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3.- CROMATOGRAFÍA DE AMINOÁCIDOS

3.- CROMATOGRAFÍA DE AMINOÁCIDOS

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En esta práctica se realizó una de las técnicas más sencillas para identificación de aminoácidos que fue la combinación de la cromatografía en capa fina con la reacción de la ninhidrina con la cual se peden identificar los aminoácidos por la tinción color morado o magenta que se presenta en ellos, excepto con la prolina la cual, da un tono amarillo al reaccionar con la ninhidrina debido a que no produce amonio al reaccionar con ella, lo que indica que los demás aminoácidos que si presentaron esta reacción.

Se investigaron teóricamente algunos métodos de identificación de los aminoácidos, pero principalmente por medio de cromatografías, a que esta es la técnica principal que se empleo para la técnica, así como algunas de las reacciones coloreadas principales para los aminoácidos.

Los objetivos principales de esta práctica fueron llevar a cabo la separación de aminoácidos por medio de las cromatoplacas utilizadas siendo así la fase móvil el eluyente que fue una mezcla de solventes y la fase móvil, el aminoácido utilizado en cada placa. Se utilizaron para esto 11 aminoácidos y una proteína que fue la caseína para compararlos con ella sin embargo no se observó un factor de rendimiento igual al de la caseína, no por que no tuviera esta ninguno de los aminoácidos que se utilizaron sino que para que se pudieran comparar sus aminoácidos e hubiera tenido que hidrolizar primero esta proteína para comparar sus residuos con los aminoácidos utilizados.

Se logro concluir que el factor de retención obtenido se debía dependiendo de las características de cada aminoácido ya que dependiendo de si estos eran o no polares o incluso neutros iban a tener mayor o menor factor de retención, esto debido a que un factor de retención alto indica una gran afinidad del compuesto por el disolvente y si el eluyente es polar va a jalar consigo a los compuestos polares por el contrario si no es polar, entonces jalara a los compuestos no polares.
En esta práctica se realizó una de las técnicas más sencillas para identificación de aminoácidos que fue la combinación de la cromatografía en capa fina con la reacción de la ninhidrina con la cual se peden identificar los aminoácidos por la tinción color morado o magenta que se presenta en ellos, excepto con la prolina la cual, da un tono amarillo al reaccionar con la ninhidrina debido a que no produce amonio al reaccionar con ella, lo que indica que los demás aminoácidos que si presentaron esta reacción.

Se investigaron teóricamente algunos métodos de identificación de los aminoácidos, pero principalmente por medio de cromatografías, a que esta es la técnica principal que se empleo para la técnica, así como algunas de las reacciones coloreadas principales para los aminoácidos.

Los objetivos principales de esta práctica fueron llevar a cabo la separación de aminoácidos por medio de las cromatoplacas utilizadas siendo así la fase móvil el eluyente que fue una mezcla de solventes y la fase móvil, el aminoácido utilizado en cada placa. Se utilizaron para esto 11 aminoácidos y una proteína que fue la caseína para compararlos con ella sin embargo no se observó un factor de rendimiento igual al de la caseína, no por que no tuviera esta ninguno de los aminoácidos que se utilizaron sino que para que se pudieran comparar sus aminoácidos e hubiera tenido que hidrolizar primero esta proteína para comparar sus residuos con los aminoácidos utilizados.

Se logro concluir que el factor de retención obtenido se debía dependiendo de las características de cada aminoácido ya que dependiendo de si estos eran o no polares o incluso neutros iban a tener mayor o menor factor de retención, esto debido a que un factor de retención alto indica una gran afinidad del compuesto por el disolvente y si el eluyente es polar va a jalar consigo a los compuestos polares por el contrario si no es polar, entonces jalara a los compuestos no polares.

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CROMATOGRAFÍA DE AMINOÁCIDOS
MANCILLA, C. G. E.; CASTREJÓN, C. R. ROSAS, T. M; BLANCO, E. Z.; y PÉREZ, S. L. J.;
Q.F.B.; V Semestre: Universidad del Valle de México, Campus Chapultepec
(Av. Constituyentes No. 151 Col. San Miguel Chapultepec. C.P. 11850 México, DF.)
 RESUMEN:
En esta práctica se realizó una de las técnicas más sencillas para identificación de aminoácidos que fue lacombinación de la cromatografía en capa fina con la reacción de la ninhidrina con la cual se peden identificar losaminoácidos por la tinción color morado o magenta que se presenta en ellos, excepto con la prolina la cual, da untono amarillo al reaccionar con la ninhidrina debido a que no produce amonio al reaccionar con ella, lo que indicaque los demás aminoácidos que si presentaron esta reacción.Se investigaron teóricamente algunos métodos de identificación de los aminoácidos, pero principalmente por medio de cromatografías, a que esta es la técnica principal que se empleo para la técnica, así como algunas de lasreacciones coloreadas principales para los aminoácidos.Los objetivos principales de esta práctica fueron llevar a cabo la separación de aminoácidos por medio de lascromatoplacas utilizadas siendo así la fase móvil el eluyente que fue una mezcla de solventes y la fase móvil, elaminoácido utilizado en cada placa. Se utilizaron para esto 11 aminoácidos y una proteína que fue la caseína paracompararlos con ella sin embargo no se observó un factor de rendimiento igual al de la caseína, no por que notuviera esta ninguno de los aminoácidos que se utilizaron sino que para que se pudieran comparar sus aminoácidose hubiera tenido que hidrolizar primero esta proteína para comparar sus residuos con los aminoácidos utilizados.Se logro concluir que el factor de retención obtenido se debía dependiendo de las características de cadaaminoácido ya que dependiendo de si estos eran o no polares o incluso neutros iban a tener mayor o menor factor de retención, esto debido a que un factor de retención alto indica una gran afinidad del compuesto por eldisolvente y si el eluyente es polar va a jalar consigo a los compuestos polares por el contrario si no es polar,entonces jalara a los compuestos no polares.
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Resumen………………………………………………………………..….1Introducción……………………………………………………………..…2
 I.- Separación de moléculas por cromatografía…………….….…….……....2 II.-C cromatografía de reparto………………………………………….…….…3 III. Cromatografía en capa fina………………..…………………………………3 IV. Cromatografía de adsorción……………………..……………………….…..4V. Cromatografía de intercambio iónico………………………………………..4VI. Cromatografía de exclusión molecular………………………………………8VII. Reacciones coloreadas de aminoácido………………………………………
4Objetivo………….………………………………………….……………..…..6Hipótesis………...……………………………………………….……………6Material………………...……………………………………….……………..6Procedimiento………….………………………………………….…………..6Resultados………………………………………………………………………7Discusión de Resultados………………………………….………… ………..8Conclusiones…………………………………………….…………………….9Referencias……………………………………………….……………...……..9
 
INTRODUCCIÓN
A menudo se tienen mezclas de aminoácidos que sedesean analizar. Antes de poder cuantificar estasmezclas es necesario separarlas. Tres métodos deseparación han sido frecuentemente empleados en loslaboratorios:
Cromatografía de capa fina
. Este método se basaen la separación de las moléculas adsorbidas a unacapa muy delgada de gel de sílice, mediante elflujo de una columna de solvente que se dejaascender mediante capilaridad. La separación serealiza en base a la polaridad de las moléculas y lamezcla de solventes más empleada ha sido butanol:agua: ac. acético (4:1:1). La fase estacionaria es lacelulosa del papel y la vil una mezcla dedisolventes orgánicos y agua. La celulosa retieneuna cierta cantidad de agua entrelazada entre susfibras y puede dar lugar a un mecanismo de repartode los componentes de una muestra aplicadossobre ella cuando se hace fluir un disolvente de polaridad distinta de la del agua. Sen lasolubilidad que tengan los componentes de lamuestra respecto de las dos fases así sesumovilidad.[1, 2]Las mezclas de aminoácidos pueden separarse en placas de capa fina de gel de sílica, empleando comofase vil butanol:agua:ácido acético (4:1:1). Lasmanchas de los aminoácidos pueden detectarse sobrela placa desarrollada, si después de secarla se asperjacon una solución de ninhidrina.Los aminoácidos aparecen como manchas púrpurasobre un fondo ligeramente amarillento. Sin embargo,la prolina (que no produce amonio libre al reaccionar con ninhidrina) genera una mancha de color amarillooscuro.Este método, aunque no es muy sensible, se empleócon frecuencia en los primeros estudios de lacomposición de las proteínas. En la actualidad ha sidodesplazado por la cromatograa quida de altaresolución, ya que esta última es más confiable para lacuantificación y tiene mayor sensibilidad si losaminoácidos se detectan por fluorescencia.Sin embargo, la cromatografía de capa fina se sigueempleando para determinar fosfoaminoácidos, ya quede esta manera es posible identificar si unadeterminada fosfoproteína, se encuentra fosforilada enserina, treonina o tirosina. Para ello, la proteína debedegradarse hasta liberar los amincidos que lacomponen y luego esto se separan en una placa de gelde sílica. La placa se gira 90
o
y se desarrolla con unsegundo sistema de solventes. Los fosfoaminoácidos pueden revelarse con un reactivo de ácidofosfomolíbdico para permitir su identificación. Lossistemas en los que las placas se desarrollan en ambasdirecciones (en este caso se aplica sólo una muestra por  placa) se conocen como TLC bidimensional.
Cromatografía líquida en columnas deintercambio aniónico.
En este caso, losaminoácidos se hacen pasar por una columna deresina con un grupo catiónico. Los aminoácidos,según su carga se van a unir a la columna y luego,mediante un cambio gradual en el pH del solventeque se aplica a la columna, se va eluyendo cadaamincido a un pH distinto (según su puntoisoeléctrico). Como algunos aminoácidos son másdificiles de separar que otros, a menudo esnecesario emplear una columna corta para separar un grupo de aminoácidos y una columna larga paraseparar los aminoácidos restantes.
Cromatograa quida de alta resolucn encolumnas de fase reversa.
Este método consiste enaplicar los aminoácidos disueltos en una faseacuosa acidificada a una columna de sílice unida auna cadena hidrocarbonada. Los aminoácidos,según su polaridad se van a unir a la columna yentonces el eluyente se mezcla gradualmente concantidades cada vez mayores de un solvente menos polar que el agua. Los aminoácidos van siendolavados de la columna conforme la polaridad delsolvente baja lo suficiente.[1]La cromatografía se engloba dentro de las llamadastécnicas de separación y permite el análisis de mezclascomplejas de compuestos muy estrechamenterelacionados químicamente. Son varias las modalidadesusadas y se clasifican según la fase móvil (de gases,líquida) y por el tipo de soporte (columna, capa fina, papel) usados.La separación se lleva a cabo sen la distintainteracción que presenta cada uno de los componentesde una muestra respecto a dos fases: una estacionaria yotra móvil que fluye sobre ella. Esta interacción puedeser de varios tipos que a su vez dan lugar a distintassubclases de cromatografía: de absorción, de reparto,de cambio iónico, de afinidad, etc. [2]
Separación de moléculas por cromatografía
El estudio y caracterizacn de las distintas biomoléculas (azúcares, pidos, proteínas, ácidosnucleicos, etc.) requiere en numerosos casos su
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aislamiento y purificación a partir de mezclascomplejas como son los preparados de cualquiematerial biológico. Una de las técnicas bioquímicass clásicas y utilizadas para dicho fin es lacromatografía. La cromatografía incluye una ampliagama de técnicas, que se pueden clasificar atendiendoal fundamento sico-químico en el que se basa laseparación (cromatografía de adsorción, de reparto, decambio iónico, de filtración molecular, hidrofóbica y deafinidad), o al material sobre el que se lleva a cabo(cromatografía en papel, capa fina, en columna y degases).[3]
Cromatografía de reparto
En la presente práctica llevaremos a cabo unacromatograa de reparto, en capa fina, para laseparación de aminoácidos. En la cromatografía dereparto los componentes de una mezcla se separan en base a una distribución diferente entre la fase móvil yla fase estacionaria. El movimiento relativo de lasmoléculas a lo largo del sistema cromatográfico es elresultado de un equilibrio entre las fuerzas detransmisión o arrastre ejercido por la fase móvil en sudesplazamiento sobre la fase estacionaria y las fuerzasque tienden a frenar dicho desplazamiento. Las fuerzasde frenado pueden ser tanto de reparto (basado encriterios de solubilidad) como de adsorción. [4]La teoría de la cromatografía de reparto se basa en que,en general, si dos fases inmiscibles se encuentran encontacto una con otra y si una de las dos fases contieneun soluto, éste se distribuirá entre ambas de acuerdocon sus solubilidades relativas. Dicho fenómeno sedenomina reparto y viene determinado por elcoeficiente de reparto, que es la relación entre lasconcentraciones del soluto, en el equilibrio, en las dosfases. En la cromatografía de reparto tenemos unsoporte inerte al que está unida la fase estacionarialíquida. La mezcla a separar junto con la fase móvil sehace avanzar a lo largo de la fase estacionaria por capilaridad. En dicho avance, la fase móvil arrastraráconsigo un porcentaje de moléculas de cadacomponente a separar de acuerdo con los respectivoscoeficientes de reparto. La distancia recorrida por cadauno de los componentes de la muestra dependerá de lacantidad de solvente o eluyente que se haga pasar y delos coeficientes de reparto, de manera que si éstos sondiferentes aquélla también lo será, siendo posible laseparación si se utiliza el volumen de eluyenteapropiado. En su desplazamiento, las moléculas desoluto se distribuirán no puntualmente, sino formandoun área debido a que son parcialmente solubles en lasdos fases y a otros fenómenos tales como la difusión.[5]En la cromatograa de reparto se suelen utilizar diversos materiales como soportes: almidón, celulosa,gel de sílice, óxido de aluminio, etc. Aunque en teoríase consideran inertes, pueden generar diferentes procesos de adsorción, por lo que la separación ocurrirátambién, en parte, debido a la interacción entre lasmoléculas a separar con dicho soporte, la cual actuaríacomo fuerza de frenado. La fase estacionaria se formasuspendiendo o embebiendo el soporte con el solventeadecuado; éste recubre las partículas del soporte y esretenido por adsorción y/o capilaridad. El espacio entrelas partículas del soporte será utilizado por la fasemóvil para su desplazamiento.[6]Debemos de tener en cuenta que como fase móvil sesuelen utilizar solventes hidrófobos cuando haya queseparar compuestos no polares y solventes acuososcuando haya que separar sustancias polares. Por su parte, la fase estacionaria, que debe ser al menos parcialmente inmiscible con la móvil, suele ser por logeneral hidrofílica, aunque también pueden utilizarsecompuestos hidrófobos.[7]
Cromatografía en capa fina
En la cromatografía en capa fina, CCF o TLC ("thin-layer chromatography, en la terminología inglesa) se puede utilizar como soporte cualquier sustancia que pueda dividirse en partículas finas y distribuirseuniformemente en forma de minas. Esto incluyesustancias inorgánicas (gel de sílice, óxido de aluminio,tierra de diatomeas, silicato de magnesio, etc) yorgánicas (celulosa, poliamida, polietileno, etc). Lautilización de soportes hidrófobos facilita la separaciónde compuestos no polares (lípidos, por ejemplo). En laCCF, la fase estacionaria es una lámina de 0,25-0,50mm de espesor, extendida de forma uniforme sobre lasuperficie de una placa de vidrio o plástico. Aunquemuchas casas comerciales suministran placas ya preparadas, éstas pueden hacerse en el laboratorio conaparatos especiales que permiten extender sobre la placa de vidrio o plástico la “papilla” formada por lasuspensión del material en un disolvente adecuado(generalmente agua). La placa ha de dejarse secar antesde su utilización. [8]Para el desarrollo de la cromatografía, las muestras, enun disolvente adecuado, se aplican puntualmente con laayuda de jeringas, micropipetas o capilares en unextremo de la placa. El volumen de muestra a aplicar escrítico, ya que va a afectar a la resolución (separaciónde los componentes de una mezcla compleja), ydepende de la concentracn del compuesto ocompuestos de interés en la muestra. Para soluciones
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