CROMATOGRAFÍA DE AMINOÁCIDOS

MANCILLA, C. G. E.; CASTREJÓN, C. R. ROSAS, T. M; BLANCO, E. Z.; y PÉREZ, S. L. J.;

Q.F.B.; V Semestre: Universidad del Valle de México, Campus Chapultepec

(Av. Constituyentes No. 151 Col. San Miguel Chapultepec. C.P. 11850 México, DF.)

Resumen………………………………………………………………..….1
Introducción……………………………………………………………..…2
I.- Separación de moléculas por cromatografía…………….….…….……....2
II.-C cromatografía de reparto………………………………………….…….…3
III. Cromatografía en capa fina………………..…………………………………3
IV. Cromatografía de adsorción……………………..……………………….…..4
V. Cromatografía de intercambio iónico………………………………………..4
VI. Cromatografía de exclusión molecular………………………………………8
VII. Reacciones coloreadas de aminoácido………………………………………4
Objetivo………….………………………………………….……………..…..6
Hipótesis………...……………………………………………….……………6
Material………………...……………………………………….……………..6
Procedimiento………….………………………………………….…………..6
Resultados………………………………………………………………………7
Discusión de Resultados………………………………….………… ………..8
Conclusiones…………………………………………….…………………….9
Referencias……………………………………………….……………...……..9

RESUMEN:

En esta práctica se realizó una de las técnicas más sencillas para identificación de aminoácidos que fue la
combinación de la cromatografía en capa fina con la reacción de la ninhidrina con la cual se peden identificar los
aminoácidos por la tinción color morado o magenta que se presenta en ellos, excepto con la prolina la cual, da un
tono amarillo al reaccionar con la ninhidrina debido a que no produce amonio al reaccionar con ella, lo que indica
que los demás aminoácidos que si presentaron esta reacción.

Se investigaron teóricamente algunos métodos de identificación de los aminoácidos, pero principalmente por
medio de cromatografías, a que esta es la técnica principal que se empleo para la técnica, así como algunas de las
reacciones coloreadas principales para los aminoácidos.

Los objetivos principales de esta práctica fueron llevar a cabo la separación de aminoácidos por medio de las
cromatoplacas utilizadas siendo así la fase móvil el eluyente que fue una mezcla de solventes y la fase móvil, el
aminoácido utilizado en cada placa. Se utilizaron para esto 11 aminoácidos y una proteína que fue la caseína para
compararlos con ella sin embargo no se observó un factor de rendimiento igual al de la caseína, no por que no
tuviera esta ninguno de los aminoácidos que se utilizaron sino que para que se pudieran comparar sus aminoácidos
e hubiera tenido que hidrolizar primero esta proteína para comparar sus residuos con los aminoácidos utilizados.

Se logro concluir que el factor de retención obtenido se debía dependiendo de las características de cada
aminoácido ya que dependiendo de si estos eran o no polares o incluso neutros iban a tener mayor o menor factor
de retención, esto debido a que un factor de retención alto indica una gran afinidad del compuesto por el
disolvente y si el eluyente es polar va a jalar consigo a los compuestos polares por el contrario si no es polar,
entonces jalara a los compuestos no polares.

1
 INTRODUCCIÓN
A menudo se tienen mezclas de aminoácidos que se
desean analizar. Antes de poder cuantificar estas
mezclas es necesario separarlas. Tres métodos de
separación han sido frecuentemente empleados en los
laboratorios:
• Cromatografía de capa fina. Este método se basa
en la separación de las moléculas adsorbidas a una
capa muy delgada de gel de sílice, mediante el
flujo de una columna de solvente que se deja
ascender mediante capilaridad. La separación se
realiza en base a la polaridad de las moléculas y la
mezcla de solventes más empleada ha sido butanol:
agua: ac. acético (4:1:1). La fase estacionaria es la
celulosa del papel y la móvil una mezcla de
disolventes orgánicos y agua. La celulosa retiene
una cierta cantidad de agua entrelazada entre sus
fibras y puede dar lugar a un mecanismo de reparto
de los componentes de una muestra aplicados
sobre ella cuando se hace fluir un disolvente de
polaridad distinta de la del agua. Según la
solubilidad que tengan los componentes de la
muestra respecto de las dos fases así será su
movilidad.[1, 2]
Las mezclas de aminoácidos pueden separarse en
placas de capa fina de gel de sílica, empleando como
fase móvil butanol:agua:ácido acético (4:1:1). Las
manchas de los aminoácidos pueden detectarse sobre
la placa desarrollada, si después de secarla se asperja
con una solución de ninhidrina.
Los aminoácidos aparecen como manchas púrpura
sobre un fondo ligeramente amarillento. Sin embargo,
la prolina (que no produce amonio libre al reaccionar
con ninhidrina) genera una mancha de color amarillo
oscuro.
Este método, aunque no es muy sensible, se empleó
con frecuencia en los primeros estudios de la
composición de las proteínas. En la actualidad ha sido
desplazado por la cromatografía líquida de alta
resolución, ya que esta última es más confiable para la
cuantificación y tiene mayor sensibilidad si los
aminoácidos se detectan por fluorescencia.
Sin embargo, la cromatografía de capa fina se sigue
empleando para determinar fosfoaminoácidos, ya que
de esta manera es posible identificar si una
determinada fosfoproteína, se encuentra fosforilada en
serina, treonina o tirosina. Para ello, la proteína debe
degradarse hasta liberar los aminoácidos que la
componen y luego esto se separan en una placa de gel
de sílica. La placa se gira 90o y se desarrolla con un
segundo sistema de solventes. Los fosfoaminoácidos
pueden revelarse con un reactivo de ácido
fosfomolíbdico para permitir su identificación. Los
sistemas en los que las placas se desarrollan en ambas
direcciones (en este caso se aplica sólo una muestra por
placa) se conocen como TLC bidimensional.
• Cromatografía líquida en columnas de
intercambio aniónico. En este caso, los
aminoácidos se hacen pasar por una columna de
resina con un grupo catiónico. Los aminoácidos,
según su carga se van a unir a la columna y luego,
mediante un cambio gradual en el pH del solvente
que se aplica a la columna, se va eluyendo cada
aminoácido a un pH distinto (según su punto
isoeléctrico). Como algunos aminoácidos son más
dificiles de separar que otros, a menudo es
necesario emplear una columna corta para separar
un grupo de aminoácidos y una columna larga para
separar los aminoácidos restantes.
• Cromatografía líquida de alta resolución en
columnas de fase reversa. Este método consiste en
aplicar los aminoácidos disueltos en una fase
acuosa acidificada a una columna de sílice unida a
una cadena hidrocarbonada. Los aminoácidos,
según su polaridad se van a unir a la columna y
entonces el eluyente se mezcla gradualmente con
cantidades cada vez mayores de un solvente menos
polar que el agua. Los aminoácidos van siendo
lavados de la columna conforme la polaridad del
solvente baja lo suficiente.[1]
La cromatografía se engloba dentro de las llamadas
técnicas de separación y permite el análisis de mezclas
complejas de compuestos muy estrechamente
relacionados químicamente. Son varias las modalidades
usadas y se clasifican según la fase móvil (de gases,
líquida) y por el tipo de soporte (columna, capa fina,
papel) usados.
La separación se lleva a cabo según la distinta
interacción que presenta cada uno de los componentes
de una muestra respecto a dos fases: una estacionaria y
otra móvil que fluye sobre ella. Esta interacción puede
ser de varios tipos que a su vez dan lugar a distintas
subclases de cromatografía: de absorción, de reparto,
de cambio iónico, de afinidad, etc. [2]
Separación de moléculas por cromatografía
El estudio y caracterización de las distintas
biomoléculas (azúcares, lípidos, proteínas, ácidos
nucleicos, etc.) requiere en numerosos casos su
2
aislamiento y purificación a partir de mezclas
complejas como son los preparados de cualquier
material biológico. Una de las técnicas bioquímicas
más clásicas y utilizadas para dicho fin es la
cromatografía. La cromatografía incluye una amplia
gama de técnicas, que se pueden clasificar atendiendo
al fundamento físico-químico en el que se basa la
separación (cromatografía de adsorción, de reparto, de
cambio iónico, de filtración molecular, hidrofóbica y de
afinidad), o al material sobre el que se lleva a cabo
(cromatografía en papel, capa fina, en columna y de
gases).[3]
Cromatografía de reparto
En la presente práctica llevaremos a cabo una
cromatografía de reparto, en capa fina, para la
separación de aminoácidos. En la cromatografía de
reparto los componentes de una mezcla se separan en
base a una distribución diferente entre la fase móvil y
la fase estacionaria. El movimiento relativo de las
moléculas a lo largo del sistema cromatográfico es el
resultado de un equilibrio entre las fuerzas de
transmisión o arrastre ejercido por la fase móvil en su
desplazamiento sobre la fase estacionaria y las fuerzas
que tienden a frenar dicho desplazamiento. Las fuerzas
de frenado pueden ser tanto de reparto (basado en
criterios de solubilidad) como de adsorción. [4]
La teoría de la cromatografía de reparto se basa en que,
en general, si dos fases inmiscibles se encuentran en
contacto una con otra y si una de las dos fases contiene
un soluto, éste se distribuirá entre ambas de acuerdo
con sus solubilidades relativas. Dicho fenómeno se
denomina reparto y viene determinado por el
coeficiente de reparto, que es la relación entre las
concentraciones del soluto, en el equilibrio, en las dos
fases. En la cromatografía de reparto tenemos un
soporte inerte al que está unida la fase estacionaria
líquida. La mezcla a separar junto con la fase móvil se
hace avanzar a lo largo de la fase estacionaria por
capilaridad. En dicho avance, la fase móvil arrastrará
consigo un porcentaje de moléculas de cada
componente a separar de acuerdo con los respectivos
coeficientes de reparto. La distancia recorrida por cada
uno de los componentes de la muestra dependerá de la
cantidad de solvente o eluyente que se haga pasar y de
los coeficientes de reparto, de manera que si éstos son
diferentes aquélla también lo será, siendo posible la
separación si se utiliza el volumen de eluyente
apropiado. En su desplazamiento, las moléculas de
soluto se distribuirán no puntualmente, sino formando
un área debido a que son parcialmente solubles en las
dos fases y a otros fenómenos tales como la difusión.
[5]
En la cromatografía de reparto se suelen utilizar
diversos materiales como soportes: almidón, celulosa,
gel de sílice, óxido de aluminio, etc. Aunque en teoría
se consideran inertes, pueden generar diferentes
procesos de adsorción, por lo que la separación ocurrirá
también, en parte, debido a la interacción entre las
moléculas a separar con dicho soporte, la cual actuaría
como fuerza de frenado. La fase estacionaria se forma
suspendiendo o embebiendo el soporte con el solvente
adecuado; éste recubre las partículas del soporte y es
retenido por adsorción y/o capilaridad. El espacio entre
las partículas del soporte será utilizado por la fase
móvil para su desplazamiento.[6]
Debemos de tener en cuenta que como fase móvil se
suelen utilizar solventes hidrófobos cuando haya que
separar compuestos no polares y solventes acuosos
cuando haya que separar sustancias polares. Por su
parte, la fase estacionaria, que debe ser al menos
parcialmente inmiscible con la móvil, suele ser por lo
general hidrofílica, aunque también pueden utilizarse
compuestos hidrófobos.[7]
Cromatografía en capa fina
En la cromatografía en capa fina, CCF o TLC ("thin-
layer chromatography, en la terminología inglesa) se
puede utilizar como soporte cualquier sustancia que
pueda dividirse en partículas finas y distribuirse
uniformemente en forma de láminas. Esto incluye
sustancias inorgánicas (gel de sílice, óxido de aluminio,
tierra de diatomeas, silicato de magnesio, etc) y
orgánicas (celulosa, poliamida, polietileno, etc). La
utilización de soportes hidrófobos facilita la separación
de compuestos no polares (lípidos, por ejemplo). En la
CCF, la fase estacionaria es una lámina de 0,25-0,50
mm de espesor, extendida de forma uniforme sobre la
superficie de una placa de vidrio o plástico. Aunque
muchas casas comerciales suministran placas ya
preparadas, éstas pueden hacerse en el laboratorio con
aparatos especiales que permiten extender sobre la
placa de vidrio o plástico la “papilla” formada por la
suspensión del material en un disolvente adecuado
(generalmente agua). La placa ha de dejarse secar antes
de su utilización. [8]
Para el desarrollo de la cromatografía, las muestras, en
un disolvente adecuado, se aplican puntualmente con la
ayuda de jeringas, micropipetas o capilares en un
extremo de la placa. El volumen de muestra a aplicar es
crítico, ya que va a afectar a la resolución (separación
de los componentes de una mezcla compleja), y
depende de la concentración del compuesto o
compuestos de interés en la muestra. Para soluciones
3
concentradas bastará una cantidad muy pequeña (rango
de μl) para aplicar suficiente cantidad de los solutos a
separar sin llegar a saturar la capacidad de resolución
de la placa cromatográfica. Para soluciones muy
diluidas, deberá aplicarse un volumen suficiente (de
hasta varios ml) para asegurar una cantidad detectable
de soluto o solutos de interés. En este caso conviene
hacer la aplicación en pequeños volúmenes
fraccionarios, no procediéndose a una nueva adición
hasta haberse secado totalmente la precedente (de lo
contrario la superficie de aplicación se haría muy
grande, distando mucho de la situación ideal de
concentración de la muestra en un solo punto de
aplicación). Una vez aplicada y seca la muestra, la
placa se introduce en un recipiente cerrado (tanque
cromatográfico) y uno de los extremos (el más próximo
a la línea de aplicación) se sumerge en un disolvente
apropiado (fase móvil), cuyo nivel en el fondo del
tanque debe quedar por debajo de la línea de
aplicación. El solvente se desplaza a través del soporte
por capilaridad provocando un reparto de los solutos
entre él y la fase estacionaria de acuerdo con sus
solubilidades relativas (coeficientes de reparto). Una
vez que el solvente haya alcanzado un punto próximo
al otro extremo de la placa, ésta se saca del tanque y se
seca. [9]
Las manchas correspondientes a cada compuesto, si no
son visibles, se pueden revelar mediante técnicas
analíticas concretas. Se determina la posición de cada
mancha relativa al frente alcanzado por el solvente,
calculándose el correspondiente valor de Rf. La
detección de los compuestos una vez realizada la
cromatografía se puede llevar a cabo en base a sus
propiedades espectroscópicas, fluorimétricas,
haciéndolos reaccionar con reactivos específicos,
radioisotópicamente, etc. La identificación de tales
compuestos se suele realizar comparando sus Rf con
los de compuestos de referencia (patrones) de
naturaleza química conocida. Alternativamente, los
diferentes compuestos, una vez localizada su posición
por un método no destructivo, pueden eluirse de la
placa raspando las zonas correspondientes y extrayendo
el polvo obtenido con un solvente adecuado. [10]
Uno de los factores más críticos en este tipo de
cromatografías es la elección de la fase móvil, que,
básicamente, suele estar formada por una mezcla de un
solvente orgánico con agua y algunas sustancias
adicionales tales cómo ácidos, bases, agentes
acomplejantes, etc., cuya finalidad es aumentar o
disminuir la solubilidad de algunos compuestos.
Además de en una sola dirección, la CCF puede
también realizarse bidimensionalmente. En este caso
sólo se aplica una única muestra, que se dispone en uno
de los vértices de la placa y se eluye dos veces,
normalmente con solventes diferentes, y en direcciones
perpendiculares.[11]
La CCF presenta una serie de ventajas respecto a
cromatografías alternativas, como es la de papel, tales
como las siguientes:
i) Una mayor resolución, obteniéndose por lo general
manchas más pequeñas.
ii) Una mayor velocidad de separación.
iii) Pueden utilizarse un gran número de materiales
como soportes y disolventes.
iv) Los compuestos pueden ser detectados con facilidad
y su recuperación es muy simple.
La mayor resolución obtenida por CCF se debe a que
pueden formarse partículas muy finas del soporte, por
lo que la relación superficie/volumen es muy elevada,
proporcionando una gran área superficial por unidad de
longitud. Esto se traduce en que la cantidad de muestra
que se puede aplicar es mayor y la difusión es mucho
menor. La ventaja respecto a la cromatografía en papel
es que éste tiene una estructura fibrosa y la capilaridad
asociada a las fibras tiende a aumentar la difusión de
las moléculas.[12]
Cromatografía de Adsorción:
Está basada en la diferente adsorción y posterior
desorción de sustancias contenidas en un disolvente
móvil (líquido o gas) sobre un sólido estacionario. No
se debe confundir la adsorción que es un fenómeno de
superficie que se manifiesta por el aumento de
concentración de la interfase que rodea al medio
estacionario, con la absorción que consiste en la
penetración de una sustancia en el seno de otra.
Ejemplos de cromatografía de adsorción son la
cromatografía en columna de alúmina y de carbón
activado, la placa de sílica gel.[13]
Cromatografía de Intercambio Iónico:
La fase estacionaria es una matriz polimérica porosa
que posee grupos iónicos unidos covalentemente y
contraiones móviles que pueden ser intercambiados por
iones arrastrados por la fase móvil (líquido).[14]
Cromatografía de Exclusión Molecular:
Las moléculas pueden ser separadas también sobre la
base de sus diferentes tamaños al pasar a través de una
columna que contiene partículas hidratadas de geles
porosos. Se encuentra en el mercado un buen número
de materiales para estos fines, cuya composición y
4
porosidad son controladas cuidadosamente, de modo
que moléculas de tamaño relativamente parecido
puedan ser separadas mediante la adecuada selección
del tamaño del poro gel (tabla 1). El Sephadex consta
de partículas pequeñas de dextrano formadas por una
red tridimensional de cadenas de polisacáridos
ramificados. Es altamente polar debido a su alto
contenido de grupos hidroxilos, por ello se hincha
considerablemente cuando se coloca en agua. La
mezcla de moléculas grandes y pequeñas se colocan
sobre la superficie libre superior del gel. A medida que
la muestra desciende por la columna, las moléculas
pequeñas difunden dentro del gel teniendo que recorrer
un camino más largo, mientras que las moléculas
grandes pueden ser completamente excluidas de los
poros del gel. Eventualmente se obtiene una separación
completa en la que las moléculas grandes salen primero
de la columna y por último las más pequeñas.
El resultado de la columna cromatográfica se expresa
en la forma de un diagrama de elución que muestra la
variación de la concentración del soluto en el eluyente
versus el volumen del eluyente que ha pasado por la
columna. De este diagrama se obtiene el volumen de
elución.
El volumen de elución (Ve) no es un criterio para
definir el comportamiento de un compuesto, ya que
varía con el volumen total de la columna (Vt) y la
forma como la columna ha sido empaquetada. Para ello
se utiliza la constante Kav
K av = v −v
e 0
v −v
t 0
En cromatografía de exclusión el volumen de la fase
móvil se llama volumen intersticial (V0). El valor de V0
se determina haciendo pasar por la columna una
molécula grande e inerte de peso molecular superior al
límite de exclusión del gel. El azul de dextrano 2000,
un colorante con peso molecular de 2*106, se utiliza
generalmente con este propósito. Cuando no se dispone
de la información adecuada para este cálculo, el Vo se
puede estimar como el 35% del volumen total de la
columna (Vt). El volumen total de la columna se
calcula a partir de las dimensiones de la columna (Vt =
π · r2 · h ).[15]
Reacciones coloreadas de aminoácidos
Los métodos colorimétricos de determinación de
aminoácidos se basan en la reacción específica de éstos
con determinados compuestos, dando derivados
coloreados. La formación de color se toma como
resultado positivo e indica su presencia, mientras que el
no desarrollo de color es indicativo de que no está
presente. Para cada prueba se utilizará un control
negativo, también denominado blanco de la reacción,
en el que el reactivo se añadirá a agua destilada (o
solvente adecuado). Aunque en la presente práctica se
llevará a cabo la determinación cualitativa de
aminoácidos (ausencia o presencia de dichos
compuestos), las reacciones coloreadas pueden también
ser utilizadas para la determinación cuantitativa de
dichas biomoléculas.
Hay una amplia gama de métodos colorimétricos que
permiten la determinación cuali- y cuantitativa de
aminoácidos. Aunque son métodos muy generales,
algunos de ellos permiten discriminar entre diferentes
tipos de estos compuestos. Así, hay métodos de
determinación de aminoácidos con el grupo amino libre
(método de la ninhidrina), de aminoácidos con núcleos
aromáticos (reacción xantoproteica), de los que poseen
un grupo indólico (triptofano; reacción con el ácido
glioxílico), un anillo fenólico (tirosina; reacción de
Millon), de aminoácidos azufrados (cisteína; reacción
con nitroprusiato sódico). En todos los métodos, el
aminoácido reacciona con otro compuesto formando
derivados coloreados que se pueden determinar
cuantitativamente por espectroscopia visible.
De todos los métodos reseñados, el más general y
utilizado es el de la reacción con la ninhidrina. La
ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) reacciona con
aminoácidos que tengan el grupo amino libre, dando
lugar a la formación de amoniaco y anhídrido
carbónico, con reducción del reactivo (ninhidrina) a
hidrindantina.
La hidrindantina reacciona a su vez con el amoniaco y
otra molécula de ninhidrina para dar un compuesto de
adición doble que presenta una coloración azul-
púrpura, con la excepción de la prolina que da una
coloración amarillenta (recordar que en la prolina el
grupo amino está sustituido). El derivado coloreado
presenta máximo de absorción en torno a 570 nm. La
reacción se lleva a cabo en caliente y a valores de pH
comprendidos entre 4 y 8.
Las aminas primarias (R-CH2 –NH2) dan también
positiva la prueba de la ninhidrina, aunque en este caso
no se libera CO2 La técnica es muy sensible, por lo que
es ideal para detectar concentraciones bajas de
aminoácidos, utilizándose para revelar su presencia en
cromatogramas y fracciones procedentes de otras
técnicas de separación. La presencia de aldehídos
resultantes de la degradación de la ninhidrina por
reacción con los aminoácidos modifica, bajo ciertas
condiciones, el color formado, lo que sirve para
identificar el tipo de aminoácido.[17]
5
  valina
Reacción de aminoácidos con la ninhidrina.[6]  fenilalanina
 isoleucina
 caseína
 leucina
 triptofano
 Agua destilada
 Ninhidrina
 N-butanol
 Ácido acético
 Acetona

OBJETIVOS EQUIPO

 Se llevará a cabo la separación de mezclas de  Balanza analítica

aminoácidos mediante cromatografía en papel. Se  estufa
revelará la presencia de los mismos en el papel
mediante reacción con ninhidrina y se identificarán PROCEDIMIENTO
en el cromatograma por comparación con la
posición de los correspondientes patrones 1.- Preparar:
preparados al efecto.  25ml de lisina al 0.4%
 25ml de arginina 0.4%
HIPÓTESIS  25ml de acido aspártico al 0.4%
 25ml de glicina al 0.4%
Si se preparan soluciones de aminoácidos a las cuáles  25ml de prolina al 0.4%
se les separa por medio de cromatografía de capa fina,
 25ml de valina al 0.4%
se podrán estudiar estas de acuerdo al rendimiento que
 25ml de fenilalanina al 0.4%
nos proporcionen además de aprender una técnica de
cromatografía con ninhidrina, la cual les da una  25ml de isoleucina al 0.4%
coloración para revelarlas.  25ml de leucina al 0.4%
 25ml de histidina al 0.4%
MATERIAL  25ml de triptofano al 0.4%
2.- Tomar 5ml de cada aminoácido por equipo
 Gradillas con tubos de ensayo. 3.- Poner en una cromatoplaca una muestra de cada aa.
 Juego de pipetas (0,5, 1,0, 2,0, 5,0, 10,0 ml). y una muestra de caseína al 0.1%
 Probetas (100 y 250 ml). Nota: las cromatoplacas miden 3x5 cm.
4.- utilizar como eluyente una muestra de n-butanol,
 Vasos de precipitado (100 y 150 ml).
acido acético y agua en relación (4:1:5)
 Piseta
5.- Cuando se eluyan las muestras dejar secar las
 Papel de filtro. cromatoplacas y rociarlas con nihidrina al 0.5% en
 Capilares para aplicar muestras. acetona.
 Papel de parafilm. Preparar para todo el grupo 100ml de solución de
 Rotulador de vidrio. nihidrina al 0.5% en acetona y ponerla en un frasco
 Pipetas Pasteur atomizador
 Cromatoplacas
 Vidrio de reloj

SUSTANCIAS

 lisina
 arginina
 acido aspártico
 glicina [18]
 prolina

6
¡Cuidado la acetona disuelve el frasco atomizador, así
que hay que ponerla en un frasco con tapón
esmerilado, mientras se espera para utilizarla!
¡Precaución utilizar guantes de látex para prepararla y
para aplicarla, pues mancha la piel, ya que se une a las
proteínas de la piel!
6.- revelar las cromatoplacas por calentamiento en una
estufa a 90ºC por 10 minutos. Colocar las placas en un
vidrio de reloj

Elución de las cromatoplacas

7.- Marcar con un lápiz el frente de disolvente y las

manchas
8.- calcular el Rf de cada a.a e identificarlos a.a de la
caseína.

[19]

RESULTADOS:

Revelado de las cromatoplacas

7
 1.9
Rf = = 0.5588
3.4
12. - Histidina
0.5
Rf = = 0.1471
3.4

DISCUSIÓN DE RESULTADOS

 Se utilizó la técnica de cromatografía en capa fina,

la cual se basa en la separación de las moléculas
absorbidas a la capa de gel de sílice de la
cromatoplaca mediante el flujo de la columna de la
Cálculo del factor de retención mezcla de solventes de agua, butanol y ácido
acético. La fase estacionaria es la celulosa y la
1.- Prolina: móvil los disolventes. Según la solubilidad que
tienen los aminoácidos de la muestra respecto de
1.7 las dos fases así fue su movilidad Las manchas de
Rf = = 0.5213 los aminoácidos se observaron sobre la placa
3.2
desarrollada, por la una solución de ninhidrina
rociada y al después ponerla en la estufa.
2.- Glicina
1.1  Los aminoácidos aparecieron como manchas
Rf = = 0.2895 púrpura sobre un fondo ligeramente amarillento.
3.8 Sin embargo, la prolina (que no produce amonio
3.- Isoleucina libre al reaccionar con ninhidrina) genera una
1.1 mancha de color amarillo oscuro.
Rf = = 0.3548
3.1  Se utilizó la ninhidrina debido a que sirve para la
4.- Caseína determinación de aminoácidos con el grupo amino
0.6 libre .La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno)
Rf = = 0.1935 reacciona con aminoácidos que tengan el grupo
3.1 amino libre, dando lugar a la formación de
5. - Lisina amoniaco y anhídrido carbónico, con reducción del
0.7 reactivo (ninhidrina) a hidrindantina. La
Rf = = 0.2188 hidrindantina reacciona a su vez con el amoniaco y
3.2
6. - Arginina otra molécula de ninhidrina para dar un compuesto
de adición doble que presenta una coloración azul-
0.5
Rf = = 0.1613 púrpura. La ninhidrina reacciona con los
3.1 aminoácidos formando aductos coloreados según
7.-ácido Aspártico la reacción:
0.9
Rf = = 0.2647
3.4
8. - Valina
0.9
Rf = = 0.25
3.6
9. - Leucina
1.2
Rf = = 0.3529
3.4
10. - Fenilalanina
1.8
Rf = = 0.5
3.6
11. - Triptofano

8
 El reparto de los aminoácidos en el papel se debe a
su naturaleza química. Las fórmulas de los
compuestos usados como patrón son:
 El reparto que se obtiene es el siguiente: los
aminoácidos apolares son los que mejor
interaccionan con el solvente y son arrastrados por
él; la lisina presenta la menor movilidad debido a
que al pH del solvente, este aminoácido presenta
sus dos grupos amino cargados positivamente por
lo que interacciona mal con el solvente,
mayoritariamente apolar (n-butanol). Los demás
aminoácidos se separan entre los aminoácidos
apolares y el básico.
 Al determinar los factores de retención se puede
observar que el triptofano es el que mayor factor
de retención obtuvo, esto debido a que es el que
tiene mayor afinidad por el disolvente y el de
menor factor de retención fue la histidina, es decir,
tuvo menor afinidad por el disolvente.
CONCLUSIONES
Esta técnica de separación cromatográfica es de las más
simples, además de que nos permitió estudiar esta
técnica y cualitativamente observar la reacción
producida por medio de la ninhidrina que permite
identificar aminoácidos ya que la reacción de los
aminoácidos con ninhidrina se debe a la presencia del
grupo α–NH2 en los mismos observándose así una
coloración morada o magenta. La prolina no tiene
dicho grupo libre, sino –NH- ya que forma parte del
anillo de pirrolidina, y al reaccionar con ninhidrina se
forma un color amarillo….
El factor de retención depende de la afinidad de los
aminoácidos con el disolvente o eluyente utilizado y
esto mismo depende del tipo de aminoácido que se
utilice, es decir si son polares, apolares, neutros, etc.,
por lo cual es importante esta técnica ya que de esta
manera se nos facilitaran saber las características del
aminoácido que se este utilizando.
REFERENCIAS
[1]http://depa.pquim.unam.mx/proteinas/estructura/EPa
mm2.html
[2] Stryer L, Berg JM, Tymoczko JL (2003) Estructura
y función de las proteínas. En: “Bioquímica”, 5ª ed.
Editorial Reverté (Barcelona, España), pp. 41-76.
[3] Luisot P (1982). “Bioquímica Estructural”, 2ª Ed.
Editorial AC.
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