Carrera de especialistas- Universidad de San Luis- Agosto 2013

Bacterias anaerobias Identificacin

Liliana Fernndez Canigia
Lab. Domecq y Lafage Hospital Alemn
lfcanigia@labdl.com.ar

Cultivo de anaerobios: Limitaciones tcnicas

Bacterias fastidiosas Requerimientos culturales especiales

Atmosfera (<1% O2) Nutrientes Tiempo de desarrollo Metabolismo (algunos inactivos)

Cultivo de anaerobios: Muestra

Caractersticas macroscpicas: aspecto, olor ptrido, fluorescencia, granos de azufre, etc Observacin microscpica: flora polimicrobiana, leucocitos, orienta terapia emprica, etc.

Diagnstico microbiolgico: Medios

Medios slidos (placa) NO selectivos: (Agar base enriquecido Brucella, Columbia, Schaedler, etc)
Agar Base + Vit K (1 mg/ml) + Hemina (5 mg/ml) + sangre lacada al 5% (BHKA)

Medios slidos (placa) selectivos:

BHKA + AKA (30 a 50 g/ml) BHKA + VAN (5 g/ml) Otros: BE, AYH, etc

Medios lquidos: Resguardo (Backup)

Caldo BHI, tioglicolato suplementado con cistena, Vit K y hemina:

Diagnstico microbiolgico: Cultivo

Utilizar medios frescos, recientemente preparados o pre-reducidos Procesar rpidamente Evaluar qu microorganismos buscamos para elegir el medio: suplementos especficos

Cultivo de anaerobios: Atmsfera

Mtodos para generar atmsfera anaerobia:

Mezcla de gases: Se utiliza una mezcla compuesta por 5-10% H2, 5-10% CO2 y 80 a 90% de N2, Generadores comerciales: Hay diferentes sistemas comerciales:
Con catalizador (Gas Pack, BBL; Anaerobic Gas generator, Oxoid): BH4Na y cido ctrico y una tableta de HCO3Na para generar H2 y CO2 Sin catalizador : mezcla de reactivos que fijan el O2 y generan CO2. Activados con agua: Anaerocult, Merck; Britania. Activan al contacto con el aire: Anaerogen, Oxoid; Key Scientific, Mitsubishi; Genbox, Biomerieux

Cultivo de anaerobios: Atmsfera

Sistemas de incubacin: a) Jarras anaerobias b) Cmara anaerobia c) Bolsas anaerobias

Cultivo de anaerobios: Incubacin - Controles

Incubacin:
al menos 48 hs a 35-37C, hasta 5 a 7 das. Atmsfera anaerobia (< 1% O2)

Control de anaerobiosis
Indicadores de Ox-Red: resarzurina, azul de metileno Recuperacin de anaerobios estrictos: F. nucleatum, BGN pigmentados, etc.

Cultivo de anaerobios: Generadores comerciales

Bacterias anaerobias Identificacin: Gram-negativos y positivos

Identificacin de Anaerobios:
Consideraciones clnicas y de diagnstico

Infecciones polimicrobianas (> 5 mo) Sensibilidad a los antimicrobianos relativamente predecible Tratamiento basado en drenaje y debridamiento Infecciones mediados por toxinas Tiempo de respuesta del laboratorio

Identificacin de Anaerobios: Identificamos?

Infecciones severas por anaerobios

(bacteriemias, osteomielitis, empiemas, abscesos hepticos, de cabeza y cuello, actinomicosis, etc)

Reconocimiento del foco primario Sensibilidad no tan predecible y asociada a especie (Bacteroides fragilis multirresistentes

aislado de bacteriemia. Wareham et al. CID, 2005:40)

Asociacin de especie a factores de virulencia (Porphyromonas gingivalis asociada a

periodontitis, B. fragilis enterotoxigenico asociados

IDENTIFICACION DE BACTERIAS ANAEROBIAS: Identificamos?

Fines epidemiolgicos
Estudios de patogenicidad Descripcin de nuevos patgenos Asociacin a infecciones Resistencia antibitica

Identificacin de Anaerobios: Estrategia

Identificacin Identificacin

presuntiva

definitiva: Mtodos moleculares

Identificacin de Anaerobios: Identificacin presuntiva

Caractersticas

macroscpicas Caractersticas microscpicas Pruebas bsicas, rpidas especies (pruebas bioqumicas

convencionales y enzimas preformadas)

Identificacin de Anaerobios: Identificacin definitiva

Mayor

nmero de pruebas convencionales y/o enzimticas Mtodos comerciales Cromatografa Gas-lquido Mtodos moleculares: genmica y protemica

CULTIVO DE ANAEROBIOS: Identificacin

Procedimiento a seguir con cada colonia:
Prueba de tolerancia al oxgeno (CA) Descripcin macroscpica

Coloracin de Gram

CULTIVO DE ANAEROBIOS:
Qu es la prueba de tolerancia al Oxgeno? (Control aerobio)
Subcultivo en agar chocolate de la colonia en estudio Incubacin en atmsfera AEROBIA enriquecida en CO2 (lata con vela) a 37C, 24 a 72 hs. Hacer por lo menos dos veces con cada colonia y al menos 3 con cocos gram-positivos y microcolonias en general.

Identificacin de Anaerobios: Pruebas especiales

Discos de potencia especial: Vc 5 ug, Co 30 ug, Kana 1000 ug (bgn) Desarrollo en SPS (5%) y sensibilidad al metronidazol (10g) (cgp) (P. anaerobius) Desarrollo en bilis con discos o pastillas Produccin de Indol (spot) CAMP reversa (C. perfringens) Produccin de lipasa y lecitinasa (bgn y bgp esporulados)

IDENTIFICACION PRESUNTIVA

Gram

1- Bacilos gram negativos:

Discos potencia especial : Vc 5g+ Cs 10g + Ka 1000 g Indol Bilis Nitrato Esculina Catalasa

2- Bacilos gram positivos:

Esporulados:
Glucosa Gelatina Lipasa Indol

No esporulados:
Catalasa Nitrato Indol

CAMP reversa Urea Lecitinasa

3- Cocos gram negativos:

Vc 5g+ Cs 10g Nitrato Fluorescencia (UV)

4- Cocos gram positivos: Tablas Especficas

Vc 5g+ Cs 10g SPS Metronidazol (5)

IDENTIFICACION DE BACTERIAS ANAEROBIAS

Pruebas bsicas
Indol

Bilis

Caldo BHI con Pastillas Oxgall extraccin Desarrollo en caldo SIM u otros medios Discos preparados para anaerobios Spot

IDENTIFICACION DE BACTERIAS ANAEROBIAS Pruebas bsicas

Enzimas preformadas No requieren el desarrollo del microorganismo (no se incuban en anaerobiosis) Son pruebas rpidas Requieren mucho inculo Puede haber variabilidad entre mtodos

IDENTIFICACION DE BACTERIAS ANAEROBIAS Pruebas bsicas

Enzimas preformadas

Sistemas de identificacin rpida

Sustratos cromognicos (Pastillas DIATABS) Sistemas comerciales: API ZYM, RAPID ID ANA II, Rapid ID32A, etc. Sustratos fluorognicos: 4-metilumbeliferona derivados (SIGMA)

IDENTIFICACION DE BACTERIAS ANAEROBIAS Pruebas bsicas

Fermentacin de azcares

Desarrollo en Prpura de bromo-cresol, verde timol u otro indicador(incubacin en anaerobiosis) Difcil de ver punto final: agregado de colorante posterior y/o lectura de pH El microorganismo tiene que ser fuerte/moderado fermentador El microorganismo debe desarrollar bien en el medio que se utiliza Control de pureza Los azcares son caros

Identificacin de Anaerobios: Patrones de discos de potencia especial

Microorganismo
Gram-negativos Bacteroides grupo fragilis y gneros relacionados Prevotella spp. Porphyromonas spp. Fusobacterium spp.2 Bacteroides grupo ureolyticus3 Veillonella spp. Gram-positivos Cocos gram-positiivos Clostridium spp.

Vc
R1 R R S R R R S4 S S

Kn
R R RS R S S S V V SR

Co
V R S/R R S S S R R R

Bi
R R S S S S

SPS

MTZ

RS,5

1- Porphyromonas spp. son Van S. 2- Nitrato negativo, 3- incluye Campylobacter spp. 4- Algunas cepas de lactobacillus y la mayora de Clostridium inocum R a vancomicina 5g). 5- Peptostreptococcus anaerobius S. Adaptada de: Jousimies-Somer HR, et al. Anaerobic Baberiology Manual, 6th edition. 2002

IDENTIFICACION PRESUNTIVA

Gram

1- Bacilos gram negativos: Discos potencia especial : Vc 5g+ Cs 10g + Ka 1000 g Desarrollo en Bilis Indol Nitrato Tablas Esculina Especficas Catalasa (15%) Enzimas preformadas Urea

Bacilos gram-negativos: Discos de potencia especial

Co Vc

Kn

Bi

Bacteroides grupo fragilis y gneros relacionados: Parabacteroides, Alistipes, Odoribacter

Prevotella spp.
Pigmentadas No pigmentadas

Des. 20%bili s Catalas a Indol

Pigmen to

Morfolo g.

Movilid ad

Gnero (especie tipo)

Taxonoma de las bacterias anaerobias

Bacteroides sensu stricto (B. fragilis) Alistipes (A. putredinis) Odoribacter (O. splanchnicus) Porphyromonas (P. asaccharolytica) Parabacteroides (P. distasonis) Tannerella (T. forsythia) Prevotella (P. melaninogenica) Fusobacterium (F. nucleatum) Leptotrichia (L. buccalis) Dialister (D. pneumosintes) Selenomonas (S. sputigena) Sutterella (S. wadworthensis) Bilophila (B. wadsworthia) Desulfovibrio (D. desulfuricans) Campylobacter (C. curvus) Anaerobiospirillum (A. succiniproducens)

corto corto pleom. v corto pleom. c-b v v cocoide curvo recto recto curvo curvo espiral, largo

R R R S R R R R R R R R R R R R

R R R R R S v S S S S S S S S S

R R R R R S v S S v v S S R S v

+ + + +

v + v + -

+ v v + v v + v v v

v v v v v v + v -

v v + v v v + v + v -

+ v + v + -

Ferm. H. carbon o + + v v + + v + + +

Nitrato

Sensible a Vc Kn Co

Bacteroides grupo fragilis: B. fragilis

Morfologa: cocobacilo gram-negativos, pueden ser capsulados. Caractersticas culturales: Anaerobio aerotolerante, desarrolla en 15 a 20 hs en agar sangre sin suplementos. Identificacin:
Discos de potencia especial: ColistinR, KanaR, VanR . Desarrolla en Bilis al 20% Sacarolticos

Otras caractersticas: Resistencia a -lactmicos y otros antianaerbicos- Infecciones abdominales y bacteriemias

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Bacteroides grupo fragilis

B. fragilis B. thetaoiotaomicron B. vulgatus B. nordii B. salyersiae

B. caccae B. uniformis B. ovatus Y total 23 ESPECIES!

Parabacteroides: P. goldsteinii P distasonis P. merdae , P. gordonii, P. johnsonii.

Int J Syst Evol Microbiol (2006) Knnen E., Wade W., Citron D. en Manual of Clinical Microbiology 10 ed. Versalovic, Carrol, Funke, Jorensen J, Landry M., Warnock D. 2011
26/08/2013 L. Fernndez Canigia 30

Bacteroides fragilis

B. thetaiotaomicron

Bacilos gram-negativos: Discos de potencia especial

Co Vc Kn Bi

Porphyromonas spp.

asacarolticas

Bacilos gram-negativos: Discos de potencia especial

Variable

Fusobacterium spp.
(Bilis v)
nucleatum

Co Vc

Kn Bi

Otros Bacilos gramBilis S negativos (Bilis v)

Otros BGN Anaerobios (asacarolticos) Campylobacter spp. /Bacteroides ureolyticus

Identificacin rpida de Bacteroides grupo fragilis (VcR, KR, CoR, BiR)

Microorganismo B. fragilis B. caccae P. distasonisa P. merdaea
Catalasa Indol Esculina -fuco l-arabinosa

+ -+ + -

+ + + +

+ + -

+ +-

B. vulgatus B. thetaiotaomicronb

-+ +

+ +

+ +

+ +

a- P. distasonis es -glucuronidasa negativa y catalasa positiva, P. merdae es glucuronidasa positiva y catalasa negativa. b- otras especies productoras de indol son B. grupo fragilis : ej B. ovatus y B. uniformis y tambin Odoribacter splanchnicus que es asacarroltico
Adaptada de: Jousimies-Somer HR, et al. Anaerobic Baberiology Manual, 6th edition. 2002-Knnen E., Wade W., Citron D. en Manual of Clinical Microbiology 10 ed. Versalovic, Carrol, Funke, Jorensen J, Landry M., Warnock D. 2011

Identificacin rpida de Prevotella spp. NO pigmentadas (VcR, KR, CoR/S, BiS)

Microorganismo
P buccae P. oris
In Esculina -NAG -fuco -xyl Colistin

+ +

+ +

S R

P. heparinolyticaa
P. zoogleoformansa P. dentalisb P. grupo oralisd

+
-

+
+ + +

+
+ + +

+
+ +

+
+ V -

R/S
R/S R/S R/S

P. enoecac
P. biviac P. disiens

V
-

+
+ -

+
+ -

R
R R/S

a- Colonias se adhieren al agar, forma una masa viscosa en caldo. b- Prevotella dentalis forma colonias como gotas, c- P. enoeca es esculina variable y se aisla de cavidad oral, P. bivia es negativa, y ubicua (especialmente tracto genital), d- P. oralis, P. buccalis, P. veroralis y P. oulorum.

Adaptada de: Jousimies-Somer HR, et al. Anaerobic Baberiology Manual, 6th edition. 2002

Identificacin rpida de Fusobacterium spp. (VcR, KS, CoS, BiV Nitrato NG)
Microorganismo F. nucleatum F. necrophorum F. varium F. mortiferum
In Lip Esculina Oxgall ONPG Gram Extremos fusiformes Pleomrficos Bac.regulares Pleomrficos, formas redondeadas

+ + + -

+ +

-+
-

-+

Adaptada de: Jousimies-Somer HR, et al. Anaerobic Baberiology Manual, 6th edition. 2002

Identificacin a nivel de grupo de microorganismos grampositivos anaerobios

Microorganismo

Vc
S S
S S

Kn
V R
SR ND

Co
R R
R R

SPS

Metro

Esporo

Lec/ lip

Cocos gram-positivos
Peptostreptococcus anaerobius

RS S
NC NC

S S
+ V

+ -

NC NC
V NC

Clostridium spp Bacilos gram-positivos no esporulados

Vc: vancomicina 5g, Kn: kanamicina 1000 g, Co: colistin 10 g, Metro: metronidazol 10g), Esporo: test de esporulacin, Lec/lip: lecitinasa/lipasa, NC: no corresponde, ND: no determinado

IDENTIFICACION PRESUNTIVA

Gram

4- Cocos gram positivos: SPS Metronidazol (5 g) Glucosa Lactosa ADH PYR UREA FAL

Tablas Especficas

IDENTIFICACIN PRESUNTIVA GNERO

GRAM POSITIVOS
COCOS G (+)
V 5
S

Co 10
R

SPS 5%
RS

MTZ 10
S

O2
S

Peptostreptococcus anaerobius (S) Parvimonas micra

Peptococcus niger Finegoldia magna

Anaerococcus spp. Peptoniphilus spp. Gallicola spp. Murdochiella spp.

SPS = S

P. anaerobius

Gentileza Mirta Litterio, H. Garrahan

IDENTIFICACION PRESUNTIVA

Gram

2- Bacilos gram positivos: Esporulados: Glucosa CAMP reversa Gelatina Urea Lipasa Lecitinasa Indol Enzimas Tablas Especficas No esporulados: Catalasa Nitrato Indol

Clostridium septicum

Clostridium perfringens

Bacilos gram-positivos esporulados (esporos rara vez se observan en materiales clnicos). Sacaroltico y proteoltico. Inmvil Exotoxinas: colagenasas, hialuronidasas Toxina (fosfolipasa C o lecitinasa): Dermonecrtica y hemoltica

26/08/2013

L. Fernndez Canigia

Streptococcus agalactiae

CAMP reversa (E:95%)

Clostridium perfringens

Lecitinasa

Lipasa

Bacilos gram-positivos no esporulados

No esporulados
Actinomyces Propionibacterium Eubacterium Bifidobacterium Lactobacillus Mobiluncus

Actinomyces israelii

Identificacin en microbiologa

Fenotipo

Genotipo

Patrn de protenas

x10

Intens. [a.u.]

1.2

1.0

0.8
6264.1 10835.4 7122.5 7274.5 7828.2 8021.2 8369.5 8847.6 9589.7

0.4

4736.2

0.6

4470.0

5417.9

5495.0

0.2

0.0

5000

6000

7000

8000

9000

10000

10051.3

10259.6

m/z

P. intermedia/nigrescens
Pigmento marrn a negro Vc R, CoS, KnR, BiS- In+, Lip +

Identificacin por electroforesis de enzimas multilocus (MDH y GDH (Shah y Garbia 1992) SDS page, PCR, oligonucleotidos

Gingivitis de la embarazada Diferentes grados de enfermedad periodontal Otras infecciones odontgenas

Cultivo en agar Brucella suplementado con hemina vitamina K y sangre

P. intermedia- P. nigrescensP. pallens- P. aurantiaca P. falsenii

Infecciones de cabeza y cuello, pulmonares, tracto genital, abdominales, PyPB

Tesis doctoral- Liliana Fernndez Canigia

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P. falsenii (2009) P. aurantiaca (2010)

Posicin filogentica de especies del gnero Prevotella y su relacin con Bacteroides y Porphyromonas. rbol filogentico realizado con neighbor-joining utilizando secuencias de ARNr 16S. Shah et al. (2009)

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IDENTIFICACION: CONCLUSIONES

Buena observacin micro y macroscpica Siempre hacer pruebas bsicas de entrada (patrones de sensibilidad de discos de antibiticos con potencia especial) Utilizar pruebas no dependientes de cultivo como enzimas preformadas (inculo alto) Asegurarse buen desarrollo en pruebas de crecimiento. La mayora de las situaciones clnicas pueden resolverse con identificacin fenotpica aunque slo lleguemos a nivel de grupo o gnero.