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Método de Lowry

Método de Lowry

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09/09/2013

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DETERMINACION DE PROTEINAS POR EL METODO DELOWRY 
La determinación cuantitativa de la concentración de proteínas esuna de las pruebas que más frecuentemente deben hacerse en ellaboratorio de bioquímica. Primitivamente, la cantidad de proteínas seevaluaba midiendo la cantidad total de nitrógeno proteico, y teniendoen cuenta que este elemento representa aproximadamente el 16%del peso de una proteína. Este era un método largo y laborioso y conpoca sensibilidad. La aparicn de todos caloritricos hapermitido solventar estos dos inconvenientes. Entre los métodoscalorimétricos destacan tres: el método de Biuret, el método de Lowryy el método de Azul de Coomasie.El método de Lowry tiene la ventaja de ser extremadamente sensible,capaz de detectar cantidades del orden de 10 microgramos deproteína; su inconveniente principal es que al evaluar, como veremos,los fenoles presentes en la protna (esencialmente residuos detiroxina), la intensidad del color resultante varía entre las distintasproteínas. Pero cuando tratamos con mezclas biológicas complejas,podemos perfectamente calibrar el todo con alguna protnacomercial, como es la seroalbumina bovina. La reacción que tienelugar en el método de Lowry es bastante compleja y no del todoconocida. Se desarrolla en las siguientes fases:1.-Reacción previa de la proteína en medio alcalino con iones Cu2+,en presencia de tartrato para evitar la precipitación. Es esencialmenteidéntica a la reacción del Biuret, formándose un complejo decoordinación entre el cobre y el nitrógeno peptídico.2.-Reacción con el reactivo de Folin-Ciocalteau para fenoles (ácidofosfomolibdotungstico), que se reduce por medio de los grupos fenol(y en menor medida imidazol e indol) presentes en la proteína a uncomplejo de color azul oscuro, que se mide colorimétricamente. Elcomplejo coloreado, cuya composición es desconocida, presenta dosmáximos de absorción a las longitudes de onda de 560 y 680nm. Laelección de una u otra depende de la concentración proteica de lamuestra estudiada.Dado que este método da resultados variables se requiere una curvade calibración que se hace a partir de seroalbúmina bovina.
PROTOCOLO EXPERIMENTAL
Solución Standard de seroalbumina bovina (1 mg/ml).
Muestra problema, de concentración desconocida.
Reactivo de Lowry, compuesto por tres soluciones que semezclan en el momento de su utilización, y que son lassiguientes:A: Carbonato sódico al 2% en NaOH 0.1 MB: Sulfato cúprico al 1%C: Tartrato sódico-potásico al 2%
 
En el momento de su uso se mezclan 50ml de A con 0.5 ml de B y 0.5ml de C.
Reactivo de fenoles de Folin-Ciocalteau. Este reactivo vienepreparado comercialmente y se debe mantener enrefrigeración. Para su uso se diluye inmediatamente antes en larelación de 1 parte de reactivo por 2 de agua destilada.
USO DEL ESPECTROFOTOMETRO
1.Seleccionar la longitud de onda adecuada y comprobar si lafuente de iluminación y el fototubo corresponden a la misma.2.Encender el aparato al menos 30 minutos antes de su uso paraobtener una perfecta estabilización de su línea de base.3.Ajustar el aparato a transmitancia cero: con el receptáculo demuestras vao y la tapa del mismo cerrada, girar el bonizquierdo del aparato hasta hacer coincidir la aguja con el puntocero de la escala de transmitancia.4.Ajustar el aparato a transmitancia 100%: Se introduce el blanco(en su tubo adecuado) en el receptáculo de muestras, habiendocuidado de la limpieza y de la transparencia del tubo. Se baja latapa del receptáculo y mediante el botón derecho se lleva laaguja hasta coincidir con el 100% de transmitancia. Acontinuación se saca este tubo y se comprueba que la aguja secoloca exactamente frente al cero.5.Medir cada una de las muestras: (a) medir en la escala deabsorbancia, ya que según la ley de Beer-Lambert laconcentración es proporcional a la absorbancia, pero como estaescala es logarítmica, para valores altos de absorbancia, lasmediciones se hacen imprecisas; (b) o bien medir lastransmitancias, cuya escala es lineal, y convertirlas después aabsorbancia mediante la relación.A = log (100/T)Una vez obtenidas las absorbancias, encontrar la relación entreabsorbancia y concentración de proteínas.
CURVA DE CALIBRACION
 
Agitar enérgicamente y dejar 15 minutos.

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