidrlisis cida de la muestra antes de la extraccin. Debido a que la hidrlisis cida extrae tambin fosfolpidos, glucolpidos, y lipoprotenas se podra hacer una primera extraccin, luego hidrolizar y extraer. 4. Muestras ricas en grasa en ocasiones requieren una extraccin antes del secado y una segunda extraccin despus. 5. La asociacin europea para reproduccin animal (Van Es-Van-Der-Meer, 1980), sugiere el uso de ter de petrleo o de hexano arguyendo que el ter etlico extrae otras sustancias aparte de las grasas como azcares y pigmentos, dems por razones de seguridad del laboratorio ya que l punto de ebullicin del ter etlico es de 35C y el del ter de petrleo y del hexano es de 55 a 65C aunque para realizar la extraccin con estos disolventes se requiere mayor temperatura.

DETERMINACIN DE FIBRA BRUTA O CRUDA (Weende) La determinacin de cada uno de los carbohidratos es una labor que hace mucho tiempo, requiere procedimientos difciles. Este hecho condujo a que los investigadores los agrupasen en dos. Los ms digeribles y los menos digeribles en el caso del mtodo Weende los agrupa en fibra cruda y extracto libre de nitrgeno (ELN). El primero determinado por la ebullicin alterna de la muestra con un cido y un lcali fuertes. El residuo que queda libre de componentes solubles como protena, azcares, almidones, etc.; es lo que se conoce como fibra cruda despus de descentar la ceniza y que est compuesta principalmente por lignina y celulosa. El ELN se determina por diferencia, esto es lo que queda despus de restar todos los valores determinados como fibra, protena, grasa y ceniza. Sin embargo, este sistema de anlisis tiene fallas serias debido a que el ELN se determina por diferencia, acumulando los errores de las dems determinaciones. Adems de que el ELN no es producto de un proceso, sino el residuo de una operacin matemtica. La fibra cruda por su parte es un trmino descriptivo de poco valor y se ha demostrado que el valor nutritivo de este, en muchos casos es mayor al del ELN en el mismo alimento. Al tener presente estas consideraciones Van Soest y colaboradores, idearon un mtodo para separar las fracciones de los alimentos de acuerdo a su disponibilidad nutricional, proceso que se detallar ms adelante. EQUIPO Y MATERIALES: bomba para inyeccin de aire, aparato de reflujo, lana de vidrio, vasos Berzelius o erlenmeyers, bomba de vaco, estufa, desecador, crisoles filtrantes (Gooch), planchas de calefaccin, mufla. REACTIVOS: cido sulfrico 1.25%, hidrxido de sodio 24% (o KOH 28%), etanol, acetona, antiespumante (alcohol octlico). PROCEDIMIENTO A. Hidrlisis cida: pese 0.2g de muestra desengrasada (residuo de la determinacin de EE), colquela en un erlenmeyer (u otro recipiente que permita el reflujo), adicione 20 mL de cido sulfrico 1.25%, adicione 5 gotas de antiespumante. Coloque el recipiente sobre la plancha de calefaccin. Acople el digestor, permita la ebullicin durante 30 minutos contando a partir del inicio de esta. B. Hidrlisis alcalina: retire el condensador y adicione al recipiente (sin quitarlo de la plancha) 2 mL de hidrxido de sodio al 24%,. Acople el quipo y contine la ebullicin por 30 minutos ms, si hay formacin de espuma, insufle aire o adicione antiespumante. Filtre la solucin caliente a travs del crisol con la lana de vidrio, lavando el residuo sucesivamente con agua hirviendo cido sulfrico al 1.25%, acetona y etanol. Secado e incineracin: lleve el crisol a estufa a 130C durante dos horas, enfrelo en un desecador y pselo (peso A). Colquelo en la mufla a 600C durante 30 minutos, enfrelo en un desecador y pselo (peso B)

La Fibra se representa por la prdida de peso en la incineracin. CLCULOS % Fibra Cruda = Peso fibra x 100 Peso muestra Fibra = Peso A Peso B = Peso (Fibra + Ceniza) Peso Ceniza NOTAS: 1. Se debe tener en cuenta el porcentaje de EE para convertir la cantidad pesada a la base original. Ejemplo si peso un gramo de muestra (desengrasada) que contena 5% de extracto etreo. 1g X Peso Real = 100 x 1 = 1.05 g 95 2. Descuente tambin la humedad del material que este analizando 3. El filtrado tambin puede llevarse a cabo sobre embudos tipo Gooch cubiertos con un circulo de alguna tela resistente o tela de alambre de malla de No 0.2 00. 4. Los embudos tipo kaahoma (Labconco Corp.) o California (Nalge Co.) son adecuado. DETERMINACIN DE FIBRA POR VAN SOEST El mtodo de Weende para determinacin de fibra que se ha descrito, no permite el estudio apropiado de los carbohidratos presentes en los alimentos, especialmente los llamados estructurales que se consideran fundamentales en la alimentacin de herbvoros y que ejercen una influencia marcada sobre al digestibilidad y valor nutritivo de los vegetales, tanto directa como indirectamente. Para tal efecto Van Soest en la dcada de los sesenta propone un mtodo para separar los constituyentes celulares y los clasifica como: A. Muy disponibles B. De disponibilidad incompleta, y C. Frecuentemente no disponibles En este mtodo se utilizan detergente que se combinan con la `protena para solubilizarla, as como un agente quelante (EDTA) que remueve los metales pesados y los iones alcalinos contaminantes. Al hervir la muestra con detergente neutro, se solubiliza el contenido de la clula y la pectina, dejando un residuo que es la pared celular que es la que contiene la celulosa, hemicelulosa y lignina (Fibra Detergente Neutro (FDN). 95 % (Sin extracto etreo) 100%

Por ebullicin posterior de un detergente cido se hidroliza la hemicelulosa que se encuentra libre y la que esta combinada con lignina dejando la celulosa y lignina como fibra detergente cida (FDA) La oxidacin de la lignina con KMnO4 deja la celulosa y ceniza como residuo, las que por incineracin da el valor de celulosa. Este procedimiento se detalla a continuacin. FC, FDN = celulosa, hemicelulosa y lignina FDA = celulosa y lignina OXIDACIN DEL PRODUCTO DE FDA (Con KMnO4) = Celulosa y ceniza C

DETERMINACIN DE LA FIBRA DETERGENTE NEUTRO Y CONTENIDO CELULAR (FDN) Este es un procedimiento rpido que permite determinar los constituyentes de la pared celular(celulosa, hemicelulosa y lignina) especialmente de aquellos alimentos fibrosos utilizados en la alimentacin animal. En alimentos con elevado nivel de protena o almidones y bajo contenido de fibra no es prctico su implementacin puesto que la confirmacin de geles o la coagulacin de la protena impide la filtracin adecuada dando valores de fibra superiores a los reales. Aunque es posible obviar este problema utilizando la tcnica propuesta por Mc Queen y Nicholson en 1979. El tratamiento de la muestra con detergente neutro (pH 6.9 7.1) permite obtener por una parte los compuestos solubles en el (almidones, protenas, glcidos solubles, etc.) denominado contenido celular y los compuestos no solubles (FDN), incluido dentro de esta fraccin se encuentra la ceniza. EQUIPO Y MATERIALES: bomba de vaco, aparato de reflujo, lana de vidrio, vasos Berzelius o erlenmeyers, estufa, desecador, crisoles filtrantes (Gooch). Limpieza de los Crisoles: despus de mucho uso, los crisoles tienden a obtruirse con material residual que es resistente a l filtrado corriente con cido crmico. Una manera adecuada de limpiarlos es la de ponerlos a incinerar a 500C y luego forzarles agua de abajo hacia arriba e direccin opuesta a travs del filtro, cuando los crisoles de obstruyen con partculas minerales despus de mucho uso, se prepara una solucin caliente de 20% de KOH, 5% de Na3PO4 y 0.5 de tilendiamino tetracetato de sodio y se hace pasar forzada de abajo hacia arriba a travs del filtro de vidrio del crisol. Se debe evitar el uso continuo de la solucin alcalina, pues tiende a erosionar el vidrio. REACTIVOS: Solucin Detergente Neutra (en 1000 mL de agua) pH = 6.9 7.1: 30g de Lauril sulfato sdico, 18.61g de EDTA disdico, 4.56g de fosfato disdico, 10mL de 2-etoxietanol (etilenglicol monoetil ter), 6.81g de borato de sodio decahidratado. 0.5g de sulfito sdico, acetona, antiespumante (alcohol octlico). PROCEDIMIENTO Controlar pH = 6.9 7.1 Pese aproximadamente 0.2g de muestra finamente molida (tamiz de 1mm). Colquela en un erlenmeyer para iniciar el reflujo. Adicione en orden los siguientes reactivos 20 mL de solucin detergente neutro a temperatura ambiente, verifique pH. 0.5g de sulfito de sodio. Caliente para lograr la ebullicin entre 5 y 10 minutos. Reduzca la temperatura para evitar la formacin de espuma. Ajuste la temperatura para lograr ebullicin constante. Mantenga la solucin en ebullicin por 60 minutos contados a partir de que esta se estabilice. Rote el recipiente para que la muestra sea bien tratada por el reactivo. Filtre la solucin a travs de un crisol con la lana de vidrio previamente tarado (A). Lave la muestra con la menor cantidad de agua posible, y repita el lavado varias veces. Lave luego dos veces con acetona. Seque el crisol a 105C por un mnimo de ocho horas, enfre en desecador y pese (B). Lugo colquelo en la mufla a 600C durante 30 minutos, enfrelo en un desecador y pselo.

CLCULOS % FDN (Pared Celular) = BA x 100 - % Ceniza Peso muestra

% Contenido Celular = 100 - % Pared Celular En el caso de muestras de granos y subproductos de molinos, existe la posibilidad de que forme un material gelatinoso derivado de los almidones y la protena, obstruyendo el filtro. Si por esta razn las muestras no se pudieron lavar, los resultados daran un contenido alto de paredes celulares, sin embargo la filtracin sera normal si se siguen indicaciones. A) Con frecuencia se puede mejorar el tiempo de filtrado, haciendo pasar aire de abajo hacia arriba en el crisol. B) Durante la parte inicial del calentamiento de la muestra hasta la ebullicin, se debe tomar precaucin para que la muestra no se adhiera al fondo del vaso. Esta adherencia dificulta la filtracin y se puede evitar por medio de un calentamiento ms rpido y una rotacin frecuente del vaso. La construccin previa de un tubo mltiple (batera) que reciba hasta 6 muestras simultneamente para filtrado con vaco, ayuda a reducir el tiempo de filtracin. El tubo mltiple debe construirse en forma tal que permita el control de la fuerza del vaco. Tambin si dejan una muestra en remojo en agua caliente mientras las otras estn siendo filtradas ayudara a un mejor lavado NOTA. Dentro del porcentaje pared celular, esta incluida la cantidad de ceniza de la muestra, la que debe descontarse al final del anlisis. DETERMINACIN DE FIBRA DETERGENTE ACIDO (FDA) Este procedimiento permite la determinacin rpida de lignina y celulosa presente en los alimentos considerados como las fracciones menos digestibles de la pared celular. La digestin cida remueve de la muestra la hemicelulosa y la protena presente en la pared celular que a pesar de ser poca debe considerarse para los clculos; por esto debe tenerse en cuenta que al diferencia entre FDN y FDA proporciona una estimacin del contenido de hemicelulosa. EQUIPO Y MATERIALES: bomba de vaco, aparato de reflujo, lana de vidrio, vasos Berzelius o erlenmeyers, estufa, desecador, crisoles filtrantes (Gooch). REACTIVOS: Solucin Detergente cido (en 1000 mL de H2SO4 1N) pH = 1.0 : 20g de Bromuro de cetil trimetil amonio(hexodecil trimetil amonio bromuro). Acetona, antiespumante (alcohol octlico).

PROCEDIMIENTO Controlar pH = 1.0(idealmente casi cero) Pese aproximadamente 0.2g de muestra finamente molida (tamiz de 1mm) y transfiera a un erlenmeyer para reflujo. Adicione 20mL de solucin detergente cido a temperatura ambiente (verifique pH que debe ser casi 0). Caliente para lograr la ebullicin entre 5 a 10 minutos. Reduzca la temperatura para evitar la formacin de espuma. Ajuste la temperatura para lograr ebullicin constante. Mantenga la solucin en ebullicin por 60 minutos contados a partir de que esta se estabilice. Rote el recipiente para que la muestra sea bien tratada por el reactivo. Filtre la solucin a travs de un crisol Gooch con la lana de vidrio previamente tarado (A). Lave la muestra con la menor cantidad de agua posible, y repita el lavado varias veces. Lave luego dos veces con acetona. Seque el crisol a 105C por un mnimo de ocho horas, enfre en desecador y pese (B). Conserve el residuo para la determinacin de Lignina. CLCULOS % FDA = BA x 100 - % Ceniza Peso muestra

% Hemicelulosa = % FDN - % FDA NOTA. Tenga en cuenta que FDA an conserva la ceniza de la muestra. DETERMINACIN DE LIGNINA (POR PERMANGANATO) La lignina, es un polmero amorfo de derivados del fenilpropano de elevado peso molecular, que por hacer parte de la pared celular se trata en este captulo, aunque de alguna manera constituye un carbohidratos. Es ms, interfiere en gran medida el aprovechamiento de estos, en aquellos animales que derivan su sustento de los forrajes. Esto lo convierte en un elemento importante y de all la trascendencia de su cuantificacin. Existe en un buen nmero de procedimientos para su determinacin a saber. Oxidacin por cido actico permanganato de potasio. Oxidacin por cloruro de sodio. Separacin de la clula con cido sulfrico al 72 %

El procedimiento que se detalla a continuacin se basa en la relativa facilidad con la que la lignina se oxida, su contenido en la muestra est determinado por prdida de peso que sufre la muestra sometida a este proceso y que el residuo que queda este constituido por celulosa y ceniza.

EQUIPO Y MATERIALES: bomba de vaco, horno desecador, bandeja de vidrio, varilla de vidrio, estufa, desecador, crisoles filtrantes (Gooch). REACTIVOS: KMnO4 al 5%. Solucin buffer: para 50mL de buffer se prepara dos soluciones. La solucin A con 0.466 g de nitrato frrico, 0.0075g de nitrato de plata, los que se diluyen en 5mL de agua. La solucin B disolviendo 0.25g de acetato de potasio en 25mL de cido actico y 20mL de tercbutanol. Antes del anlisis mezcle la solucin de permanganato con la solucin buffer en una proporcin 2: 1. Solucin desmineralizadora: 5g de cido oxlico deshidratado, 70mL de etanol al 95%, 5mL de HCl concentrado y 25mL de agua. Etanol al 80% para el lavado Acetona PROCEDIMIENTO Coloque el crisol que contiene FDA en una bandeja de vidrio que contenga una copa de 1cm de espesor de agua fra, no moje la fibra. Agregue al crisol 25mL de la solucin combinada(permanganato + buffer). Coloque una varilla de vidrio dentro del crisol para remover el contenido. Dele un grado de inclinacin apropiado a la bandeja, para que la muestra est siendo tratada por la solucin constantemente. Permita que la solucin trate la muestra un tiempo mnimo de 90 minutos adicionando solucin si es necesario(debe permanecer de color morado). Filtre la solucin sin lavar con agua. Coloque el crisol en una bandeja de vidrio limpia. Llnelo hasta la mitad con la solucin desmineralizadora. Con la varilla de vidrio descomponga los grumos formados. Despus de 5 minutos filtre y repita los dos pasos anteriores. Si el filtrado es de color caf repita los pasos anteriores. Lave con solucin desmineralizadora hasta que el residuo quede de color blanco. El tiempo necesario en este paso es de 20 a 30 minutos. Llene y lava el contenido del crisol con alcohol etlico del 80% y repita el lavado. Lave dos veces con acetona de igual manera que los hizo con alcohol. Seque el crisol durante la noche a 105C. Enfre en desecador y pese(C). CLCULOS % Lignina = BC x 100 Peso muestra

C = Celulosa + Ceniza NOTAS. 1. El peso B es el correspondiente al proceso de FDA 2. La cutina que es una fraccin muy importante en muchas de la s cubiertas exteriores de las semillas, no se determina con este mtodo. Una variacin que se introduce en estos casos, es la de usar el permanganato

para celulosa y tratar la muestra con cido sulfrico al 72% y asbesto, por espacio de 3 horas. Este procedimiento resulta en el fraccionamiento de la lignina cruda en las dos fracciones descritas seguidamente. 3. Una desventaja que se le puede atribuir al mtodo por permanganato, es que las partculas de mayor tamao las penetra completamente los reactivos y por lo tanto, en estos casos los resultados dan valores bajos. En consecuencia, los materiales con alto contenido de humedad debern secarse parcialmente, molerse y prepararse a travs de un tamiz de 1mm para reducir el tamao de la partcula. Este mtodo por lo tanto, no es adecuado para heces y forrajes frescos que han sido molidos en un molino para carnes, cuya forma fsica es inapropiada debido a la posibilidad de daar la muestra con cloro, es preferible usar cido sulfrico al 72% para determinar lignina. LIGNINA ACIDO DETERGENTE Este mtodo determina lignina por el mtodo cido detergente. Como paso preliminar se determina la fibra cido detergente. El detergente elimina la protena y otro material soluble en cido que interferir con la determinacin de lignina. El residuo de la fibra cido detergente consistente de celulosa, lignina, cutina y cenizas insoluble en cido(principalmente silicio). El tratamiento con H2SO4 al 72% disuelve la celulosa. La incineracin del residuo determina la fraccin de lignina cruda incluyendo la cutina. Para determinacin y separacin de cutina y lignina ver el procedimiento de determinacin de lignina por permanganato. REACTIVOS: Acetona R.A. usar acetona libre de color y que no deje residuo al evaporarse. Solucin cido detergente. a) H2SO4 1N valorado (49.04g / 1L). b) Bromuro de cetil trimetil amonio grado tcnico (20g / 1L). Medir el H2SO4, aforar con agua destilada. Determinar la normalidad del cido por titulacin, adicionar el bromuro de cetil trimetil amonio y agitar. Asbesto, pesar 100g de asbesto (fibra larga) en un matraz de 3 litros, agregar 800mL de agua y 1400mL de H2SO4 concentrado. Mezclar y enfriar a temperatura ambiente por 2 horas. Filtrar sobre un embudo Buchner y lavar con agua. Resuspender el residuo en agua y ponerlo dentro de una bolsa de 46 x 30cm de fibra de vidrio de malla de 14 x 18 (aproximadamente 1mm). La bolsa debe cocerse con hilo apropiado. Lavar por inmersin y agitacin en agua para eliminar las partculas finas. Incinerar el asbesto residual a 800C/16 horas. Almacenar en forma seca hasta que se vaya a necesitar. El asbesto usado puede ser nuevamente lavado e incinerado. cido sulfrico al 72% peso. Calcular los gramos de cido y agua necesario en un litro de solucin de acuerdo a la formula siguiente: 100 x 98.0 x 12 moles Anlisis H2SO4 (en por ciento) = gramos de cido necesarios

(1000 x 1634)3 gramos de cido = gramos de agua necesaria Medir la cantidad de agua calculada dentro de un matraz volumtrico (con bulbo en el cuello) y adicionar la cantidad calculada de H 2SO4 lentamente, y con agitacin suave. Colocar el matraz dentro del lavadero, lleno de agua antes de adicionar el cido, enfriar a 20C y asegurase si el volumen sea el correcto. Si el volumen es muy pequeo sacar 1.5 mL y adicionarle 2.5mL de agua. Si el volumen es demasiado grande, tomar 5mL y adicionarle 4.45mL de H2SO4. El menisco debe estar a 0.5cm de la marca de calibracin a 20C.

PROCEDIMIENTO Pesar 1g de muestra y determinarle FDA como se indic antes. Agregar al crisol que contiene el residuo de la fibra cido detergente una cantidad de asbesto igual al volumen de la fibra. Cubrir el contenido del crisol con H2SO4 al 72% (15C) y agitar con un agitador de vidrio a formar una pasta. Agregar cido hasta la mitad del crisol y agitar. Dejando el agitador dentro, agregar H2SO4 72% varias veces segn se vaya drenando el crisol; tres veces es suficiente. Mantener los crisoles a 20 - 23C. Despus de 3 horas eliminar todo el cido que sea posible haciendo vaco. Lavar el residuo con agua hasta que est libre de cido. Lavar y quitar el agitador. Secar los crisoles a 100C y pesar. Incinerar los crisoles en mufla a 500 - 550C / 3 horas.; enfriar a 100C y pesar. La pesada deber hacerse en caliente; si esto no es posible, enfriar los crisoles en desecador con P2O5 como desecante. CLCULOS Calcular la lignina cido detergente LAD = L x 100 S donde, LAD= Lignina cido detergente L = prdida por ignicin despus del tratamiento con H2SO4 al 72% S = peso de la muestra seca en estufa.

DETERMINACIN DE CELULOSA Incinere la muestra procedente de la determinacin anterior a 500C durante 3 horas, enfre en desecador y pese (D). La prdida de peso constituye el contenido de celulosa de la muestra. CLCULOS % CELULOSA = CD Peso muestra x 100

CUTINA ACIDO DETERGENTE Este mtodo determina la cutina, material que no es oxidado por KMnO 4 y resiste la hidrlisis por H2SO4 al 72%. Esta fraccin puede ser grande en algunas cscaras de semillas o no ser importante como en forrajes comunes. La relacin que hay entre la cutina y el valor nutritivo de las otras partes de la planta no se conoce con precisin. Sin embargo, el factor cutina es resistente a la degradacin microbiana.

REACTIVOS: Acetona R.A. usar acetona libre de color y que no deje residuo al evaporarse. Solucin cido detergente. a) H2SO4 1N valorado (49.04g / 1L). b) Bromuro de cetil trimetil amonio grado tcnico (20g / 1L). Medir el H2SO4, aforar con agua destilada. Determinar la normalidad del cido por titulacin, adicionar el bromuro de cetil trimetil amonio y agitar. Asbesto, pesar 100g de asbesto (fibra larga) en un matraz de 3 litros, agregar 800mL de agua y 1400mL de H2SO4 concentrado. Mezclar y enfriar a temperatura ambiente por 2 horas. Filtrar sobre un embudo Buchner y lavar con agua. Resuspender el residuo en agua y ponerlo dentro de una bolsa de 46 x 30cm de fibra de vidrio de malla de 14 x 18 (aproximadamente 1mm). La bolsa debe cocerse con hilo apropiado. Lavar por inmersin y agitacin en agua para eliminar las partculas finas. Incinerar el asbesto residual a 800C/16 horas. Almacenar en forma seca hasta que se vaya a necesitar. El asbesto usado puede ser nuevamente lavado e incinerado. cido sulfrico al 72% peso. Calcular los gramos de cido y agua necesario en un litro de solucin de acuerdo a la formula siguiente: 100 x 98.0 x 12 moles Anlisis H2SO4 (en por ciento) = gramos de cido necesarios

(1000 x 1634)3 gramos de cido = gramos de agua necesaria Medir la cantidad de agua calculada dentro de un matraz volumtrico (con bulbo en el cuello) y adicionar la cantidad calculada de H 2SO4 lentamente, y con agitacin suave. Colocar el matraz dentro del lavadero, lleno de agua antes de adicionar el cido, enfriar a 20C y asegurase si el volumen sea el correcto. Si el volumen es muy pequeo sacar 1.5 mL y adicionarle 2.5mL de agua. Si el volumen es demasiado grande, tomar 5mL y adicionarle 4.45mL de H2SO4. El menisco debe estar a 0.5cm de la marca de calibracin a 20C. n-Hexano R.A Permanganato de potasio saturado. Revolver 5g de KMnO4 grado de reactivo por litro de agua destilada o 900g KMnO4 para un volumen de 18 litros de agua destilada. Mantngase la solucin protegida de la luz solar directa. Solucin amortiguadora de lignina. Para preparar 1 litro de solucin, disuelva 6.0g de nitrato frrico nonahidratado y 0.15g de nitrato de plata en 100mL de agua destilada. Combine esta mezcla con 500mL de cido actico glacial y 5.0g de acetato de potasio y mzclese la solucin. Para preparar 12L se emplean las siguientes cantidades de reactivo: Nitrato frrico nonahidratado Nitrato de plata Acido actico Acetato de potasio Alcohol butrico terciario Agua destilada 72.0g 1g 6L 60g 4.8L 1.2L

Solucin de permanganato combinada. Antes de ser usado, combine y a la vez mezcle la solucin de permanganato de potasio saturado con la solucin amortiguadora de lignina en la relacin de 2: 1 volumen. La porcin no utilizada de esta mezcla puede mantenerse por

una semana en refrigeracin en ausencia de luz. Esta solucin puede utilizarse si mantiene l color morado y esta libre de precipitado. Los reactivos deben ser enfriados antes de usarlos. Solucin desmineralizadora: par cada litro de solucin disuelva 50g de cido oxlico deshidratado en 700mL de etanol al 95%, agregue 50mL de HCl concentrado(aproximadamente 12N) y 250mL de agua destilada y luego mzclese. Para preparar 18L se emplea la siguientes cantidades de reactivos: cido oxlico Etanol 95% cido clorhdrico concentrado Agua destilada 900g 12.6L 900mL 4.5L

Alcohol etlico de 80% v/v. Para 1L mezcle 155mL de agua destilada y 845mL de alcohol etlico del 95%. Para preparar 18L mezcle 2.8L de agua destilada y 15,2L de alcohol etlico de 95%. PROCEDIMIENTO Seguir el procedimiento para la lignina, celulosa y slice por permanganato hasta el paso en el que se pueda calcular la lignina pero sin incinerar. Tratar el residuo sin incinerar con H2SO4 72% como el procedimiento de lignina cido detergente. Calcular la cutina como prdida despus de incinerar. DETERMINACIN DE SLICE Es posible obtener un valor aproximado al contenido de slice, mediante la percolacin del residuo de ceniza obtenida en el proceso anterior con cido bromhdrico concentrado (48%) hasta que el color haya desaparecido. Lave con acetona y filtre. Incinere a 500C por 3 horas. Enfre en desecador y pese(E). (Este ltimo peso no es necesario si el residuo de ceniza en menor del 2% de la muestra original). CLCULOS % SLICE = E A x 100 Peso muestra

DETERMINACIN DE NITRGENO La determinacin e identificacin de cada una de las protena que integran el alimento es de poca utilidad prctica, por esto el qumico asume que el contenido de nitrgeno en las diferentes protenas es en promedio de 16%, en el caso de la leche o el trigo donde su contenido de nitrgeno es conocido debe utilizarse el factor apropiado para convertir el nitrgeno a protena. Jones ha publicado factores especficos para 121 protenas y alimentos.

El valor protico estimado a partir de su contenido nitrgeno hace suponer que todo el nitrgeno presente en la sustancia analizada se haya haciendo parte de una protena. Cosa que no es cierto para ningn alimento, pues contiene tambin cantidades considerables de compuestos nitrogenados que no son protenas como aminocido. Aminas, sales de amonio, nitratos, etc. Estas consideraciones deben tenerse presentes para diferenciar la llamada protena cruda de la protena verdadera de los alimentos. En este manual se describe el mtodo Kjeldahl que ha sido el ms aceptado de los muchos que se han propuesto para la determinacin de nitrgeno total. Este mtodo, reportado por Kjeldahl en 1883, ha sufrido numerosas modificaciones que han conducido a su mayor simplificacin, por lo que oficialmente hoy se conoce como el mtodo Kjeldahl Gunning Arnold. Tres pasos principales contemplan el mtodo digestin de la muestra con cido sulfrico concentrado en presencia de un catalizador y a elevada temperatura para transformar el nitrgeno en sulfato de amonio. La solucin se alcaliniza y el amoniaco liberado se destila para su posterior titulacin. EQUIPO Y MATERIALES: digestor Kjeldahl, destilador Kjeldahl, microbureta, tubos de destilacin Kjeldahl, erlenmeyer de 250mL. REACTIVOS: cido sulfrico concentrado, hidrxido de sodio 32%, cido sulfrico 0.1N, cido brico 4%. Indicador: disolver 0.05g de rojo de metilo y 0.25g de verde de bromocresol en 100nL de etanol. Catalizador: mezclar sulfato de potasio anhidro 96.05% , sulfato de cobre pentahidratado 2.41% y selenio 1.54%. cido saliclico para nitrgeno total. PROCEDIMIENTO Pese con exactitud alrededor de 0.5g de muestra, Transfirala al tubo Kjeldahl. Si la muestra contiene nitratos proceda con Nitrgeno total, en caso contrario proceda con Nitrgeno Protico NITRGENO TOTAL Evite la prdida de cido ntrico del N proveniente de los nitratos. Adicione a la muestra en el tubo 5mL de cido sulfrico concentrado y un tableta Kjeldahl o 2g de mezcla cataltica. Agregue 0.5g de cido saliclico. Agite y deje reposar por lo menos 10 minutos. Contine el proceso de la misma forma que con la N protico, a partir del calentamiento. NITRGENO PROTICO Adicione a la muestra en el tubo 5mL de cido sulfrico concentrado. Agregue 1 tableta Kjeldahl o 2g de la mezcla cataltica. Coloque el digestor previamente calentado(T 6) y aumente la temperatura a 9. Contine la digestin hasta que la solucin se torne de color verde claro. Apague el digestor y deje enfriar la solucin por 15 minutos (sin desmontar el equipo). Traslade el matraz al equipo de destilacin acplelo con

sumo cuidado. Antes de comenzar este paso, asegrese que todos los accesorios del equipo estn en posicin correcta para su utilizacin(consulte al tcnico). Agregue a la solucin, agua hasta complementar 5mL (en la escala). Alcalinice la solucin con NaOH al 32%, esto se logra cuando la solucin se torna de color caf o azul ( 20mL). Presione el botn de destilacin y destile a 35mL. Reciba el resultado en un erlenmeyer que contenga 5mL de cido brico al 4% con indicador (3 gotas). El cido brico con indicador debe cambiar de rojizo a verde esmeralda. Titule con cido sulfrico 0.1N hasta cambio de color (rojizo). Anote el gasto (restndole el del blanco). CLCULOS Cantidad de amoniaco titulado V x N x Eq = miligramos de NH3 V x N x 17 = miligramo de NH3 Cantidad de nitrgeno 1mol de NH3 contiene 1at-g de N, por lo tanto 17mg de NH3 contiene 14mg de N V x N x 17 miligramo de NH3 contiene X miligramos de N X = 100 x V x N x 14 = V x N x 14mg de N 17 Porcentaje de Nitrgeno V x N x 14 miligramo de N proviene de M x 1000mg de muestra X mg de N proviene de 100g de muestra X = 100 x V x N x 14 = 1.4 x V x N = % de N M x 1000 M Donde, V = volumen en mL de cido sulfrico gastado para titular N = Normalidad del cido utilizado para titular = 0.1N M = peso de la muestra en gramos CONVERSIN A PROTENA Se ha sealado ya que no todo el contenido de N determinado por este proceso hace parte de protenas por lo que es necesario aplicar el factor apropiado para cada alimento con el fin de obtener un resultado satisfactorio.

Hay que tener presente por otra parte que no todo los factores de conversin son exactos, debido a la dificultad existente para separar las protenas verdaderas de un mismo alimento; y no podran aplicarse a mezclas, sino aquellos para los cuales se determinaron. Aunque existan estas limitaciones, es necesario aplicar factores que aunque aproximados dan una idea mas o menos clara del contenido protico de la muestra que se est analizando. Para esto se han agrupado los alimentos debido a que su factor d conversin es aproximado a as. Para mezclas de cereales: maz, arroz, cebada, centeno, trigo, semillas de algodn, linaza, soya y subproductos. Par carnes, huevos, frjoles, frutas, verduras y subproductos. Para leche y derivados.

En el caso de pastos y forrajes, se asume un contenido de N del 16% y 15.7% para el caso de productos lcteos. En el primer caso el porcentaje de protena ser igual a: % PROTENA = V x N x 14 x 6.25 x 100 mg de muestra

NITRGENO NO PROTICO (Ureico y Amoniacal) EQUIPO Y MATERIALES: matraz Kjeldahl, destilador Kjeldahl. REACTIVOS: CaCl2 al 25%, antiespumante. Ureasa liofilizada: prepare una solucin tal que 10mL de ella conviertan el N de 0.1g de urea Determinacin de alcalinidad: disolver 0.1g de ureasa en 50mL de agua titular con cido clorhdrico 0.1N. Utilice rojo de metilo como indicador. Agregue el mismo volumen de HCl 0.1N por cada 0.1g de ureasa utilizada en solucin. Determinacin de la actividad: prepare 50mL de solucin neutra, adicione diferentes cantidades de solucin a muestra de 0.1g de urea y contine con la digestin enzimtica y destilacin que se anotan ms delante. Calcule la actividad de la ureasa con la cantidad que convierta completamente la urea, determinada por la recuperacin del N total. PROCEDIMIENTO Coloque 2g de muestra en un matraz Kjeldahl. Adicione 250mL agua y agregue 10mL de solucin de ureasa. Tape el recipiente y deje en reposo por 1 hora. Si el alimento contiene ms del 5% de urea adicione ms ureasa. Lave el tapn y cuello del matraz. Adicione 2g de MgO, 5mL de solucin de CaCl2 y 3mL de antiespumante. Destile de igual forma como lo hizo con el N protico. Calcule el porcentaje de N. REACTIVOS PARA CALIBRACIN DEL PROCESO KJELDAHL

COMPUESTO Urea Acido rico Sulfato de amonio Lisina Triptfano

GRAMOS 0.06 aprox. 0.08 aprox. 0.13 aprox. 0.15 aprox. 0.20 aprox.

% de N 46.6459 33.3272 21.2007 19.1625 13.7167

FACTOR 2.1438 3.0004 4.7168 5.2185 7.2964

DETERMINACIN DE MINERALES La importancia de los minerales en la alimentacin animal es de un inters indiscutible, por esto se hace necesario la determinacin analtica de los componentes inorgnicos que son de inters usual. En este caso nos referimos a los macroelementos, que representan la fraccin ms grande del contenido mineral del animal. La determinacin de cenizas por el mtodo de Weenden, como se dijo antes, no es una medida confiable del contenido mineral de una alimento. Se debe ms bien determinar cada elemento por procesos especficos que permiten visualizar la calidad mineral de la sustancia analizada. Los recursos disponibles en el laboratorio son una condicionante grande que no permite la implementacin de mtodos mas modernos, por ello debemos seguir desarrollando los sistemas que se ajustan a estas condiciones. NOTA Debe evitarse el calentamiento demasiado rpido puesto que algunas sales funden y absorben carbono que luego es difcil de quemar. El uso de una temperatura excesivamente alta tambin puede determinar prdida de sales voltiles como cloruro de sodio y de hierro. DIGESTIN HUMEDA DE PRODUCTOS ALIMENTICIOS PAR ANLISIS DE ELEMENTOS APLICACIN. El mtodo puede aplicarse a todos los tipos de productos alimenticios . PRINCIPIO. La materia orgnica se destruye y oxida por la accin del cido sulfrico y del cido ntrico en ebullicin. REACTIVOS: cido sulfrico concentrado (peso especfico 1.84). cido ntrico concentrado (peso especfico 1.42). Lquido para el lavado de cido del material de vidrio: diluir 1 a100 cido ntrico concentrado en agua. Comprobar el contenido en metales de los cidos. Utilizar reactivos que no contengan ms de 1mg de metal objeto de determinacin por litro. Agua, utilizar agua desmineralizada o destilada de buena calidad.

APARATOS: lavar todo el material de vidrio con lquido cido. Guardar separadamente el material de vidrio destinado a la determinacin de metales traza. PROCEDIMIENTO Pesar 2g (si la muestra contiene 10% de agua) o 1g (si la muestra contiene menos de un 10% de agua) de muestra homogenizada y transferirla a un matraz de 100mL. Aadir 10mL de cido sulfrico concentrado y agitar energticamente asegurndose de que no queden grumos secos. Aadir 5mL de cido ntrico concentrado y mezclar. Calentar con precaucin hasta que cese la violenta reaccin inicial. Calentar con mayor intensidad hasta que se desaparezcan casi todos los vapore nitrosos. Continuar aadiendo cido ntrico gota a gota hasta destruir toda la materia orgnica. Calentar hasta que se liberen los humos blancos de sulfrico. Preparar un blanco usando las mismas cantidades de los reactivos. Para la medida del contenido del elemento seguir las instrucciones dadas para dicho metal. NOTA. Todas las operaciones debern ejecutarse bajo vitrina de gases con ventilacin adecuada y lavado de los gases de salida. DETERMINACIN DE CALCIO A PARTIR DE CENIZAS Este elemento por ser el que en mayor cantidad hace parte del organismo animal, especialmente en el tejido seo, adems de que juega un papel importante en las dems clulas, es obligado su anlisis en el laboratorio. Para la determinacin de calcio en un alimento, es necesario tomar en cuanta que se pueden presentar interferencias con elementos como cido fosfrico, manganeso, hierro y aluminio. Par el anlisis de calcio, as como se hizo para el fsforo se debe partir de la solucin P obtenida por la digestin de la muestra original de alimento. REACTIVOS: cido sulfrico concentrado (peso especfico 1.84), cido ntrico concentrado (peso especfico 1.42), solucin de HCl en agua (1: 3), solucin de NH 4 en agua (1: 1), solucin diluida de NH4OH en agua (1: 50) solucin acuosa de oxalato de amonio al 4.2%, solucin 0.05 o 0.15N de KMnO 4, indicador de rojo de metilo al 0.5% en etanol.

PREPARACIN DE LA MUESTRA

Pesar con exactitud aproximadamente 2.5g de muestra en crisol de porcelana o slice y calcinar a 550C durante 2 horas (el residuo de la determinacin de cenizas puede usarse para esta determinacin). Aadir 40mL de HCl (1: 3) y unas gotas de HNO3, calentar a ebullicin, transferir a un matraz volumtrico de 100mL, enfriar, aforar con agua, homogenizar. DETERMINACIN. Transferir 50mL de la solucin de la muestra a un vaso de precipitados de 250mL, aadir 2 gotas de rojo de metilo y NH4OH (1:1) gota a gota hasta alcanzar un pH de 5.6 indicado por un calor caf naranja. Aadir entonces dos o tres gotas de HCl (1:3) a modo de que el indicador vire al rosa (pH 2.5 3.0). Diluir aproximadamente a 150mL, calentar a ebullicin y aadir lentamente y con agitacin constante 10mL de solucin oxalato de amonio. Si el indicador vira al anaranjado o amarillo, aadir HCl (1:3) hasta obtener el color rosado. Dejar reposar durante la noche, 1 2 horas en bao Mara a modo de que se sedimente el precipitado de oxalato de calcio. Filtrar el precipitado a travs de papel filtro retentivo, asbesto filtro de vidrio poroso y lavar el precipitado repetidamente con NH4OH (1:50). Colocar el papel o crisol con el precipitado con el vaso original y aadir una mezcla de 125mL de agua y 5mL de H2SO4. Calentar a unos 70C y titular con una solucin de KMnO 4 hasta alcanzar el color rosado. La presencia de papel puede decolorar la solucin en unos cuantos segundos. Corregir por determinacin en blanco y calcular el porcentaje de calcio. 1mL de KMnO4 0.05N equivale a un mg de calcio. NOTA. Debe evitarse el calentamiento demasiado rpido puesto que algunas sales funden y absorben carbono que luego es difcil de quemar. El uso de una temperatura excesivamente alta tambin puede determinar prdidas de sales voltiles como cloruro de sodio y de hierro. DETERMINACIN DE FOSOFORO. El fsforo presente en organismos vegetales y animales, hace parte de un gran nmero de compuestos diversos, en parte como fosfato inorgnico puro, pero la mayor cantidad hace parte de compuestos de naturaleza orgnica. A pesar de que casi todos los compuestos contiene el fsforo como cido ortofosfrico, se requiere frecuentemente una ataque qumico fuerte para transformarlo en un compuesto analizable.

FSFORO TOTAL(Mtodo Colorimtrico).

APLICACIN. El mtodo puede aplicarse a las cenizas de los productos alimenticios. PRINCIPIO. El ortofosfato del extracto de las cenizas reacciona con el molibdato amoniaco en solucin cida para formar cido fosfomolibdico. Este compuesto es reducido por el cido ascrbico dando un intenso color azul que se mide colorimtricamente. REACTIVOS: cido sulfrico 5N: diluir 140mL de cido sulfrico (peso especfico 1.84) a un litro, cido clorhdrico 3N y 6N, NaOH 0.3N: disolver 12g de NaOH en un litro de agua. Solucin madre de los reactivos del color: disolver 6g de molibdato de amonio y 0.131g de tartrato de antimonio y potasio (C4H4O7SbK) en 400mL de agua, aadir 500mL de cido sulfrico 5N y mezclar, diluir a un litro con agua y volver a mezclar. Almacenar. Solucin de trabajo de los reactivos del color: aadir 0.53g de cido ascrbico por cada 100mL de solucn madre de los reactivos del color que se precise. Preparar este reactivo fresco cada da. Solucin Patrn de fsforo: desecar fosfato monopotsico (KH 2PO4) durante dos horas a 105C, pesar 0.286g de fosfato monopotsico, disolver en agua y diluir a 100mL (2mg PO4/mL). Solucin patrn de fsforo: diluir 5mL de la solucin anterior a 500mL con agua (20 g PO4/mL). Esta solucin es la de trabajo, la anterior se considera como solucin madre. EQUIPOS Y MATERIALES: dispensador automtico de 8mL, espectrofotmetro o colormetro adecuado para la regin de 880nm , cubeta de vidrio de 1cm de camino ptico. PROCEDIMIENTO Cenizas obtenidas por incineracin seca. Tratar las cenizas con 5 10mL de cido clorhdrico 6N para mojarlas completamente y desecarlas con cuidado sobre una placa caliente a una baja temperatura. Aadir 15mL de cido clorhdrico 3N y calentar el crisol sobre placa caliente hasta que la solucin comience justamente a hervir. Enfriar y filtrar a travs de papel filtro hacia un matraz volumtrico (NOTA 1) reteniendo en el crisol la mayor cantidad de slidos posible. Aadir al crisol 10mL de cido clorhdrico 3N y calentar hasta que la solucin comience a hervir. Enfriar y filtrar a travs de papel filtro hacia un matraz volumtrico de 250mL. Lavar el crisol al menos tres veces con agua destilada y filtrar los lavados hacia el matraz. Lavar perfectamente el papel de filtro y recoger los lavados en el matraz. Enfriar y diluir el contenido del matraz hasta la seal del enrace con agua. DETERMINACIN Pipetear una alcuota de los 250mL del extracto de cenizas hacia un matraz volumtrico de 50mL. Esta alcuota debe contener menos de 100g de fosfato y ms de 20g. Aadir un volumen igual de hidrxido sdico 0.3N para neutralizar la solucin. Aadir agua hasta alcanzar un volumen total de unos 30mL. Utilizando el dispensador automtica aadir 8mL de solucin de trabajo de los reactivos del color. Diluir hasta la seal de enrase con agua y mezclar. Dejar que el color se desarrolle durante 10 minutos (NOTA 1). Leer la absorbancia a 882nm en cubeta de 1cm.

ESTANDARIZACIN Pipetear alcuotas de 0, 1, 2, 3, 4 y 5 mL de la solucin de trabajo patrn a matraces volumtricos de 50mL. Estas soluciones contienen 0, 20, 40, 60, 80 y 100g PO4 por 50 mL. Aadir agua hasta llevar el volumen a unos 30mL, continuar como las instrucciones. CALCULOS Construir una curva de calibracin representando grficamente la concentracin de los patrones sobre el eje X (g PO4/50mL) frente a la absorbancia sobre el eje Y. A partir de la curva de calibracin leer la concentracin de fosfato de la muestra y del blanco. ANLISIS DE LOS NUTRIENTES DE LOS ALIMENTOS Si fosfato de la muestra g PO4 / 50 mL = a fosfato del blanco g PO4 / 50 mL = b Peso (g) de la muestra tomada para el anlisis de cenizas = w Alcuota (mL) tomada para el anlisis = v Entonces, Contenido de Fosfato (%PO43-) = 0.025 x (a b) W xV Contenido de Fosfato (%P) = 0.00815 x (a b) W xV NOTA 1. El color es estable durante varias horas