II. ELEKTROFORESIS PADA GEL AGAROSE 2.

1 Pendahuluan Elektroforesi gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometer massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut. Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked) yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan protein atau asam nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan. Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well) pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya. Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah menuju elektroda positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang

dimilikinya. Untuk menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida digunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif. Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, perak, atau pewarna "biru Coomassie" (Coomassie blue) dapat digunakan untuk keperluan ini. Jika molekul sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya setelah "diwarnai" dengan etidium bromida), gel difoto di bawah sinar ultraviolet. Jika molekul sampel mengandung atom radioaktif, autoradiogram gel tersebut dibuat. Pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel akan tampak setelah proses pewarnaan; satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari "sumur" gel. Pita-pita yang berjarak sama dari sumur gel pada akhir elektroforesis mengandung molekul-molekul yang bergerak di dalam gel selama elektroforesis dengan kecepatan yang sama, yang biasanya berarti bahwa molekul-molekul tersebut berukuran sama. "Marka" atau penanda (marker) yang merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda dapat digunakan untuk menentukan ukuran molekul dalam pita sampel dengan meng-elektroforesis marka tersebut pada lajur di gel yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada lajur marka tersebut dapat dibandingkan dengan pita sampel untuk menentukan ukurannya. Jarak pita dari sumur gel berbanding terbalik terhadap logaritma ukuran molekul. DNA dapat ditentukan ukurannya dengan melakukan migrasi didalam gel agarose atau gel poliakrilamid. Migrasi DNA didalam gel ini biasa disebut dengan elektroforesis. Untuk dapat divisualisasikan, maka DNA yang ada di gel harus diwarnai dengan ethidium bromida kemudian dilihat diatas sinar UV.

DNA merupakan molekul bermuatan negatif, sehingga bila diletakkan di medan listrik, DNA akan bergerak (migrasi) dari kutub negatif ke kutub positif. Pergerakan kecepatannya tergantung dari : a. Ukuran molekul DNA b. Kerapatan media gel yang dilalui DNA c. Arus listrik yang diberikan Sebelum dilakukan elektroforesis, suspensi DNA harus dicampur dengan penyangga muatan perwarna loading buffer (dye), yang berfungsi untuk : 1. Menambah densitas, sehingga DNA berada dibagian bawah dari sumur 2. Perwarna untuk memudahkan meletakkan contoh DNA kedalam sumur. 3. Dapat bergerak ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan 2.2. Tujuan Pratikum Dalam praktikum ini mahasiswa diharapkan dapat membuat gel agarose dan dapat mengetahui prinsip elektoforesis. Selain itu mahasiswa juga dapat mengetahui kualitas hasil isolasi plasmid bakteri praktikum sebelumnya dengan cara spektrofotometer.

2.3 Alat dan Bahan - Pemanas - Alat Elektroforesis (cetakan gel dan tangki larutan penyangga elektroda) - transilluminator UV - Power Supply - Erlenmeyer

- Larutan Penyangga TAE 50x Tris-HCl pH 8,3 Asam asetat pekat EDTA 2M 0,99 M 50 mM

- Larutan Loading dye perwarna yang digunakan adalah bromofenol biru. - Larutan Penyangga - Larutan EtBr 2.4 Prosedur Kerja 1. Pembuatan gel agarose 1% - Timbang 0,8 gr agarose + 80 ml TAE 1x - Didihkan hingga agarose larut - Dinginkan hingga suhu mencapai 60C, tuang ke cetakan gel - Biarkan hingga menjadi padat. 2. Ranning - Masukkan Gel kedalam Tanki yang berisi buffer TAE 1x - Campurkan 5ml DNA + 1 ml loading dye - masukkan kedalam sumur gel, hidupkan arus listrik, 30 menit. - Angkat gel dan rendam dalam larutan EtBr 10 menit - Lihat pita DNA diatas UV transmiter

2.5 Hasil dan Pembahasan DNA dapat ditentukan dengan melakukan migrasi didalam gel agarosa, agar dapat divisualisasikan maka DNA yang ada di gel harus diwarnai dengan ethidium bromida, kemudian dilihat dengan sinar UV. Ethidium ini akan mengikat molekul DNA, molekul ethidium bromida ini dapat berenergi tinggi sehingga dapat merusak sel. DNA merupakan molekul bermuatan negatif, sehingga bila diletakkan di medan listrik, DNA akan bergerak (migrasi) dari kutub negatif ke kutub positif. Pergerakan ini kecepatanya tergantung dari ukuran molekul, kerapatan media, dan arus listrik yang diberikan. Semakin kecil ukurannya, DNA akan bermigrasi semakin cepat, semakin rapat media yang digunakan, semakin lambat DNA bermigrasi. Dan semakin besar arus yang diberikan akan semakin cepat DNA bermigrasi. Sebelum dilkaukan elektroforesis, suspensi DNA harus dicampur dengan penyangga muatan perwarna (loading dye) perwarna yang digunakan adalah bromofenol biru laju migrasi bromofenol biru dalam gel agarosa (0,5-1,4%) di dalam larutan penyangga 0,5 x TBE kira-kira sebanding dengan laju migrasi DNA utas ganda linear sebesar 300 pb.
1

6000 4000 6123bp 4226bp

Berdasarkan hasil elektroforesis dengan visualisasi hasil pemendaraan spektofotometer diatas dapat dilihat Pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel akan tampak setelah proses pewarnaan; satu lajur

merupakan arah pergerakan sampel dari "sumur" gel. Pita-pita yang berjarak sama dari sumur gel pada akhir elektroforesis mengandung molekul-molekul yang bergerak di dalam gel selama elektroforesis dengan kecepatan yang sama, yang biasanya berarti bahwa molekul-molekul tersebut berukuran sama. "Marka" atau penanda (marker) yang merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda dapat digunakan untuk menentukan ukuran molekul dalam pita sampel dengan meng-elektroforesis marka tersebut pada lajur di gel yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada lajur marka tersebut dapat dibandingkan dengan pita sampel untuk menentukan ukurannya. Jarak pita dari sumur gel berbanding terbalik terhadap logaritma ukuran molekul.

y
4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 0 2 4 x 6 y = -0.3222x + 4.7538 R = 0.9938 y Linear (y)

log bp

Grafik persamaan linear hasil elektroforesis

Dilihat persamaan diatas dapat di hitung jarak pita dari sumur sebagai berikut : Y= - 0,322 (x) + 4,753

Dimana ; Y = log bp X = jarak sumur dengan pita Maka diketahui jarak pita kedua adalah 6123 bp dari sumur dan pita ketiga 4226 bp. Sedangkan untuk pita pertama tidak dihitung. Karena berada di atas marka 10000. Sedangkan untuk melihat kualitas dari DNA diatas dapat dihitung dengan pemendaran pada panjang gelombang 260 dengan absorbansi 280 dengan rasio 260/280 sehingga didapat rasion 1,8 yang menunjukan bahwa DNA hasil isolasi tersebut menunjukan kemurnian 100%. Untuk mengetahui konsentrasi atau kuantitas dari DNA dapat di gunakan persamaan sebagai berikut : 260 x 50l x FP FP= faktor pengenceran Maka dapat diketahui konsentrasi DNA pada isolasi tersebut adalah 14840 l/ml.

2.6 Kesimpulan Dari hasil elektroforesis diatas dapat disimpulkan 1. Untuk memperhatikan penggunaan EtBr dengan baik agar tidak merusak DNA karena molekulnya berenergi tinggi. 2. Dapat diketahui arah pergerakan DNA, ukurannya dan kecepatanya. 3. Setiap proses elektroforesis di libatkan pula proses spektofotometer sehingga dapat diketahui keberadaan DNA dan tingkat kemurniannya.