Populaiile Limfocitare Markerii de Suprafa

CURSUL VIII

 Limfocitele reprezint 25-35%, aprox 15003000 de elemente pe mm, din totalul elementelor figurate sanguine. Din pdv morfologic ele pot fi mprite n: Limf mici, care sunt populaia limfocitar majoritar, 80-85%, cu diametre de 6-9 m, raportul nucleu / citoplasm > ca 1. n aceast categorie se includ limf B i T Limf mari, 15-20% din total, au diametrul de 10-15 m,raportul nucleu /citoplasm > ca 1 , dar citoplasma este mai bine reprezentat, conine granulaii azurofile evidente n microscopie: se numesc LGL (Large Granular Lymphocytes). n aceast categorie includem cel NK (natural killer)
2

 Distincia dintre Ly T i Ly B nu se face pe criterii morfologice, ci cu ajutorul unui test funcional: testul rozetrii.

Principiu: punnd n contact Ly, separate ntr-o etap anterioar prin gradient ,cu eritrocite de berbec sau oaie, singurele care
formeaz conglomerri celulare i reacioneaz

sunt Ly T, formnd rozete.

Ly T rozeteaz pt c ele prezint pe suprafa receptori de adeziune celular, cel mai important fiind CD2.
3

 Ly T nu sunt omogene ca clas celular, ci este vorba de o populaie heterogen,cu 4 subtipuri : limfocitele T helper (Ly Th) limfocitele T supresoare (Ly Ts) limfocitele T contrasupresoare (Ly Tcs) limfocitele T citotoxice (Ly Tc). Nu sunt diferite morfologic, distincia se face prin metoda de flaucitometrie, sau citometrie n flux: evidenierea cu ajutorul Ac monoclonali a unor receptori ce sunt markerii definitorii la suprafaa Ly T.
4

Ly T i Markerii de suprafa
Caractere generale

Ly T reprezint populaia limfocitar majoritar, 60-80% din Ly aflate n sngele periferic, au durata de via lung sau f lung, de rndul anilor sau zecilor de ani. Sunt celule intens recirculante, parcurg anumite circuite n cutarea Ag pt care sunt genetic construite. Testul rozetrii permite identificarea Ly T, numrtoarea global a Ly T, separarea de alte Ly prin centrifugare.
5

Markerii de suprafa ai receptorilor definitorii

CD este nomenclatura de catalog a receptorilor de suprafa i nseamn clas de difereniere. Alte titulaturi descriptive sunt: LFA = antigen asociat funciei leucocitare ICAM = molecule de adeziune intercelular VLA = antigen cu apariie foarte trzie
6

Receptorii de recunoatere antigenic

Caracterele recunoaterii antigenice efectuate de Ly T: Ly T recunosc Ag numai dup structura lor primar Ly T recunosc Ag dup secvena aminoacidic a epitopilor, nu recunosc Ag dup conformaia n spaiu Ly T recunosc doar Ag prezentate n complex cu moleculele MHC pe suprafaa APC Ly T nu recunosc niciodat Ag n stare solubilizat Recunoaterea este asociativ
7

Complexul TCR-CD3
Pe membrana unui Ly T aflat n repaus se afl ntre 60 i 100 de mii de asemenea complexe. TCR Este un heterodimer, are 2 lanuri diferite ce se asociaz ntre ele: un lan cu greut de 45 kd, genele ce codific acest lan se afl pe cro 7 i un lan , cu
greut de 40 kd, genele ce codific acest lan se afl pe cro 14

Lanurile i sunt transmembranare, capetele C (carboxi-terminale) se afl n interiorul celulei, astfele se separ 3 segmente cu funcii distincte: extracelular, transmembranar, intracitoplasmatic. Segmentul extracelular: are dispoziie Ig-like, cu 2 bulcle i 2 domenii, cu aproximativ 110 aminoacizi.
8

 Cele 2 bulcle sunt constituite din secvene aminoacidice hipervariabile i se numesc V (variabil ) i respectiv V, iar celelalte 2 bucle (situate spre membran) au secvene constante, numindu-se C i C. V i V sunt alctuite dintr-o cavitate ce se mai numete i situsul combinativ pt Ag. Domeniile V, V nu angajeaz legturi prin ntreaga lor secven,ci doar prin mici segmente de 8-15 AA ce provin n urma plicaturrii V, V i protruzionnd ctre interiorul cavitii, aceast secven se combin cu Ag prin potrivire:
regiuni determinante ale complementaritii = CDR
9

10

11

 Cele 6 CDR angajeaz legturi difereniate cu moleculele de Ag, coopereaz cu APC ce prezint un epitop pe moleculele MHC. CDR 1 i CDR 2 angajeaz legturi cu molec MHC, recunoscnd doar domeniile polimorfe
(din MHC 1 domeniile 1, 2, din MHC 2 domeniile 1, 1).

CDR 3 angajeaz legturi cu epitopul. Prin TCR se recunosc i MHC i epitopul, deci se face o recunoatere antigenic
12

asociativ intrareceptorial.

13

 Lanurile i se asociaz cu legturi disulfurice, de aceea se formeaz heterodimerul, i rezult o poriune dotat cu maximum de mobilitate (baleiere), ce favorizeaz recunoaterea antigenic,numit zona balama (hinge engl) Segmentul transmembranar are aminoacizi, cu dispoziie helicoidal. 22-25 de

Segm intracitoplasmatic este f scurt, are 5-12 AA TCR are rol n recunoaterea antigenic, este responsabil pt generarea unor semnale activatoare, centripete, ctre centrul celulei, ctre sist enzimatice. Transducia semnalului se face prin complexul CD 3
14

15

 Este un complex pentameric, cu 5 lanuri transmembranare, dintre care 3 lanuri scurte cu 20-25 kd greutate, genele codificatoare pe cro 11, denumite (khi), , i 2 lanuri identice, f subiri, efilate, lungi, ce ptrund mult n Ly T, cu greutatea de 16 kd, genele codificatoare pe cro 1, numite (zeta). n realitate , prin asocierea TCR-CD3 se formeaz un complex heptameric, cu CD 3 responsabil de transducia semnalelor ctre sistemul enzimatic de profunzime.
16

CD 4
Este distribuit caracteristic pe Ly Th , care se numete i Ly T CD 4+. Este o glicoprotein transmembranar, exprimat pe cro 12,cu capul N(amino-terminal) extracelular. Segmentul extracelular are 4 bucle de AA, are segment transmembranar i intracelular f. lung.
Funciile: Prin segmentul extracel se produce cooperarea dintre Ly Th i APC, CD4 angajnd legturi cu molec MHC II i recunoscnd domeniul monomorf MHC II (2). Prin segmentul intracitoplasmatic are rol n activarea Ly Th, are contact fizic cu o enzim important: protein kinaza p56 (PK56), numit i kinaza specific leucocitelor (lck).
17

CD 8 Este prezent pe suprafaa Ly Tc, Ly Ts, numite i Ly T CD8+. Este o glicoprotein transmembranar, heterodimeric, cu greutate de 72 kd, genele codificatoare sunt pe cro 2, lanurile se numesc , , cu segmente intracelulare f. lungi. Funciile: Segmentul su extracelular, cu 2 bucle , , face cooperarea dintre Ly Tc sau Ly Ts, i APC, realizndu-se legturi cu moleculele MHC I prerzente la suprefaa APC, se recunoate domeniul monomorf 3.
18

19

Recunoaterea asociativ

20

 Recunoaterea asociativ este dubl, intrareceptorial i interreceptorial: prima este ntre TCR i CD3, iar a doua este ntre TCR i CD4 sau CD8. Complexul angajeaz un nr de 2 legturi cu Ag: prin TCR cu CDR3 V, CDR 3 V; 4 legturi prin TCR cu CDR 1 V, V, cu CDR 2 V, V i nc o legtur cu CD4 sau CD8 deci 5 legturi. n concluzie Ly T este mai interesat de structurile prezentatoare de Ag dect de Ag. n realitate Ly T recunosc doar Ag membranare, iar din totalitatea lor doar anumite categorii.
21

22

Concluzii:
Ag ataate sunt recunoscute de Ac
Ag constitutive sunt recunoscute de Ac, celule NK

Ag prezentate de MHC sunt recunoscute doar de Ly T Ly T recunosc numai Ag prezentat de MHC n funcie de MHC se dau rspunsuri imune diferite: MHC I RIU; MHC II i MHC II RIC
23

Receptorii cu rol accesor n activarea Ly T CD28

24

 CD28 se afl pe suprafaa Ly Th i Ly Tc, este o glicoprotein transmembranar, cu greutatea de 50 kd, homodimer.

Poatre fi activat n momentul n care angajeaz legturi cu un contraligand prezent pe suprafaa APC: CD80, rezultnd semnale activatoare. Cd 28 este responsabil de stimularea interleukinelor, citokinelor, Ly Th, Ly Tc . Rezultatul stimulrii CD28 este stabilitii ARN mesager pt interleukine i citokine.
25

CD45 Este o glicoprotein transmembranar, cu greutate de 180-240 kd, prezent pe membrana tuturor celulelor de origine hematogen, cu excepia eritrocitelor i a plachetelor. Pe membrane Ly Teste foarte bine reprezentat, ca suprafa atinge cam 10% din membran. Se afl n complex cu lanurile (csi) din CD3, deci se activeaz n urma activrii CD3 i devine o protein fosfataz ce mpreun cu protein kinaza formeaz un cuplu f activ (protein tirozin
fosfataz).
26

Receptori de adeziune intercelular

Au ca funcie major stabilirea de contacte ntre APC i Ly T , fapt important pt cooperrile dintre aceste celule.

27

CD2 Este prezent pe toate Ly T, este prezent i pe celulele NK. Este o glicoprotein transmembranar, cu greut de 50 kd, n segm extracelular are 2 bucle, un segment intracelular f lung. Funciile segmentului extracelular sunt acelea de contact cu un contraligand reprezentat de LFA3 (CD58) o legtur prin complementaritate. Are contribuie n pregtirea activrii Ly T, prin segmentul intracelular ce se afl n contact cu fosfolipaza C. Activarea se face astfel: modificarea conformaional de segment intracelular CD2 ce produce alunecarea PLC spre suprafaa membranei unde activeaz cascada inozitol hexafosfat(IP6) i aa mai departe. CD2 este prezent pe suprafaa Ly T numite naive, adic cele care nu au ntlnit nc antigenul. Cuplul CD2-LFA3 este considerat un cuplu de adeziune celular de linia I, adic sunt primele legturi celulare ntre APC i Ly T, avnd o f mare afinitate ntre receptori. 28

LFA1 Este un heterodimer, cu un lan (CD11a), cu greutate de 95 kd i un lan (CD18) cu greut de 180 kd; cele 2 lanuri prezint cte 2 bucle aezate simetric Funcia: LFA1 are legturi cu moleculele din clasa ICAM , este un receptor de adeziune larg ntlnit: pe Ly T, mai ales pe cele cu memorie, Ly B, celule Nk, membrana PMN. Cuplul de adeziune LFA1 ICAM este un cuplu de linia a doua, sunt legturi instabile, LFA1 are afinitate sczut pt ICAM dac Ly T este neactivat.
29

Funciile receptorilor de adeziune:

Receptorii de adeziune permit contacte intime ntre membranele celulare permind cooperarea intercelular, sunt nvinse forele de respingere electrostatic.
Aceste cupluri realizeaz un efect de fermoar, apoziie intim pe suprafee f mari, permite o
cooperare intim,favorizeaz net recunoaterea Ag

Datorit apoziiei receptorii MHC i TCR difuzeaz prin membran pn ajung fa n fa.
30

Clasificarea fenotipic a Ly T Ly T CD3 CD4 CD8 CD28

Ly Th Ly Tc Ly Ts

31