Clulas Pluripotenciais Induzidas

Uma vez dominados os processos envolvidos na obteno, cultivo, e diferenciao de CTE em clulas de interesse clnico, outra limitao prtica deve ser levada em conta. Apesar de bancos de CTE poderem ser eventualmente criados, permitindo o estabelecimento de grandes colees, elas dificilmente iriam abranger toda a diversidade existente. Assim, as CTE teriam seu uso restrito a receptores histo-compatveis. Uma das alternativas criao de bancos de CTE envolve a reprogramao do ncleo de clulas somticas (no caso, o paciente sem doador) pelo citoplasma de um ocito, de forma a obter CTEh autlogas. Esta abordagem tambm conhecida como clonagem teraputica uma vez que no visa gerar um indivduo clonado, mas somente CTE para uso teraputico. A reprogramao do ncleo somtico induzida pelo citoplasma de ocitos resulta da presena de diferentes molculas, incluindo fatores de transcrio e outras protenas. Recentemente, vrios grupos relataram a induo de

pluripotncia em fibroblastos primrios humanos atravs da transduo dos mesmos com vetores virais expressando os genes OCT4, C-MYC, KLF4 e SOX2. As chamadas clulas-tronco pluripotentes induzidas (iPS) tm morfologia

caracterstica de CTEs, expressam marcadores de clulas pluripotentes e so capazes de se diferenciar in vitro e in vivo em tecidos derivados dos trs folhetos embrionrios. Assim, a gerao de iPS a partir da induo de clulas somticas por fatores especficos, poderia representar uma alternativa para a obteno de clulas tronco histo-compatveis. Os resultados preliminares obtidos pelo grupo coordenado pelo Dr. Dimas Tadeu Covas do Hemocentro de Ribeiro Preto mostram a eficincia na produo de vetores lentivirais, na transduo de clulas-tronco mesenquimais e

progenitores endoteliais e na modificao do padro de expresso de clulastronco endoteliais com gene Nanog. Assim, este grupo, atravs do sub-projeto 5, intitulado Modificao gnica de clulas-tronco, ter como objetivo geral, modificar geneticamente Clulas Tronco Mesenquimais (CTM) e clulas progenitoras endoteliais com vetores lentivirais contendo fatores de transcrio, com o intuito de transformar clulas multipotentes em clulas pluripotentes e com maior capacidade de expanso in vitro. Para tanto, o projeto envolver as seguintes abordagens: a) transduzir CTM com vetores lentivirais 1054-CIGWS contendo um dos

fatores de transcrio (Nanog, Oct3/4, Sox 2, -catenina, Kfl4, c-myc, Esrrb, Tcl 1e Tbx 3) juntamente com o gene GFP para que as clulas transduzidas possam ser selecionadas por citometria de fluxo (GFP positivas); b) Inicialmente, as transdues de CTM sero realizadas com um fator de transcrio de cada vez e posteriormente um conjunto de quatro vetores sero utilizados para transduo; c) avaliar as alteraes causadas no perfil de expresso gnica; d) avaliar mudanas na morfologia das clulas transformadas; e) determinar se as clulas modificadas apresentam marcadores tpicos de clulas-tronco embrionrias (como por exemplo: fosfatase alcalina e/ou antgenos SSEA-1) e por fim avaliar se estas clulas modificadas adquirem a capacidade de se diferenciar em tecidos dos trs folhetos germinativos. Uma grande limitao dos estudos pr-clnicos com CTEs a falta de modelos animais de grande porte onde se possa realizar esses testes, uma vez que uma srie de dificuldades tcnicas e biolgicas dificultam e/ou impedem o estabelecimento de CTEs a partir de embries desses modelos. Com isto em mente, o grupo coordenado pela Dra. Lygia da Veiga Pereira da USP de So Paulo atravs do sub-projeto 6, intitulado Estabelecimento de linhagens de clulas tronco pluripotentes induzidas (iPS) de modelos animais de grande porte, pretende desenvolver uma metodologia para estabelecer linhagens de iPS de modelos animais de grande porte, especificamente de primatas no-humanos e ces. As clulas geradas sero utilizadas em ensaios pr-clnicos de leso de medula espinhal nos respectivos modelos animais. Para este fim: vetores lentivirais da empresa AddGene (EUA) sero empacotados em clulas 293 por co-transfeco transiente com vetores de empacotamento; culturas de fibroblastos caninos e de macacos sero transduzidos com lentivrus expressando o gene reprter GFP para avaliao de eficincia de transduo com diferentes sistemas de empacotamento; transduo dos fibroblastos animais com vetores de induo de acordo com as condies estabelecidas acima, e isolamento de iPS em meio de cultura especfico para CTE (caso no consigamos estabelecer as iPS usando vetores com genes humanos de induo, sero isolados os homlogos de cada espcie por RT-PCR de embries pr-implantao, e novos vetores espcie-especficos sero construdos e utilizados para induo); caracterizao da pluripotncia das iPS por

imunofluorescncia, diferenciao in vitro em corpos embriides e in vivo por ensaio de formao de teratomas; diferenciao neural das iPS animais por cultura

em meio com acido retinico; transplante das clulas diferenciadas em modelos de leso de medula. Apesar de ainda inadequadas para uso clnico, as iPS so uma ferramenta importante de pesquisa bsica, principalmente aquelas clulas derivadas de indivduos com diferentes doenas genticas. Assim, o grupo coordenado pela Dra. Lygia da Veiga Pereira atravs do sub-projeto 7, intitulado Estabelecimento de linhagens de clulas tronco pluripotentes induzidas (iPS) a partir de fibroblastos de pacientes com doenas genticas mendelianas e multifatoriais (com componente gentico), pretende implantar a metodologia de gerao de iPS humanas de forma a poder estabelecer iPS a partir de diferentes tecidos de pacientes com doenas genticas de interesse do grupo, particularmente pacientes com displasia ssea, diabetes tipo I, esclerose mltipla e leucemia promielocitica aguda. As iPS estabelecidas serviro como modelo experimental para o estudo dos mecanismos bsicos por trs das respectivas doenas. Alm disso, sero construdos novos vetores baseados em adenovirus, que no se integram ao genoma, de forma a gerarmos iPS no modificadas geneticamente, mais adequadas para o uso clnico. Com esta finalidade, as seguintes abordagens experimentais sero utilizadas: vetores lentivirais da empresa AddGene (EUA) sero empacotados em clulas 293 por co-transfeco transiente com vetores de empacotamento; clulas

mesenquimais de medula ssea de pacientes com diabetes tipo 1 e de leucemia PMA congeladas sero expandidas em cultura para transduo com vetores virais; padronizao de estabelecimento de linhagem de clulas adequadas para induo a partir de sangue perifrico humano; transduo das clulas humanas com vetores lentivirais e seleo de clulas iPS em meio de cultura de CTEhs; caracterizao das iPS por imunofluorescncia e FACS com marcadores de clulas pluripotentes (OCT4, NANOG, SSEA-1,2,3,4); diferenciao em corpos embriides e

caracterizao por imunofluorescncia; formao de teratomas em camundongos SCID; caracterizao da pluripotncia das iPS por imunofluorescncia,

diferenciao in vitro em corpos embrioides e in vivo por ensaio de formao de teratomas. Apesar das tcnicas de indiferenciao induzida pela incorporao de fatores de transcrio no genoma de clulas somticas (Takahashi e Yamanaka, 2006) constiturem possveis aliados terapia celular autloga, importante ressaltar

neste contexto que a aplicao prtica de clulas induzidas diferenciao pela modificao gentica ainda precisa ser melhor estudada e avaliada (Liu, 2008). Por outro lado, a tcnica de transferncia de ncleo (TN) bem estabelecida e j se mostrou capaz de produzir animais saudveis a termo, confirmando a capacidade eficiente de reprogramao de uma clula diferenciada (Wilmut, Schnieke et al., 1997; Keefer, Keyston et al., 2002). Adicionalmente, quando utilizado como receptor, o citoplasto bovino j se mostrou capaz de reprogramar clulas diferenciadas de diversas espcies (Chen, Wen et al., 2002; Illmensee, Levanduski et al., 2006), suportando o desenvolvimento embrionrio inicial necessrio para o isolamento de clulas-tronco embrionrias. Aliada reprogramao eficiente do citoplasto, a abundncia e facilidade de obteno de material biolgico torna o modelo bovino adequado para o estabelecimento de metodologias eficientes de obteno de clulas pluripotentes de origem embrionria pela reprogramao de clulas somticas diferenciadas de diversas espcies (Cibelli, Stice et al., 1998). Com isto em vista, o grupo coordenado pelo Dr. Flavio Vieira Meirelles da USP de Pirassununga atravs do sub-projeto 8, intitulado Clulas pluripotentes autlogas geradas a partir de clulas somticas diferenciadas, ter como objetivo geral, caracterizar metodologias de obteno de clulas pluri/totipotentes a partir de clulas somticas em termos de morfologia, expresso gnica e estudos epigenticos. Alm de determinar uma metodologia mais adequada no modelo bovino comparando os grupos com o controle e aplic-la no sistema interespecfico. Para esta finalidade, inicialmente ser estabelecida uma linhagem celular somtica bovina derivada do cultivo in vitro de fibroblastos adultos. Uma parte destas clulas ser utilizada na transduo lentiviral de fatores de transcrio responsveis pela indiferenciao celular (Takahashi e Yamanaka, 2006). Tais clulas sero caracterizadas no modelo bovino e, juntamente com as clulas no modificadas, sero utilizadas como doadoras de ncleo no processo de transferncia nuclear. Clulas embrionrias derivadas destes processos sero comparadas entre si e com aquelas somticas indiferenciadas em termos de morfologia, expresso gnica e epigentica. Sero tambm comparadas com as clulas embrionrias obtidas atravs de processos naturais de fertilizao. A metodologia que prover caractersticas mais parecidas com aquelas do grupo controle ser julgada a mais adequada para a produo de clulas-tronco a partir

de clulas somticas diferenciadas e, portanto, ser utilizada no modelo interespecfico, onde sero produzidas clulas pluripotentes de primatas. A reprogramao do ncleo de clulas somticas pelo citoplasma de um ocito implica na combinao entre o genoma nuclear de um indivduo e o mitocondrial de outro. Considerando o grande potencial deste tipo de abordagem no desenvolvimento futuro da terapia celular, o controle da herana mitocondrial de suma importncia para viabilizar i) a produo de clulas-tronco humanas por reprogramao da clula doadora de ncleo em citoplasma no humano e, ii) a produo de clulas-tronco humanas autlogas (Illmensee, Levanduski et al., 2006). Neste sentido, o modelo bovino interessante pela abundncia de material disponvel e pelo grande conhecimento disponvel sobre os mecanismos que regulam a herana do DNA mitocondrial (mtDNA) durante a embriognese. Em embries bovinos produzidos por transferncia de ncleo de clulas somticas, a porcentagem de mtDNA da clula doadora de ncleo aumenta entre o terceiro e o quarto ciclo celular em relao ao mtDNA proveniente do ocito (Ferreira, Meirelles et al., 2007). Por outro lado, a centrifugao de zigotos bovinos possibilita a depleo mecnica de parte das mitocndrias sem comprometer o desenvolvimento embrionrio, pois o embrio capaz de repor o mesmo contedo de mtDNA observado em blastocistos no depletados (Chiaratti et al., 2008). Alm disso, com a depleo mitocondrial possvel introduzir uma maior quantidade de mitocndrias exgenas nos zigotos (Ferreira et al., submetido). Frente ao exposto, o grupo coordenado pelo Dr. Flavio Vieira Meirelles da USP de Pirassununga atravs do sub-projeto 9, intitulado Modelo animal para estudo da herana mitocondrial intra e inter-espcie, ter como objetivo geral, avaliar a viabilidade da produo de embries contendo mtDNA de origem somtica intra e inter-especfico e aumentar a porcentagem herdada deste mtDNA pelos blastocistos. Mais especificamente, pretende-se produzir blastocistos bovinos (Bos taurus) que contenham mtDNA de origem somtica intra (B. indicus) ou interespecfica (Homo sapiens) em heteroplasmia com mtDNA de origem embrionria (herdado do ocito) e; adicionalmente, desenvolver um mtodo para aumentar a porcentagem herdada nos blastocistos de mtDNA somtico (B. indicus ou H. sapiens). Para isso, as seguintes abordagens tecnolgicas sero empregadas: Estabelecimento de linhagens mesenquimais de clulas oriundas de B. indicus e H.

sapiens; enucleao de clulas mesenquimais por centrifugao e fuso dos citoplastos para utilizao como doadores de citoplasma (Shay, Gershenbaum et al., 1975; Marchington, Barlow et al., 1999); produo in vitro de zigotos bovinos (B. taurus) partenogenticos a partir de ocitos aspirados de ovrios coletados em abatedouro e maturados in vitro (Meo, Yamazaki et al., 2007); centrifugao dos zigotos para concentrar as mitocndrias num dos plos do embrio e remoo de parte das mitocndrias por micromanipulao (Ferreira et al., submetido); fuso dos citoplastos (B. indicus ou H. sapiens) aos zigotos depletados (B. taurus) e cultivo in vitro (Inoue, Nakada et al., 2000); determinao da porcentagem de mtDNA (mtDNA somtico em relao quantidade total de mtDNA) mediante PCR em Tempo Real imediatamente fuso, s 72 horas (embries com cinco ou mais clulas) e s 168 horas (blastocistos) aps a ativao partenogentica (Ferreira et al. submetido)(Ferreira, Meirelles et al., 2007). A porcentagem de mtDNA ser analisada considerando como efeito o citoplasto usado (B. indicus e H. sapiens), o momento da anlise (0, 72 e 168 horas) e a interao ambos os fatores.