Cuestionario laboratorio N1

1. Coloque los nombres de las diferentes partes del microscopio numeradas en la figura N 1.6 e investigue las funciones de cada una de ellas.

Lentes oculares: Es el grupo de lentes que tiene contacto directo con el observador, dichos lentes estn ubicados en la parte superior del microscopio y tienen la capacidad de aumentar la imagen de 10-15 veces el tamao de la misma. Revolver: sistema giratorio que soporta los distintos objetivos, tiene la funcin de intercambiar cada uno de estos, mediante la rotacin en su mismo eje, este intercambio debe ser de un objetivo de menor resolucin a uno de mayor resolucin. Lentes objetivos: Grupo de lentes ubicados cerca de la preparacin, tienen la funcin de aumentar el tamao de la imagen mediante la accin coordinada de los lentes oculares, pueden ser de distintas resoluciones, comprenden desde resoluciones mnimas de 4X y mximas en el microscopio ptico de 100X. Platina: Plataforma plana y rectangular utilizada para la colocacin de los preparados y objetos de estudio, consta de un orificio circular que permite el paso de la luz procedente de la fuente de luz, posee un juego de pinzas que permiten un total agarre de los cubre y porta-objetos. Posee un juego de tornillos que permiten el desplazamiento de sta.

Tornillo macromtrico y micromtrico: Son tornillos de enfoque que tienen la funcin de mover la platina hacia arriba y hacia debajo, el macromtrico lo hace con un desplazamiento de mayor velocidad mientras que el micromtrico lo hace con menor velocidad, normalmente se usa de macromtrico a micromtrico. Diafragma: Sistema de apertura que consta de una llave de bloqueo que permite el paso de la luz hacia la platina y por consiguiente a la muestra analizada. Condensador: Lente que condensa los rayos de luz hacia el condensador permitiendo una mayor incidencia en los rayos que actan sobre la muestra analizada. Fuente de luz: Puede ser de origen natural o de origen artificial, se ubica en la parte inferior del microscopio permitiendo que la luz se dirija de manera perpendicular hacia la muestra cruzando el diafragma y el condensador. Pie o base: Sirve como sostn al microscopio, el pie debe ser ms pesado que el resto del microscopio, siendo este el centro de gravedad del mismo. 2. Qu otros tipos de microscopio se utilizan en la investigacin biolgica? Microscopio de luz fluorescente: Utiliza longitudes de onda que permiten ver objetos de tamao manomtrico, son usados para poder observar sustancias mediante pigmentacin fluorescente o auto fluorescentes. Microscopio de luz ultravioleta: El microscopio de luz ultravioleta utiliza el rango ultravioleta del espectro luminoso en lugar del rango visible, bien para aumentar la resolucin con una longitud de onda menor o para mejorar el detalle absorbiendo selectivamente distintas longitudes de onda de la banda ultravioleta. Dado que el vidrio no transmite las longitudes de onda ms cortas de la luz ultravioleta, los elementos pticos de estos microscopios estn hechos con cuarzo, fluorita o sistemas de espejos aluminizados. Microscopio de contraste de fase: ste aprovecha las pequeas diferencias de los ndices de refraccin en las distintas partes de una clula y en distintas partes de una muestra de tejido. La luz que pasa por regiones de mayor ndice de refraccin experimenta una deflexin y queda fuera de fase con respecto al haz principal de ondas de luz que pasaron la muestra.

Microscopio de efecto tnel: ste microscopio utiliza una especie de aguja cuya punta es tan fina que ocupa un slo tomo. Esta punta se sita sobre el material y se acerca hasta una distancia determinada. Luego se produce una dbil corriente elctrica. Al recorrer la superficie de la muestra, la aguja reproduce la informacin atmica del material de estudio en la pantalla de una computadora. Los materiales que pueden observarse con este tipo de microscopio tienen sus limitaciones; deben, por ejemplo, conducir la electricidad y ser elementos que no se oxiden: como el oro, el platino o el grafito, entre otros. Microscopio de fuerza atmica: Es similar al del efecto tnel. Usa una aguja muy fina situada al final de un soporte flexible para entrar en contacto con la muestra y detectar los efectos de las fuerzas atmicas. El resultado que se obtiene es parecido al del efecto tnel pero sirve para materiales no conductores de la electricidad. El microscopio de campo oscuro: Utiliza un haz enfocado de luz muy intensa en forma de un cono hueco concentrado sobre el espcimen. El objeto iluminado dispersa la luz y se hace as visible contra el fondo oscuro que tiene detrs, como las partculas de polvo iluminadas por un rayo de sol que se cuela en una habitacin cerrada. Por ello las porciones transparentes del espcimen quedan oscuras, mientras que las superficies y partculas se ven brillantes, por la luz que reciben y dispersan en todas las direcciones, Esta forma de iluminacin se utiliza para analizar elementos biolgicos transparentes y sin pigmentar, invisibles con iluminacin normal. 3. Qu son los objetivos secos? Son aquellos que no necesitan interponer ninguna sustancia entre el objetivo y la preparacin. Preparacin estn separadas por aire, los objetivos en seco van desde 4x hasta 50-60x dependiendo de la preparacin. 4. Qu son objetivos de inmersin? Son los que se interpone un liquido entre la preparacin y la lente, en estos objetivos no se puede observar con claridad debido a la gran resolucin y a la desviacin de los diferentes haces de luz, para esto se utilizan sustancias que impida dicha desviacin. Son objetivos de inmersin 80X-90X-95X-100X.

5. Para qu se utiliza el aceite de cedro, cuando usamos el objetivo de inmersin? Normalmente se usa liquido transparente, en este caso el aceite de cedro con un ndice de refraccin mayor que el del aire, que es capaz de impedir la desviacin de los rayos mas oblicuos y as la lente recoger ms rayos para la formacin de la imagen.

6. Qu importancia tiene la parte cncava del espejo? sta permite la dispersin de los diferentes haces de luz, la desviacin hace que la luz que incide en un plano distinto a la posicin del espejo se desve perpendicularmente hacia la platina. 7. Qu importancia tiene utilizar la parte plana del espejo? sta le permite reflejar la luz que le llega con una capacidad reflectora de la intensidad de la luz incidente del 95% o superior, permitiendo as una total iluminacin al preparado de estudio. 8. Investigue sobre el funcionamiento de los diferentes microscopios electrnicos y establezca las diferencias entre ellos. Hay dos tipos bsicos de microscopios electrnicos: el microscopio electrnico de transmisin (Transmission Electron Microscope, TEM) y el microscopio electrnico de barrido (Scanning Electron Microscope, SEM). Microscopio electrnico de transmisin (MET): Permite la observacin de muestra en cortes ultra finos. Un TEM dirige el haz de electrones hacia el objeto que se desea aumentar. Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando una imagen aumentada del espcimen. Para utilizar un TEM debe cortarse la muestra en capas finas, no mayores de un par de miles de angstroms. Se coloca una placa fotogrfica o una pantalla fluorescente detrs del objeto para registrar la imagen aumentada. Los microscopios electrnicos de transmisin pueden aumentar un objeto hasta un milln de veces.

Microscopio electrnico de barrido (SEM): Crea una imagen ampliada de la superficie de un objeto. No es necesario cortar el objeto en capas para observarlo con un SEM, sino que puede colocarse en el microscopio con muy pocos preparativos. Su funcionamiento se basa en recorrer la muestra con un haz muy concentrado de electrones, de forma parecida al barrido de un haz de electrones por la pantalla de una televisin. Los electrones del haz pueden dispersarse de la muestra o provocar la aparicin de electrones secundarios. Los electrones perdidos y los secundarios son recogidos y contados por un dispositivo electrnico situado a los lados del espcimen. Cada punto ledo de la muestra corresponde a un pxel en un monitor de televisin. Cuanto mayor sea el nmero de electrones contados por el dispositivo, mayor ser el brillo del pxel en la pantalla. A medida que el haz de electrones barre la muestra, se presenta toda la imagen de la misma en el monitor. Los microscopios electrnicos de barrido pueden ampliar los objetos 200.000 veces o ms. Algunas de las diferencias ms fundamentales entre estos dos microscopios: El SEM explora la superficie de la imagen punto por punto, al contrario que el TEM, que examina una gran parte de la muestra cada vez. Al contrario de los TEM los SEM son capaces de formar imgenes tridimensionales realistas de las superficies de los objetos. El TEM sin embargo puede aumentar la imagen de un objeto con mucha mayor intensidad que el SEM. 9. Describa las principales tcnicas de preparacin de muestras empleadas en microscopia ptica. Para empezar a trabajar debemos obtener una muestra del tejido. -Fijacin: Este proceso se refiere al tratamiento del tejido o de la muestra con sustancias qumicas, de manera que mantenemos las clulas con las propiedades intactas lo mejor posible. La fijacin mantiene las estructuras al estimular la formacin de enlaces cruzados entre las protenas de la membrana celular. Podemos mantener las propiedades de la clula casi intactas al inactivar ciertas enzimas celulares que de otra manera iniciaran la autolisis y llevaran a la muerte celular.

Lavado: Se hace para eliminar el exceso de fijador, de manera que podamos luego hacer la inclusin sin interferencia por parte del fijador. Existen medios de inclusin que son hidrfobos y precisan de la eliminacin de agua en la muestra. Tenemos que hacer una deshidratacin. Debido a que una gran parte del tejido est constituido por agua, se aplica una serie gradual de soluciones acuosas de menor a mayor grado de agente deshidratante. - Aclaramiento o diafanizacin: Luego de deshidratar el tejido, se pasa a una solucin de una sustancia que es miscible tanto con el alcohol como con el medio de inclusin a utilizar. La sustancia comnmente utilizada es el Xileno o Xilol. De la misma manera se coloca la muestra de tejido en un recipiente de Xilol, que solo es soluble en alcohol al 100%. Se llama aclaramiento ya que el tejido se torna transparente o claro en el xileno, y esto se produce para disminuir el ndice de refraccin del preparado a estudiar. -Inclusin: Generalmente, los tejidos son estructuras blandas y frgiles, incluso despus de la fijacin. Por ste motivo, antes de obtener los cortes, es necesario incluirlos en un medio de soporte. Los medios ms utilizados son las ceras o resinas. En estado lquido, estos medios tienen la capacidad de penetrar y rodear el tejido, de esta forma se puede producir el endurecimiento, para formar un bloque slido que pueda ser cortado fcilmente en el micrtomo. Existe otro mtodo alternativo, que es la congelacin del tejido en un medio gelatinoso, que permite el corte tisular directo del fragmento congelado, que puede ser cortado en forma inmediata en un micrtomo especial denominado criostato. El objetivo de la inclusin es hacer facilitar la seccin del tejido a cortes lo suficientemente delgados como para permitir el paso de la luz y ser examinados. -Corte: La muestra ahora se puede cortar en secciones lo suficientemente delgadas como para permitir el paso de la luz. La mayor parte de los preparados para microscopa ptica tienen un grosor entre 5 a 10 micrmetros. Para estos cortes se utiliza un aparato llamado micrtomo. Cuando deseamos estudiar grasas o lpidos que se extraen en el proceso de aclaramiento o enzimas que quedan inactivadas por el calentamiento de la inclusin, nos auxiliamos con la Tcnica de Congelacin de Tejidos. El preparado puede ser cortado mediante un instrumento denominado micrtomo de congelacin, existe un aparato ms elaborado y eficiente para los cortes de congelacin llamado criostato. La ventaja de esta tcnica es que los cortes que se obtienen son muy rpidos, se puede utilizar en el diagnostico de material patolgico, tomado en intervenciones quirrgicas y el resultado se obtiene en el transcurso de una operacin.

- Montaje: Si queremos fijar las muestras una vez cortadas a un portaobjetos para observar a microscopio ptico, podemos utilizar el Bao termostatizado, el cual consiste en una cubeta dentro de la cual nos encontramos con la solucin de montaje, que hace la funcin de adhesivo de la muestra en el portaobjeto. Cuando cortamos al micrtomo, obtenemos una tirita con los cortes, pegados por los extremos. Esta tirita se pone flotando sobre la solucin de montaje. El corte se ir extendiendo ligeramente, eliminndose las arrugas y pliegues debidos al corte, pero no se llegar a derretir. De esta manera obtenemos en un mismo porta-objetos varios cortes del mismo bloque de inclusin. -Coloracin: Se usa para teir o resaltar secciones, organelas, la clula o un tejido de clula. Clasificacin de colorantes: Pueden ser: -Naturales: -animales: carmn. -vegetales: hematoxilina, azafrn. -Artificiales: -cidos: eosina, son colorantes citoplasmticos. -bsicos: azul de metileno, son colorantes nucleares. -neutros: Eosinato azul de metileno, tie el ncleo y el citoplasma.