Anlisis bsico del semen

Rosa Pello Gutirrez Elisa Ramrez Mendoza

Hospital 12 de Octubre

Que es Liq. Seminal ?

Espermatozoides Suspendidos en secreciones:

testculo y el epiddimo.

Se junta con secreciones:

Prstata, vesculas seminal y las glndulas bulbouretrales

Dando lugar a un liquido viscoso denominado eyaculado

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Los parmetros analizados en el semen reflejan :

la funcin exocrina de las glndulas sexuales masculinas y nos orientan sobre patologas del sistema genital.

Al

sufrir una transformacin desde el momento de la eyacualcin, para su estudio correcto:

Debemos

tratar la muestra con unas condiciones adecuadas y estandarizadas para evitar sesgos artificiales.

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Gran

variabilidad biolgica: 2 muestras de semen que difieran entre 1 y 3 semanas. Si los resultados discrepan seria necesario una 3 muestra.

Por

ser un fluido biolgico (sangre, LCR), debe ser tratado con precaucin en el laboratorio, para evitar posibles contaminaciones (VIH, Hepatitis..)

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Obtencin de la muestra

Por masturbacin el mismo da del examen Frasco de vidrio o de plstico atemperado 20- 40 C, de boca amplia Slo una eyaculacin Se recomienda: abstinencia de 3-7 das. Maximizar la calidad de la muestra. Y reducir la variabilidad Lo ideal: recoger la muestra en un cuarto cerca del laboratorio. Evitar choque trmico (20 - 40 C). Entregarlo lo antes posible (1h). Hacer hincapi: Evitar la perdida. Lavarse bien las manos y genitales antes. No utilizar preservativo ni el coitus interruptus. Usar frascos estriles.
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Formulario para el paciente

Nombre. Periodo de abstinencia. Fecha y hora de recoleccin. Si toma medicacin: Deber hacerse hincapi en que informen de si toman frmacos, enfermedades concomitantes (fiebre), ejercicio fsico intenso y situaciones de estrs. Si fuma, o si tiene hbitos txicos y tiempo de abstinencia.

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 Examen

La OMS divide el estudio del semen

1.Examen macroscpico: licuefaccin, aspecto, volumen, viscosidad, pH. Concentracin de esp. y otras clulas. Motilidad Estudio microscpico Vitalidad. Morfologa espermtica. Presencia de aglutinaciones. Deteccin de anticuerpos antiespermatozoide unidos a la superficie esp.

bsico

Opcional Avanzados
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Opcional

ndice de teratosrpermia. Test hipoosmtico. Cultivos seminales. Anlisis bioqumico de Lquido Seminal. Anlisis automtico de la movilidad espermtica. Test del Hmster.

Avanzados
Test

de funcin espermtica: Especies reactivas de oxgeno. Test de la zona pelcida. Evaluacin de la reaccin acrosmica. Anlisis automtico de la morfologa espermtica. Tcnicas de recuperacin de espermatozoides mviles: Swim-up. Gradientes de densidad.
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1.Examen macroscpico
Licuefaccin:

Se licua a temperatura ambiente (15-60 min). Al recibirla: incubar a 37C durante 20-25 min.(1h) Y agitar (no vortex) Determinamos si esta licuado.
37C Si sigue sin estar licuada: Observar: grumos, hebras, cogulos. Liquido anormal. Sin importancia clnica, interfiere en el anlisis del semen. Utilizar; digestin enzimtico, tampn fosfato 1:1, medio de cultivo. Referir los resultados a volumen inicial. Y si es para TRA, medio estril, y no usar digestin enzimtico. Hospital 12 de Octubre

1.Examen macroscpico

Aspecto:

Observaremos despus de la licuefaccin. Color normal: nacarado o gris opalescente.

37C

Color rojizo o marrn (hemates). Color amarillento (ictericia, alta vitamina B2) o alta nivel de flavoprotenas oxidadas de vesculas germinales (elevada abstinencia).
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1.Examen macroscpico

Volumen:

Volumen referencia: > 2ml

Para medirlo: Tubo graduado de 15 ml, cnico, tipo Falcon, con tapa hermtica, testado para txicos celulares. V < 2ml: hipospermia u oligospermia. Cuando existe orgasmo y no eyaculacin tras la masturbacin nos encontramos ante una aspermia (ausencia de eyaculado) Aspermia sospecharemos de una eyaculacin retrgrada.

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Protocolo para el estudio de los espermatozoides de los pacientes con eyaculacion retrgrada

La OMS no tiene recomendaciones. Noche anterior a la recogida de la muestra: ingerir una cucharada sopera de bicarbonato sdico Con ello alcalinizamos la orina y evitamos al mximo el dao de los espermatozoides Pues muchas veces estos son utilizados para TRA. El da de la recogida: Orina, mide osmolaridad y pH. Seguidamente se toma 4 gramos o 2 cucharadas soperas de bicarbonato sdico, y agua litro, 750 ml diabticos. Se espera, recoge orina: osmolaridad de 350-400 miliosmol/Kg y pH 7.2-8. Entonces se recoge orina postorgasmo en frasco con medio de cultivo. Hacemos alcuotas, centrifugo 600g, 8 minutos y procedimiento habitual.
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1.Examen macroscpico

Viscosidad

Valor de referencia: gotas, o se forme un filamento < 2cm.

Diferenciarlo licuefaccin Cogeremos una pipeta Pasteur con semen y dejaremos caer su contenido

Si fuera mayor, anotaremos viscosidad anormal. Y lo trataremos: aadiendo medio tampn

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1.Examen macroscpico

pH

Valor de referencia: pH > 7.2

pH: c infeccin

Utilizando tiras reactivas de rango 6.4-8.0 1 gota de semen en la tira y 30 seg. Comparamos color con la escala de colores

pH <7.2 + azoospermia, sugiere obstruccin de conductos eyaculadores o agenesia bilateral de deferentes

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2.Motilidad espermtica

Tipos de motilidad: Tipo a: movilidad rpida y progresiva, > 25 micrometros/seg a 37C, 5 veces la cabeza en 1 segundo. Tipo b: movilidad progresiva lenta o perezosa Tipo c: movilidad no progresiva, < 5 micrometros/seg, 1 vez la cabeza por segundo Tipo d: inmvil

Valor de referencia (60 minutos):

> 50% de los espermatozoides con movimiento tipo a + b. >25 % con movilidad tipo a. < 50% Astenozoospermia

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2.Motilidad espermtica

10 microlitros Porta atemperado 37C Se deja estabilizar unos 60 seg.

Observamos a 100 aumentos muestra homognea. A continuacin pasamos a 400 X con contraste de fase. Contamos, 1 los mviles tipo a y b, y a continuacin los c y d.

Tipo a: 3% Tipo b: 32% Tipo c: 5% Tipo d: 60%

Se contaran 200 esp. en un porta, con contador de laboratorio. Repetimos con otro porta.
Tipo a: 20% Tipo b: 40% Tipo c: 5% Tipo d: 35%
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2.Motilidad espermtica

Valoraremos si la diferencia entre los contajes esta dentro del 95% de i.c. de error debido al azar.

Tipo a: 3 y 20% Tipo b: 32 y 40% Tipo c: 5 y 5% Tipo d: 60 y 35%

M: 47.5% D:25%
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2.Motilidad espermtica

En el momento de la valoracin, pueden surgir inconvenientes: Las colas sueltas no se cuentan. Puede a ver aglutinaciones. La muestra este muy concentrada. En muestras muy viscosas pueden producirse falsas astenozoospermias De todos modos, lo conveniente es q los miembros del equipo que se van a dedicar al contaje, se entrenen a travs de videos para poder realizar un control de calidad. Mtodo alternativo:

ASAC, CASA: incluye el anlisis de espermatozoides asistido por computadora

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3.Vitalidad espermtica

Nos permite evaluar los espermatozoides vivos. Segn la OMS se estudiara cuando la < 50% movilidad Se hace de manera indirecta, estudiando el estado de la mmb.

Los vivos tiene la mmb plasmtica intacta y los muertos daada. Tincin supravitales, eosina negrosina. y los basados en la capacidad osmorreguladora de la membrana: Solucin hipoosmtica, 37C, 5min.

Valor de referencia > 60% hinchados

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4.Aglutinaciones y agregaciones

cabezas, colas, cabeza-cola. Agregacin: unin de esp. a espermatozoides inmviles, generalmente muertos, a otras cl, a restos, fibras mucosas.

Aglutinacin: visualizacin de espermatozoides mviles unidos por las

Se valora a la vez que la movilidad Se anota en el seminogramas con una escala semicuantitativa: No aglutinacin (-), pequeas aglutinaciones pueden ser normales (< 10%) Totalidad (+++) La presencia de aglutinaciones: sugiere presencia de anticuerpos, causa inmunolgica de infertilidad, infeccin, aparece con + frecuencia en eyaculados hiperconcentrados.
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5.Morfologa espermtica

Tcnica de tincin recomienda: Papanicolau, Shorr, Diff-Quick. Cabeza: azul Pieza intermedia: rojiza Cola: azul o rojiza Deben de evaluarse 200 espermatozoides. 2 extensiones. Observar con objetivo de inmersin. Slo se cuentan los espermatozoides completos. y valorar la diferencia de los porcentajes y este debe de estar dentro del 95% de i.c. de error debido a azar.

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Criterios de la OMS 1999

Cabeza Forma Acrosoma Longitud Anchura Pieza intermedia Longitud Anchura Forma Flagelo
Restos citoplasmticos en la pieza intermedia Ovalada Bien definido, ocup 40-70% de la cabeza 4-5micras 2.5-3.5 micras 1.5 * L cabeza < 1 micra Delgada unida axialmente a la cabeza

Recto, uniforme, + delgada P intermedia. Desenrollado. 45 micras

< 1/2 cabeza

Valores limitantes % de normalidad

Se consideran anormales > 15% para FIV

Morfologa anmala.

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6.Concentracin espermtica

Valor de referencia: > 20 millones /ml.

Para medir la concentracin espermtica la OMS recomienda:
Contaje 400x <15 15-40 40-200 >200 Dilucin 1:5 1:10 1:20 1:50 Semen, microL 100 50 50 50 Diluyente microL 400 450 950 2450

Diluyente es una solucin fijadora: solucin salina + formalina

Si

hay menos de 2 *campo, centrifugo 3000g, 15 minutos. y anotaremos < 2 millones*campo, y si son mviles, o no.
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6.Concentracin espermtica

Hemocitmetro: cmara de NEUBAUER Improved.

M de contraste de fases (200 a 400x) Solo espermatozoides completos. Se debe de realizar por duplicado

Makler, Microcell.

< 10 esp * cuadro grande: contamos 25 cuadros 10-40 esp: contamos 10 cuadros > 40 esp: 5 cuadros

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Si contamos: 230 espermatozoides Dilucin 1:20 Hemos contado 10 cuadros

Para

determinar la concentracin en millones /ml.

Factores de conversin
N de cuadrados grandes contados

Dilucin
1:5 1:10 1:20 1:50

25
20 10 5 2

10
8 4 2 0.8

5
4 2 1 0.4
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230/2= 115 millones/ml.

7.Cel redondas

Cl epiteliales, las de la espermatognesis y leucocitos. Valor normal < 5 millones/ml

La concentracin de estas clulas se puede medir directamente a partir de la siguiente frmula
C

= (N x S)/100 N = 10 clulas inmaduras 100 espermatozoides contados S = 20 millones de espermatozoides/ml C = (10 x 20) /100 =2 millones de clulas/ml

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leucos, son indicativos de infeccin (cultivo), y mala calidad espermtica.

No debera exceder 1 milln/ ml. Las tcnicas para la deteccin esta basada en la presencia:

de la peroxidasa intracelular de antgenos especficos de leucocitos

clulas inmaduras, desordenes de la espermatognesis:

Hipoespermatognesis,

de Sertoli. Para diferenciarlas de los leucos tincin Bryan-Leishman, diferente morfologa, y ausencia de peroxidasa. Asocia xito FIV.
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varicocele, alteracin de las clulas

Resumiendo
Normalidad Volumen Viscosidad Licuefaccin pH Concentracin esp N esp eyaculados Movilidad Morfologa Vitalidad
> 2ml

Anomala
Aspermia:ausencia de eyaculado Hipospermia <2ml

< 2cm Completa > 7.2 > 20 millones esp/ml > 40millones esp > 50% tipo a+b < 15% anormales FIV > 75% de formas no teidas
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Astenozoosspermia Teratozoospermia

Estudio de post-vasectomas

Solo determinaremos el volumen, pH <7, recuento. Segn la Sociedad Britnica de Androloga: Pasado 3-4 meses Y 24 eyaculaciones La OMS requiere un examen exhaustivo de todo el sedimento obtenido por centrifugacin durante 15 min a 800g, para clasificar a un paciente de azoosprmico. Debido a que la imprecisin de la cmara es alta. No debe indicarse 0 espermatozoides Mejor no se observan espermatozoides Dilucin 1:1, Nebubauer Improved, afirmar 95% seguridad Que tiene < 30.000 espermatozoides / mL

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Tcnicas de recuperacin espermtica 1.SWIM-UP

Tcnica de seleccin que se basa en la capacidad de los espermatozoides con movilidad progresiva para desplazarse en un medio de cultivo adecuado Se recuperan menos pero ms mviles Echamos medio de cultivo 1:1 lavamos Centrifugacin 10 min, 500g Echamos medio de cultivo Lo dejamos a 37C Desde 30- 90 min

Elimino sobrenadante

botn

REM Se hace recuento espermtico

Recupero el sobrenadante
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Tcnicas de recuperacin espermtica

2. Gradientes de densidad
Seleccin de los mejores que pueden vencer los gradientes y llegar al fondo del tubo. Gradientes discontinuos, disminuyen a saltos. 3 capas (45/ 70/ 90), 2 capas (45/ 90) Volumen de la capa es variable: 0.3/ 0.5/ 1.0 mL. Centrifugamos 5 min, 300-600g, recogemos el botn del fondo.

Lavamos, centrifuga 5min, 300-600g.

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8.Anticuerpos antiespermatozoides (AAE)

Ensayo obligado en cualquier seminograma bsico Presentes hasta en el 40% de los casos de infertilidad inexplicada Origen femenino o masculino Barrera inmunolgica : produccin de Ac al entrar en contacto con el sistema inmune Causas masculinas:

trauma (vasectoma) reacciones inflamatorias criptorquidia...

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Efectos:

Aglutinacin Efecto citotxico Dificultad de paso a travs del moco cervical y la unin y penetracin de la zona pelcida Ig G: por trasudacin desde la sangre Ig A: producidas por las clulas inmunolgicas afincadas en el tracto genital

Tipos:

Pruebas para la deteccin de AAE adheridos a la membrana espermtica:

IBT IBT MAR MAR

-Identificar presencia de AAE -Caracterizar los isotipos -Cuantificar la respuesta inmune

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 MAR:

de ltex Empleo de semen completo

Partculas

IBT:

de poliacrilamida Lavado previo del semen

Matriz

- Normalmente no existen IgA, si no existe Ig G: como screening es suficiente la prueba de la IgG como screening.

Clculos y resultados:

Contar al menos 200 espermatozoides mviles Resultado expresado en % de espermatozoides mviles que Cuando > 50% se considera que existe factor inmunolgico

llevan partculas unidas

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Parmetros bioqumicos: interpretacin prctica

Semen: suspensin de clulas reproductivas en un
lquido complejo llamado plasma seminal

Los componentes del plasma seminal se mezclan durante la eyaculacin y son el resultado de la secrecin de diferentes glndulas exocrinas.

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Prstata: Prstata

ubicacin: debajo de la vejiga urinaria produce una secrecin opaca blanquecina pH cido (pH: 6.2-6.8) 30% del volumen total Secreciones:

c. ctrico fosfatasa cida Espermina Albmina Zn Liquefaccin Movilidad espermtica

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Funcin:

Vesculas seminales:

Situacin: detrs de la prstata Secrecin opalescente viscosa ligeramente amarillenta 60% del volumen total pH alcalino Secreciones:

Funcin:

Fructosa PG Lactoferrina Bicarbonato Fibringeno

Produccin de ATP Motilidad y viabilidad

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Epiddimos: dimos

Lleva espermatozoides de los testculos a los vasos deferentes Mide 3.8 cm de longitud Dividido en:

Cabeza Cuerpo Cola Alfa glucosidasa Carnitina

Secrecin:

Funcin: Maduracin de los espermatozoides. Trnsito: 10 14 das Almacenamiento: 1 mes

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Cambios del espermatozoide en el epiddimo:

Disminucin de la gota citoplasmtica en la pieza intermedia Cambios elctricos en la superficie de membrana Aumento del contenido de AMPc Modificacin de la forma del acrosoma Adquisicin de protenas de superficie Estabilizacin de la cromatina nuclear

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Glndula de Littr:

Localizacin: mucosa uretral posterior Produccin de un lquido mucoso Localizacin: debajo de la prstata Secrecin alcalina Secreciones:

Glndulas de Cowper:

Mucoproteinas Galactosa c. oxlico Limpia la uretra Lubrica la mucosa uretral

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Funciones:

Distribucin de los marcadores bioqumicos del plasma seminal en eyaculacin fraccionada

-Primera fraccin:
-Prosttica -Epiddimos -Espermatozoides

-Segunda fraccin:
- Vesculas seminales

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A pesar de la gran cantidad de sustancias presentes, ninguna aporta mayor informacin que el anlisis directo del nmero y caractersticas funcionales del espermatozoide Algunos parmetros bioqumicos representativos de la funcin de las principales glndulas son suficientes para diagnosticar los principales sndromes asociados a la infertilidad masculina OMS: Zn, fructosa, - glucosidasa Medicin del pH y del volumen seminal

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Funcin de las vesculas seminales: -Fructosa -Fructosa corregida Funcin de la prstata: -cido ctrico -Zinc -Fosfatasa cida Funcin del epiddimo: -Alfa glucosidasa

Sustancia
Zn Citrato Fosfatasa cida Fructosa -glucosidasa

Lugar de produccin
Prstata Prstata Prstata Vesculas seminales Epiddimo

Valor de referencia
> 2.4 mol/eyaculado > 52 mol/eyaculado > 200 U/eyaculado > 13 mol/eyaculado > 20 mU/eyaculado

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Marcadores bioqumicos de la maduracin espermtica

Maduracin: cambios bioqumicos producidos en la
espermiognesis y en la migracin de los tbulos seminferos al epiddimo:

remodelado de la membrana: motilidad desarrollo de la reaccin acrosmica remodelado nuclear cambios funcionales fuera del testculo: capacitacin

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Maduracin testicular:

ROS : produccin de radicales libres de oxgeno Cociente de isoformas de CK :

CK-MM CK-BB + CK-MM

maduracin

Contenido de DHA : disminuye segn avanza la

Capacitacin:

salida de colesterol de la membrana entrada de Ca adenil-ciclasa AMPc proteinkinasa A fosforilacin de Tyr en protenas flagelares
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Hiperactivacin espermtica :
Adenil ciclasa AMPc Fosforilacin Tyr

Cambios en el patrn de motilidad: VSL VCL y AHL

Test positivo si 30% espermatozoides:

- VCL > 150 m/sg y/o - ALH 6 m

Fosforilacin de Tyr Contenido G 6P Contenido NADPH

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Control de calidad en el estudio espermtico

Control de calidad: conjunto de procesos dirigidos a asegurar la fiabilidad tcnica Tipos de pruebas:

Diagnstica: concentracin, movilidad, morfologa Teraputica: tcnicas de recuperacin para FIV Analtico: detectar y minimizar los errores de medida Biolgico: asegurar la viabilidad de los espermatozoides

Control de calidad:

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CC analtico interno:
- Distribucin aleatoria de los espermatozoides - Error de contaje: Uso de n de espermatozoides representativos Cansancio del tcnico, materiales en condiciones no idoneas... - CC interno: minimizar al mximo la imprecisin
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Imprecisin

Inexactitud

1-5% de las muestras trabajadas CC interno:

- Nivel intra-individual: realizar todas las muestras por duplicado. Si la diferencia es mayor que el error de contaje establecido, rechazar la medicin. - Nivel del observador: instruir al nuevo personal realizando mediciones en paralelo hasta que no existan desviaciones sistemticas - Seguimiento continuo de los resultados mediante el procesamiento de especmenes conocidos: material de control muestras de pacientes vdeos
Diario: ensayo por duplicado Semanal: anlisis por diferentes tcnicos Cuatrimestral: CC externo y calibracin de pipetas Anual: calibracin de cmaras de contaje
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1er contaje: 15 2 contaje: 30

total: 45

1er contaje: 20 2 contaje: 25

total: 45

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CC externo:

CC interno y externo complementarios Analizar las muestras de CC externo como si fueran muestras de rutina Muestras que abarquen la totalidad del rango clnico
-

concentracin: 3-30 mill/mL movilidad: 10-40% morfologa: < 20% de formas normales

Muestras procedentes de varones seronegativos para VIH y hepatitis 1999: primer programa de calidad externo

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CC biolgico:

Asegura la viabilidad de los espermatozoides que se usarn en FIV CCB interno: aseguran el adecuado funcionamiento e inocuidad de los aparatos y materiales:

supervivencia espermtica o test de los embriones de ratn

T: estufas, incubadores [CO2] Humedad Toxicidad de medios de cultivo, pipetas: test de

CCB externo: evalan la capacidad del laboratorio para detectar materiales y medios txicos para el espermatozoide

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Muchas gracias por escucharnos.

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