BAB III METODA PENELITIAN 3.

1 Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Bioteknologi, jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Andalas dan Laboratorium Pestisida Padang mulai bulan 30 November 2012 Maret 2013. 3.2 Alat Dan Bahan

3.2.1 Alat yang digunakan dalam penelitian Pada Penelitian ini alat yang digunakan adalah spektrofotometer UV-Vis, autoclave, inkubator, timbangan analitis, hot plate, peralatan gelas, petridish, jarum ose, spiritus, gerinda, oven, ayakan, sentrifus, waterbath shaker dan kromatografi gas (GC 2010 SHIMADZHU). 3.2.2 Bahan yang digunakan dalam penelitian Bahan yang dibutuhkan dalam penelitian ini adalah sampel ampas tebu yang telah dihaluskan, kertas saring, amonium hidroksida (Merck), kentang, gula pasir, agar, pepton, jamur Aspergillus niger, natrium karbonat (Merck), natrium tartarat (Merck), natrium bikarbonat (Merck), natrium sulfat (Merck), tembaga sulfat pentahidrat (Merck), asam sulfat pekat (Merck), natrium tungstat (Merck), asam molibdat (Merck), natrium hidroksida (Merck), asam pospat (Merck), aquades, aquabides, natrium nitrat (Merck), kalium klorida (Merck), KH 2PO4 (Merck), mangan sulfat heptahidrat (Merck), besi sulfat (Merck), carboxymethyl cellulose (CMC) , zink sulfat (Merck), asam klorida (Merck), Tween 80, buffer natrium asetat (Merck), ragi roti, asam sitrat (Merck), natrium sitrat (Merck), 3.3 Cara Kerja

3.3.1 Pembuatan Reagen dan Medium 3.3.1.1 Reagen Nelson Reagen Nelson terdiri dari 25 bagian Nelson A dengan 1 bagian Nelson B. Nelson A dibuat dengan melarutkan 2,5 gram natrium karbonat (Na2CO3), 2,5 gram

kalium natrium tartarat, 2 gram natrium bikarbonat dan 20 gram natrium sulfat dalam 100 mL aquades. Nelson B dibuat dengan melarutkan 7,5 gram tembaga sulfat hidrat (CuSO4. 5 H2O) dalam 50 mL aquades, lalu ditambahkan 1 tetes asam sulfat pekat (H2SO4). 3.3.1.2 Reagen Fosfomolibdat Reagen fosfomolibdat dibuat dengan cara melarutkan 1 gram natrium tungstat ditambah 7 gram asam molibdat dalam 70 ml natrium hidroksida (NaOH) 5 %, kemudian didihkan selama 5 menit, dinginkan larutan dan tambahkan 25 ml asam pospat (H3PO4) 85 %, lalu dilarutkan dalam erlenmeyer dengan 100 ml aquadest. 3.3.1.3 Buffer Asetat 0,1 M pH 5,0 Buffer asetat dibuat dengan cara mencampurkan 14,8 ml larutan A dan 35,2 ml larutan B diencerkan dengan 100 ml aquades. Larutan A terdiri dari 0,2 M asam asetat (11,55 ml dalam 1000 ml). Larutan B terdiri dari 0,2 M larutan natrium asetat (16,4 g C2H3O2Na dalam 1000 ml aquades). 3.3.1.4 Buffer Sitrat pH 5,0 Buffer sitrat dibuat dengan cara mencampurkan 30 ml larutan A dan 70 ml larutan B. Larutan A terdiri dari asam sitrat sebanyak 4,2028 g yang dilarutkan dalam 100 ml akuades. Larutan B terdiri dari natrium sitrat sebanyak 5,8824 g yang dilarutkan dalam 100 ml akuades. 3.3.1.5 Pembuatan Medium PDA Kentang dikupas dipotong kecil-kecil, ditimbang 25 g ditambah 125 mL akuades dalam erlenmeyer 250 mL. Dipanaskan sampai mendidih selama 15 menit. Kemudian disaring, diambil ekstraknya, ditambah dengan 2,5 g gula pasir, 2,5 g agar dan ditutup dengan aluminium voil. Dipanaskan dengan hot plete stirer hingga mendidih, disterilkan dengan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121 oC dengan tekanan 1,5 atm.

3.3.1.6 Medium Produksi Enzim NaNO3 3,0 g; KCl 0,5 g; KH2PO4 1,0 g; MnSO4 . 7 H2O4 0,5 g; FeSO4 . 7H2O 0,01 g; dan 10,0 g CMC dilarutkan dalam 1 l akuades. Satu liter dari media ditambah dengan 1.0 mL larutan yang mengandung (ZnSO4 1,0 g dan CuSO4 . 5H2O, 0,05 g dalam 1 l akuades). Larutan diatur pH 5,6 menggunakan 0,1 M HCl. Media diautoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit. 3.2.1.7 Medium YPD Ditimbang 3 g glukosa, 0,5 g pepton dan 0,3 g ekstrak ragi dilarutkan dalam 100 ml aquadest pada erlenmyer 250 mL. Medium di autoklaf selama 15 menit pada suhu 121 oC dengan tekanan 1,5 atm. 3.3.2 Persiapan Sampel Ampas tebu dipotong menjadi potongan-potongan kecil, kemudian dijemur, dihaluskan menggunakan gerinda dan diayak sehingga didapatkan ampas tebu dalam bentuk bubuk halus. Bubuk halus ini selanjutnya dianalisis. 3.3.3 Pretreatment Ampas Tebu Pretreatment dilakukan dengan merendam ampas tebu dalam campuran larutan NaOH dan NH4OH. Campuran NaOH dan NH4OH yang digunakan adalah konsentrasi NaOH 2% dan konsentrasi NH4OH dengan variasi konsentrasi 2,4,6,8 dan 10%. Ampas tebu sebanyak 10 gram direndam dalam masing-masing larutan dengan perbandingan 1:10, 1:15 dan 1:20 selama 24 jam pada suhu kamar. Setelah perendaman, ampas tebu disaring, dicuci berulang kali dengan menggunakan akuades untuk menghilangkan sisa dari amonium hidroksida dan natrium hidroksida hingga pH netral. Sisa yang didapat dikeringkan hingga mencapai berat konstan pada suhu 105 C dalam oven selama 6 jam 39,40.

3.3.4 Produksi Enzim Selulase 3.3.4.1 Persiapan jamur Aspergillus niger Aspergillus niger didapat dari laboratorium Biokimia Universitas Andalas. Ditumbuhkan dalam media Potato Dextrose Agar (PDA) miring dengan melakukan inkubasi selama 3 hari. 3.3.4.2 Produksi Enzim Selulase dari Aspergillus Niger A. niger yang telah diremajakan selama 3 hari dalam medium agar miring ditambahkan dengan 10 mL 0,1 % Tween 80 steril. Kemudian digesek menggunakan ose untuk melepaskan jamur dari agar. Selanjutnya jamur dicampurkan dengan medium produksi enzim, diinkubasi selama 3 hari. Setelah itu, disentrifugasi pada 6000 x g selama 15 menit pada suhu 4 C. Kultur supernatan digunakan sebagai sumber enzim selulase kasar. 3.3.5 Penentuan Aktivitas Enzim dengan Substrat CMC Campuran 3,0 ml CMC 0,1 % dalam buffer natrium asetat 0,1 M (pH 5,0) dan 3,0 ml supernatan diinkubasi pada suhu 40 C dalam waterbath shaker selama 30 menit. Konsentrasi glukosa yang dihasilkan ditentukan dengan metode SomogyNelson. Sebanyak 1 ml larutan hasil inkubasi dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 1 ml reagen-Nelson dipanaskan dalam air mendidih selama 20 menit. Tabung reaksi didinginkan di dalam air hingga suhu larutan 25 oC, kemudian ditambahkan 1 ml reagen fosfomolibdat dan 7 ml aquadest. Larutan dikocok, didiamkan selama 30 menit, setelah itu ukur absorban pada panjang gelombang 580 nm dengan spektrofotometer UV-VIS 33. 3.3.6 Sakarifikasi Enzimatik Ampas Tebu 3.3.6.1 Variasi Konsentrasi Substrat Ampas Tebu Konsentrasi ampas tebu dibuat dengan variasi 0,1 sampai dengan 1% dalam bufer asetat 0,1 M pH 5. Substrat ampas tebu dengan masing-masing konsentrasi diambil sebanyak 3 ml dicampur dengan 3 ml enzim diinkubasi pada suhu 40o C selama 30 menit. Konsentrasi glukosa yang dihasilkan ditentukan dengan metode Somogy-Nelson.

3.3.6.2 Variasi Lama Sakarifikasi Ampas Tebu Konsentrasi ampas tebu yang memiliki nilai absorban optimum diinkubasi selama 30 menit hingga 105 menit. Substrat ampas tebu sebanyak 3 ml dicampur dengan 3 ml enzim diinkubasi padasuhu 40o C dengan lama sakariikasi yang bervariasi. Konsentrasi glukosa yang dihasilkan ditentukan dengan metode Somogy-Nelson. 3.3.7 Fermentasi Bioetanol dengan Metode SSF 3.3.7.1 Isolasi dan Pemurnian Saccharomyces cereviciae 1 gram fermipan ditambahkan 9 ml aquades steril di dalam tabung reaksi (10 -1 sel/ml) dikocok hingga homogen. Diambil 1 ml larutan dan ditambah 9 ml aquades di dalam tabung reaksi (10-2 sel/ml), dilakukan sampai 10-8 sel/ml. Diambil 1 tetes larutan, diteteskan pada medium PDA dan disebarkan secara merata lalu didiamkan selama 48 jam sehingga didapatkan biakan murni Saccharomyces cerevisiae. 3.3.7.2 Persiapan inokulum ragi Saccharomyces cerevisiae Biakan murni Saccharomyces cerevisiae ditumbuhkan pada medium agar miring. Saccharomyces cerevisiae sebanyak 3 ose dari agar miring dipindahkan ke dalam 100 ml medium Yeast Peptone Dextrose (YPD) diinkubasi pada suhu kamar dengan shaker 130 rpm selama 48 jam. Diambil 10 mL kaldu disentrifugasi pada 4500 rpm selama 5 menit. Supernatan dituangkan, pellet ditambahkan dengan 10 mL akuades steril, disentrifugasi dan supernatan dituang. Perlakuan dengan akuades dilakukan 2 kali. Pelet yang diperoleh ditambahkan 10 mL buffer sitrat 50 mM pH 5,0 dan digunakan sebagai inokulum 19. 3.3.8.2 Pengaruh Variasi Lama Fermentasi 0,7 gram bubuk ampas tebu, 1,0 g ekstrak ragi dan 2.0 g pepton dan 80 ml buffer sitrat pH 5,0. Kemudian diautoklaf pada 121oC selama 20 menit. Setelah dingin pada temperatur kamar, 10 mL dari ekstrak kasar enzim selulase dan 10 mL inokulum ragi dimasukkan ke tiap erlenmeyer. Erlenmeyer diinkubasi pada suhu kamar dishaker pada 110 rpm selama 2, 3, 4, dan 5 hari. Kemudian disentrifugasi

pada 10000 g selama 10 menit dan supernatan didestilasi. Destilat disimpan untuk analisis etanol pada gas kromatografi 44. 3.3.8.3 Pengaruh Variasi Konsentrasi Ampas Tebu Variasi konsentrasi substrat ampas tebu yang digunakan 1,4; 2,1; 2,8; 3,5 dan 4,2 gram. Ke dalam masing-masing substrat ditambahkan 1 g ekstrak ragi, 2 g pepton dan 80 ml buffer sitrat pH 5,0. Setelah diautoklaf ditambahkan 10 ml ekstrak kasar enzim selulase dan 10 ml inokulum ragi. Fermentasi dilakukan selama 72 jam pada suhu kamar menggunakan shaker pada 110 rpm. Konsentrasi etanol yang dihasilkan diukur dengan kromatografi gas 44. 3.3.9 Penentuan Konsentrasi Etanol dengan Kromatografi Gas Konsentrasi etanol ditentukan dengan menggunakan Kromatografi Gas (GC 2010 SHIMADZHU) yang dilengkapi dengan detektor ionisasi nyala (FID) dan sebuah kolom kromatografi dengan panjang kolom 30 m dan diameter 0,25 mm. Gas pembawanya N2 (nitrogen) dengan laju alir 136,3 mL/ menit dan tekanan 100 kPa. Suhu injektor, suhu kolom dan suhu detektor masing-masing 150, 60-240, 200 oC. Fasa gerak gas pembawa dan fasa diam isi kolom ialah crossboned 100% dimetyl. Volume yang disuntikkan 1 l. Identifikasi dan kuantifikasi didasarkan pada perbandingan langsung kromatogram gas dengan standar etanol. Standar etanol yang digunakan adalah etanol p.a 96 %.