DETERMINACION DE PROTEINAS POR EL METODO DE LOWRY

La determinacin cuantitativa de la concentracin de protenas es una de las pruebas que ms frecuentemente deben hacerse en el laboratorio de bioqumica. Primitivamente, la cantidad de protenas se evaluaba midiendo la cantidad total de nitrgeno proteico, y teniendo en cuenta que este elemento representa aproximadamente el 16% del peso de una protena. Este era un mtodo largo y laborioso y con poca sensibilidad. La aparicin de mtodos calorimtricos ha permitido solventar estos dos inconvenientes. Entre los mtodos calorimtricos destacan tres: el mtodo de Biuret, el mtodo de Lowry y el mtodo de Azul de Coomasie. El mtodo de Lowry tiene la ventaja de ser extremadamente sensible, capaz de detectar cantidades del orden de 10 microgramos de protena; su inconveniente principal es que al evaluar, como veremos, los fenoles presentes en la protena (esencialmente residuos de tiroxina), la intensidad del color resultante vara entre las distintas protenas. Pero cuando tratamos con mezclas biolgicas complejas, podemos perfectamente calibrar el mtodo con alguna protena comercial, como es la seroalbumina bovina. La reaccin que tiene lugar en el mtodo de Lowry es bastante compleja y no del todo conocida. Se desarrolla en las siguientes fases: 1.-Reaccin previa de la protena en medio alcalino con iones Cu2+, en presencia de tartrato para evitar la precipitacin. Es esencialmente idntica a la reaccin del Biuret, formndose un complejo de coordinacin entre el cobre y el nitrgeno peptdico. 2.-Reaccin con el reactivo de Folin-Ciocalteau para fenoles (cido fosfomolibdotungstico), que se reduce por medio de los grupos fenol (y en menor medida imidazol e indol) presentes en la protena a un complejo de color azul oscuro, que se mide colorimtricamente. El complejo coloreado, cuya composicin es desconocida, presenta dos mximos de absorcin a las longitudes de onda de 560 y 680nm. La eleccin de una u otra depende de la concentracin proteica de la muestra estudiada. Dado que este mtodo da resultados variables se requiere una curva de calibracin que se hace a partir de seroalbmina bovina. PROTOCOLO EXPERIMENTAL Solucin Standard de seroalbumina bovina (1 mg/ml). Muestra problema, de concentracin desconocida. Reactivo de Lowry, compuesto por tres soluciones que se mezclan en el momento de su utilizacin, y que son las siguientes:

A: Carbonato sdico al 2% en NaOH 0.1 M B: Sulfato cprico al 1% C: Tartrato sdico-potsico al 2%

En el momento de su uso se mezclan 50ml de A con 0.5 ml de B y 0.5 ml de C. Reactivo de fenoles de Folin-Ciocalteau. Este reactivo viene preparado comercialmente y se debe mantener en refrigeracin. Para su uso se diluye inmediatamente antes en la relacin de 1 parte de reactivo por 2 de agua destilada.

USO DEL ESPECTROFOTOMETRO 1. Seleccionar la longitud de onda adecuada y comprobar si la fuente de iluminacin y el fototubo corresponden a la misma. 2. Encender el aparato al menos 30 minutos antes de su uso para obtener una perfecta estabilizacin de su lnea de base. 3. Ajustar el aparato a transmitancia cero: con el receptculo de muestras vaco y la tapa del mismo cerrada, girar el botn izquierdo del aparato hasta hacer coincidir la aguja con el punto cero de la escala de transmitancia. 4. Ajustar el aparato a transmitancia 100%: Se introduce el blanco (en su tubo adecuado) en el receptculo de muestras, habiendo cuidado de la limpieza y de la transparencia del tubo. Se baja la tapa del receptculo y mediante el botn derecho se lleva la aguja hasta coincidir con el 100% de transmitancia. A continuacin se saca este tubo y se comprueba que la aguja se coloca exactamente frente al cero. 5. Medir cada una de las muestras: (a) medir en la escala de absorbancia, ya que segn la ley de Beer-Lambert la concentracin es proporcional a la absorbancia, pero como esta escala es logartmica, para valores altos de absorbancia, las mediciones se hacen imprecisas; (b) o bien medir las transmitancias, cuya escala es lineal, y convertirlas despus a absorbancia mediante la relacin. A = log (100/T) Una vez obtenidas las absorbancias, encontrar la relacin entre absorbancia y concentracin de protenas. CURVA DE CALIBRACION

Agitar enrgicamente y dejar 15 minutos.

Agitar enrgicamente y dejar 30 minutos.

Representar en papel milimetrado, la absorbancia en funcin de la concentracin de protena. La pendiente de la recta ser el factor que relaciona ambas variables. CUANTIFICACION DE PROTEINAS DE LA MUESTRA

Agitar enrgicamente y dejar 15 minutos

Agitar enrgicamente y dejar 30 minutos