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8.- Cuantificación de microorganismos por turbidimetria

8.- Cuantificación de microorganismos por turbidimetria

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Explicar el fundamento de las técnicas más utilizadas en el recuento microbiano.
Establecer la cantidad de microorganismos en na muestra mediante la aplicación de diferentes métodos.
Relacionar los resultados obtenidos y explicar las causas que determinan la variación de estos.
Explicar el fundamento de las técnicas más utilizadas en el recuento microbiano.
Establecer la cantidad de microorganismos en na muestra mediante la aplicación de diferentes métodos.
Relacionar los resultados obtenidos y explicar las causas que determinan la variación de estos.

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PRÁCTICA # 1
“  
CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS POR TURBIDIMETRÍA
”  
OBJETIVO:
Explicar el fundamento de las técnicas más utilizadas en el recuento microbiano.
Establecer la cantidad de microorganismos en na muestra mediante la aplicación de diferentes métodos.
Relacionar los resultados obtenidos y explicar las causas que determinan la variación de estos.
INTRODUCCIÓN
Para trabajar con un microorganismo en condiciones definidas en el laboratorio es necesario primero proceder asu aislamiento, es decir a separarlo del resto de las poblaciones con las que coexiste en la naturaleza.Para el aislamiento se de organismos utilizan medios sólidos (agar. Ventajas) o líquidos.·
Medios sólidos:
siembra (extensión o vertido) en placa. Separación e inmovilización de organismos de formaindividualizada en un medio nutritivo sólido. Cada individuo al multiplicarse origina una colonia. Método: dilucionesconsecutivas de la muestra.·
Medios líquidos:
Solo utilizable para aislar la especie predominante en un cultivo mixto. Método de la diluciónlímite.·
Medios selectivos:
Medios que favorecen el crecimiento de un microorganismo específico. Se emplean cuando elorganismo que quiere aislarse se encuentra en forma minoritaria. Pueden utilizarse para:
-
Enriquecer: medios líquidos que tienden a seleccionar los organismos de tasa de crecimiento máselevada entre todos aquellos que pueden hacerlo bajo las condiciones impuestas
-
Aislar directamente: medios sólidos que permiten aislar colonias. Suelen llevar un inhibidor que impideel desarrollo de los demás microorganismos.Los métodos de aislamiento microscópicos tienen poca (o nula) utilidad en Microbiología.El crecimiento de una población o cultivo bacterianos se puede expresar en función de:
Aumento del número de células
aumento de masa del cultivoAmbos tipos de expresiones son equivalentes entre sí en cultivos que estén en
crecimiento balanceado oequilibrado
 (en el que todos los componentes aumentan una misma proporción por unidad de tiempo).
Cuantificación de microorganismos:
Recuento de viables: Se utiliza una técnica similar al aislamiento en placa: diluciones seriadas y siembra enplacas (30-300 bacterias/placa).
Recuento de totales.
Medida del número de células:-
Directo
mediante microscopio (cámaras de recuento de
Newbaver)
.-
Contador electrónico de partículas
(contador de
Coulter 
)
Medida de la masa celular.
-
Turbidimetría (densidad óptica)
. Se utiliza un colorímetro (Repasar la ley de Lamber- Beer: A=
ε
bC, o log Ii/It = k*C). Es el método más utilizado.-
Peso seco
Medida de la masa celular 
Métodos Directos: En estos métodos se requieren preparaciones limpias, sin partículas extrañas.
1) Determinación del peso húmedo:
se tara un tubo de centrífuga; se centrifuga el cultivo y se elimina elsobrenadante; se determina el peso del sedimento.
 
- Inconvenientes: grandes errores, debido al líquido intercelular retenido, cuya cuantía depende a su vez de laforma y tipo de agrupaciones de la cepa, intensidad del empaquetamiento, etc.
2) Determinación del peso seco:
como el anterior, pero el sedimento se seca antes de ser pesado (105ºC, toda lanoche), hasta peso constante. Las medidas de peso seco suelen representar el 10-15% de los valores de pesohúmedo.- Inconvenientes: método tedioso (requiere mucho tiempo) y con bastantes errores: es difícil pesar menos de 1 mgcon exactitud en las balanzas habituales de laboratorio. 1 mg de peso seco equivale a unas 5x10
9
bacterias.
3) Determinación del nitrógeno total:
técnica de micro-Kjeldahl.
4) Determinación de un componente característico:
peptidoglucano, ADN, ARN, proteínas, ATP, clorofilas enorganismos fotosintéticos, etc.Comentarios: se suele usar en bacterias para las que otros métodos más fáciles dan errores debido a que formangrumos no dispersables, crecen en filamentos, etc. Se emplean en determinaciones de crecimientos en ambientesnaturales.
Métodos Indirectos:
1) Medida de consumo de nutrientes o de producción de algún metabolito por unidad de tiempo.
Ejemplos:consumo de oxígeno (QO
2
) y consumo de carbónico (QCO
2
), determinados por el respirómetro de Warburg.Producción de ácidos.
2) Métodos turbidimétricos (ópticos).
 
Son muy usados en la práctica cotidiana del laboratorio. La base común deestos métodos consiste en la medición de la cantidad de luz dispersada o transmitida a través de un cultivobacteriano. Recordemos aquí que las suspensiones bacterianas dispersan la luz, al igual que cualquier partículapequeña suspendida en agua (efecto Tyndall). La dispersión de la luz es, dentro de ciertos límites, proporcional ala masa del cultivo.
a) Espectrofotómetro
: Este aparato es de uso habitual en cualquier laboratorio de Microbiología o Bioquímica.Mide la densidad óptica (D.O.), es decir la absorbancia (una medida de la luz transmitida a través de lasuspensión). Por supuesto, hay que realizar una curva estándar para relacionar los valores de A con la masabacteriana en una muestra problema; La cantidad de luz dispersada es proporcional al cociente entre eltamaño de la partícula y la longitud de onda incidente; la sensibilidad de la técnica aumenta pues a longitudesde onda (
λ
) cortas. La proporcionalidad entre A y masa bacteriana sólo es válida para >10
7
céls/ml.
b) Nefelómetro:
Es un aparato similar al anterior, pero el dispositivo sensor está situado en ángulo rectorespecto de la dirección de la luz incidente, y lo que se mide es pues, la luz dispersada directamente por lapreparación. Posee mayor sensibilidad que el espectrofotómetro.
Método nefelométrico: Determinar la concentración de bacterias en UFC/ml, utilizando la TablaSolución de BaCl
2
al 1,0% mlSolución de H
2
SO
4
al 1,0% mlEscala de McFarlandUFC Millones/ml0,19,94,03000,29,83,76000,39,73,59000,49,63,41 2000,59,53,31 5000,69,43,21 8000,79,33,152 1000,89,23,102 4000,99,13,042 7001,09,03,003 000 
2
 
Diluir la suspensión bacteriana con solución salina estéril al 0,85%, a la transmitancia o turbiedad elegida,de acuerdo con la concentración de bacterias establecida.
Medida del número de individuos
Métodos Directos:
1)
Cámara de recuento de Petroff-Hauser:
 
Consiste en un portaobjetos especial con una graduación en superficie yunas medidas muy concretas: excavación con 0.02 mm de profundidad; área de 1 mm
2
, dividida en un retículode 25 cuadrados grandes; cada cuadrado grande está subdividido a su vez en 4x4 = 16 cuadrados pequeños. Osea, la muestra se distribuye en 16 x 25 = 400 celdillas (cuadros pequeños).La muestra, una vez dispensada entre el porta y el cubre, se deja reposar sobre la plataforma del microscopiodurante unos minutos, y se cuenta el número de células en varias celdillas (normalmente en 16, equivalentes auno de los cuadros grandes). Se anota el número
n
de células observadas en esas 16 celdillas. Entonces, laconcentración celular es fácil de establecer: n x 25 x 50 x 1000 = concentración en células/ml.- Ventajas: es un método muy rápido.- Inconvenientes: sólo sirve para suspensiones relativamente concentradas (>10x10
6
céls./ml). Por debajo de estevalor el mero de lulas vistas en el campo del microscopio es muy pequo y poco significativoestadísticamente. En bacterias móviles, hay que inmovilizarlas previamente, con una mezcla de alcohol y agua.
2) Contadores electrónicos de partículas (tipo Coulter):
 
Se hace pasar una suspensión microbiana por un tubocapilar, entre los dos polos de una corriente eléctrica. Cada vez que por un orificio (30
µ
m diámetro) pasa unapartícula (p. ej., bacteria) se interrumpe la corriente, lo cual es recogido por un dispositivo de registro electrónico,que detecta el número y el tamaño de las partículas que van pasando. (El tamaño detectado es función de laintensidad del pulso de voltaje al paso de la partícula). Hay que usar suspensiones absolutamente libres departículas extrañas (las pequeñas serían contabilizadas erróneamente como bacterias, y las mayores puedenobturar el orificio del aparato).
Métodos Indirectos
1)
Recuento de viables en placa:
Los métodos de recuento de número de células que hemos visto hasta ahora (losdirectos) no distinguen entre células vivas y muertas. En muchos casos conviene contar las células vivas, y estoen laboratorio se suele hacer mediante el recuento de viables. (Una célula se define como viable cuando,colocada en un medio adecuado, es capaz de dividirse y dar descendencia). El método habitual de lograr estoes sembrar pequeñas alícuotas de diluciones adecuadas de un cultivo original sobre placas de Petri con mediosólido (con agar). Cada célula viable dará origen a una colonia visible después del tiempo adecuado deincubación. Contando las colonias visibles, teniendo en cuenta la dilución de la que proceden y el volumen dealícuota utilizado, es fácil deducir el número de células viables en la suspensión original.Precauciones: para minimizar los errores estadísticos de muestreo, se recomienda sembrar 5 placas de cadadilución; hay que usar pipetas nuevas en cada dilución; contar las placas donde existan entre 50 y 300 colonias.Como no podemos garantizar que cada colonia no proceda de más de un individuo (y esto es especialmentecierto para bacterias que forman agrupaciones de 2 o más células), el recuento se refiere no a “células viablesreales” sino a “unidades formadoras de colonia” (UFC). Por lo tanto, una UFC corresponde, como mínimo, a unabacteria, pero sobre todo en bacterias con agrupaciones, la medida por siembra en placa infravalora el númeroreal de individuos, porque cada UFC puede corresponder a dos o más individuos que estaban juntos al ser sembrados en la placa.
2) Recuento sobre filtros:
 
Se usa para suspensiones diluidas de bacterias. Se hace pasar un gran volumen desuspensión a través de una membrana de nitrocelulosa o de nylon estériles (con un diámetro de poro que retienelas bacterias pero permite el tránsito de sustancias). Posteriormente, el filtro se deposita sobre la superficie de unmedio de cultivo sólido. Las colonias se forman sobre el filtro a partir de las células retenidas. Dichas colonias secuentan, deduciéndose la concentración original de viables en función del volumen de suspensión que se hizopasar por el filtro.
MATERIAL
3

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