4

CRECIMIENTO POBLACIN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS

29

4. SIEMBRA Y AISLAMIENTO MTODOS DE RECUENTO

DE

MICROORGANISMOS.

4.1. SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS Para trasladar microorganismos de un medio de cultivo a otro se utilizan micropipetas, pipetas graduadas, asas de siembra y asas de siembra calibradas. a. El asa de Kolle consta de un mango aislante y de un filamento de platino o de niquelcromo (nicrom) recto o acabado en un anillo. Esta asa se esteriliza por incineracin a la llama del mechero, dejndola enfriar sin que toque ninguna superficie antes de la siembra. Las asas calibradas sirven para trasladar alcuotas de un volumen pequeo de muestra (p.ej. 0,01 ml o 0,001 ml). El hilo de siembra (asa de picadura) se emplea para sembrar por picadura en el fondo de un tubo conteniendo agar, el asa redondeada (asa de Kolle) para sembrar por estra o en medios lquidos. b. Asa Digralsky, son varillas de vidrio con una rama horizontal. c. Las pipetas graduadas se utilizan para trasladar alcuotas de determinados volmenes de muestra (0,1-100 ml). Pueden ser de vidrio o de plstico. d. Las micropipetas constan de un mango y de una punta. Las puntas son de PVC de diferentes medidas y colores dependiendo del volumen de muestra; se esterilizan en el autoclave.

Nunca dejar material contaminado sobre la mesa del laboratorio

(asas de siembra, tapones de cualquier tipo) TCNICA DE SIEMBRA Se toma el tubo o erlenmeyer que contiene el inculo con la mano izquierda (fig. 4.1) y con los 4 y 5 dedos de la mano derecha se estira o desenrosca el tapn. Con los dedos 1 y 2 se coge el material para trasladar la muestra (asa de Kolle, pipeta...) antes de quitar el tapn.

Fig. 4.1 Es muy importante flamear al mechero la boca de los tubos o erlenmeyers y el extremo de las pipetas antes de inocular las muestras. Las asas de Digralsky sirven para extender homogneamente una alcuota sembrada sobre un medio slido. Para esterilizarlas, se sumergen en un recipiente con alcohol y se pasan por la

CRECIMIENTO POBLACIN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS

30

llama de un mechero. Antes de sembrar, se espera un tiempo hasta que se enfre al lado de la llama, sin que toque ninguna superficie. Los tubos y placas deben marcarse con rotulador de vidrio: 1. Cdigo de identificacin 2. Tipo de anlisis 3. Concentracin del inculo En las placas de Petri dichas anotaciones se realizan de forma circular en el borde de la tapa. Incubar en posicin invertida para que las gotas de agua de condensacin no se depositen encima de las colonias. 4.1.1 SIEMBRA EN PLACA A) Siembra en estra o por agotamiento. Siembra escocesa. Se basa en arrastrar, con el asa de Kolle, un nmero cada vez menor de microorganismos sobre un medio slido en placa de Petri. El objetivo es conseguir colonias aisladas.

Fig. 4.2 Metodologa 1. Esterilizar el asa de Kolle y dejarla enfriar al lado del mechero. 2. Tomar una alcuota del cultivo (lquido o slido) con el asa de siembra. 3. Para siembra en estra,poner el asa suavemente sobre el agar, haciendo un zig-zag hasta que se agote el inculo. 4. Para siembra escocesa, hacer una serie de estras paralelas y no superpuestas hasta que se agote el asa (fig.4.2) 5. Esterilizar el asa de siembra. 6. Hacer una nueva serie de estras perpendiculares a las anteriores de manera que se arrastren parte de los microorganismos sembrados en la serie anterior. 7. Esterilizar el asa de siembra y repetir el proceso una o dos veces ms. La ltima serie de estras no se ha de superponer con la primera. 8. Incubar 24 - 48 h. a la T adecuada. Si la siembra ha sido correcta, los microorganismos quedarn aislados en las ltimas estras y se podrn observar colonias aisladas. Este mtodo no permite saber el nmero de microorganismos por gr. o ml. de la muestra. B) Siembra por superficie o en masa Es un mtodo cuantitativo de aislamiento y recuento de las bacterias presentes en una muestra problema. Se basa en repartir homogneamente, alcuotas de la muestra por toda la superficie del medio de cultivo.

CRECIMIENTO POBLACIN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS

31

B.1. Siembra homognea en superficie. Asa Digralsky Procedimiento: 1. Aadir 0,1 ml. de la muestra o de las diluciones correspondientes en placas de Petri con agar nutritivo. 2. Esterilizar el asa Digralsky. 3. Repartir el inculo por toda la superficie con movimientos de rotacin hasta que el lquido quede totalmente absorbido. 4. Esperar 10 min y incubar las placas invertidas, para evitar que el agua de condensacin caiga sobre el medio. 5. Incubar durante 24 - 48 h. a la temperatura indicada. 6. Efectuar el recuento de las colonias sobre la superficie del medio (microorganismos aerobios). A medida que se hace el recuento se marcan con un rotulador sobre la placa . B.2. Siembra en profundidad ("pouring"). Procedimiento: 1. Aadir 1 ml de muestra o de las diluciones correspondientes en placas Petri. 2. Aadir entre 15-20 ml. del agar nutritivo en forma lquida atemperado a 45-47 C. 3. Agitar suavemente deslizando la placa de Petri encima de la mesa, en un movimiento en forma de ocho por espacio de dos minutos. 4. Esperar 10 min y incubar las placas invertidas, para evitar que el agua de condensacin caiga sobre el medio. 5. Incubar durante 24 - 48 h. a la temperatura indicada. 6. Efectuar el recuento de las colonias en el medio. A medida que se hace el recuento se marcan con un rotulador sobre la placa (aerobios y anaerobios facultativos). B.3. Siembra en doble capa Procedimiento: 1. Sembrar 1 ml de muestra o de las diluciones correspondientes en placas Petri. 2. Aadir 15-20 ml de agar nutritivo lquido a 45-47 C. 3. Homogeneizar las placas con suavidad, para mezclar el medio y la alcuota. 4. Dejar solidificar el agar. 5. Tras solidificar aadir una nueva capa del mismo medio de cultivo (aproximadamente 10 ml por placa). No es necesario homogeneizar. 6. Esperar unos 10 minutos hasta que solidifique. 7. Incubar las placas invertidas. 8. Incubar durante 24 - 48 h. a la temperatura indicada. 9. Efectuar el recuento de las colonias en el medio. A medida que se hace el recuento se marcan con un rotulador sobre la placa (microorganismos anaerobios). 4.1.2 SIEMBRA EN TUBO EN MEDIO SLIDO a) Siembra por estra Es el mtodo utilizado para el mantenimiento de cultivos puros y para determinar algunas caractersticas fisiolgicas de los microorganismos. fig. 4.3

CRECIMIENTO POBLACIN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS

32

b) Siembra en picadura Es un mtodo utilizado para determinar algunas caractersticas bioqumicas de los microorganismos. Los tubos o frascos con el medio de agar se dejan solidificar en posicin vertical o inclinada. El medio se inocula introduciendo verticalmente en el centro del tubo, un alambre largo y recto, cargado con el inculo. Fig. 4.3

fig. 4.3. 4.1.3 SIEMBRA EN TUBO CON MEDIO LQUIDO Medio utilizado para determinar algunas caractersticas bioqumicas de los microorganismos o para la obtencin de cultivos. Se basa en inocular, mediante el asa de Kolle, masa microbiana procedente de un cultivo (slido o lquido) a un medio lquido. Procedimiento: 1. Esterilizar el asa de Kolle. 2. Cargar el asa con el cultivo que se quiere transferir. 3. Abrir el tubo con el medio de cultivo estril y flamear la boca. 4. Introducir el asa de Kolle cargada con el inculo dentro del medio y agitarla para que las bacterias queden resuspendidas. 5. Flamear el tubo y ponerle el tapn. Esterilizar el asa. 6. Homogeneizar la suspensin. 7. Incubar a la temperatura adecuada. 4.2. MTODOS DE RECUENTO MICROBIANOS Determinacin de: 1. n de clulas 2. masa celular 3. densidad bacteriana o magnitud proporcional (concentracin, absorbancia)

CRECIMIENTO POBLACIN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS

33

Mtodos de determinacin n clulas: a. b. c. d. n de clulas viables (banco de diluciones) Cmara de recuento Mtodo Breed Contador electrnico (se basa en la prdida de conductividad de un electrolito cuando pasa una clula bacteriana a travs de un orificio estrecho) e. Filtros de membrana

Mtodos de determinacin masa bacteriana: a. Mtodos directos: 1. Centrifugacin: I. Masa hmeda (por centrifugacin) II. Masa seca (centrifugacin y secado) 1. Determinacin de nitrgeno o carbono. a. Mtodos indirectos: 1. Turbidimetra / Nefelometra. 2. Magnitudes metablicas (captacin de O2, produccin de CO2, cido). Para la medida se pueden emplear mtodos electroqumicos, titulaciones volumtricas,...) 4.2.1 RECUENTO VIABLES . Banco dilucionesi. Esta tcnica de recuento nos permite conocer el nmero de microorganismos viables en una determinada muestra. La viabilidad en Microbiologa se define como la capacidad del microorganismo para multiplicarse en un medio slido formando una colonia. Frecuentemente las muestras que hay que estudiar tienen un nmero muy elevado de microorganismos, por lo que se requiere diluirlas para poder contarlos. Para ello se realizan diluciones seriadas, que posteriormente se siembran en placas con medio de cultivo. La siembra en placa en superficie es idnea para aerobios. Permite tomar las colonias para su resiembra en otro medio o para su posterior identificacin. La siembra en profundidad ("pouring"), se utiliza principalmente para el recuento de hongos y en anlisis de microorganismos mesfilos aerobios totales en aguas y alimentos.

CRECIMIENTO POBLACIN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS

34

Fig. 4.4 Procedimiento 1. Rotular los tubos de Ringer con el factor de dilucin: 10-1, 10-2,10-3.10-4, 10-5,10-6 (1), (-2), (-3), etc. Colocar 9 ml de solucin Ringer en cada uno de ellos. 2. Esterilizar los tubos Ringer. 3. Agitar la muestra inicial para homogeneizarla. 4. Tomar 1 ml de la muestra problema con la pipeta y depositarlo en un tubo de Ringer con 9 ml de Ringer, marcado como dilucin 10-1 (-1). 5. Se agita bien el tubo (-1 ) y se toma 1 ml. que se depositara en el tubo de Ringer (-2). 6. Repetir la operacin con las sucesivas diluciones. 7. Sembrar en placas de agar a partir de las diversas diluciones. Incubar. Lectura y recuento. Hay que contar las colonias a contraluz. A medida que se van contando se marcan con un rotulador, as no se deja de contar ninguna, ni se cuentan dos veces. Para realizar un recuento correcto, las colonias deben estar aisladas. En caso de encontrarse superpuestas, esta placa no es vlida para efectuar el recuento. Para obtener el nmero de organismos por unidad de peso o volumen de la muestra analizada, se cuentan las colonias de las placas que contienen entre 30 - 300 colonias, se calcula la media aritmtica, que se multiplica por la inversa de la dilucin y por la inversa del volumen del inculo sembrado en las placas. ufc/ml,gr. = n colonias

1 1 dilucio n vol. ino culo

CRECIMIENTO POBLACIN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS

35

4.2.2

RECUENTO DIRECTO

A) MTODO BREED

Por la tcnica de mtodo directo se coloca un volumen conocido de una suspensin bacteriana sobre un rea conocida del portaobjetos. En el mtodo Breed se extiende una muestra sobre un recuadro de un centmetro marcado sobre el porta y se tie. Utilizando un objetivo de inmersin se inspeccionan los campos microscpicos y se calcula el valor medio del nmero de bacterias que hay en cada campo.
Procedimiento

1. 2. 3. 4.

Desengrasar con cuidado un portaobjetos. Dibujar en l un cuadrado de 1 cm por lado. Dar la vuelta al porta y observamos una superficie bien delimitada de 1 cm2. Colocar en la superficie y extender en los lmites del cuadrado 1 gota de micropipeta (16 l) de inculo. 5. Inmediatamente secar y fijar por calor suavemente. Cubrir la extensin con azul de metileno durante 1 min. lavar con agua del grifo, secar y observar al microscopio con objetivo de 40-60 aumentos). 6. A continuacin contar el nmero de microorganismos en varios campos, de manera que el nmero de campos es ms grande cuanto ms bajo es el de microorganismos. Si las clulas estn homogneamente repartidas, se puede aplicar la siguiente tabla. Nmero de bacterias / campo 0 - 3 4 - 6 7 - 12 13 - 25 26 - 50 51 - 100 > 100 Nmero de campos que se han de contar 64 32 16 8 4 2 1

Si la distribucin no es homognea se ha de contar un mnimo de 10 campos y en total como mnimo 300 clulas. Para obtener el n de clulas/ml de la muestra problema, hay que aplicar la frmula siguiente: (N) nm. clulas/ml. =
lulas/campo ) x nu (media ce m . campos totales en 1 cm 2 volumen (ml)

nm. campos totales en cm2 =

1 r 2

(determinar "r" con cmara de recuento)

CRECIMIENTO POBLACIN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS

36

B)

CAMARA DE RECUENTO

Para los recuentos microscpicos directos se usa un portaobjetos especialmente diseado llamado Cmara de Petroff-Hausser. Una cavidad de volumen conocido est excavado en la superficie del portaobjetos y se cubre con un vidrio fino marcado con cuadros de un rea conocida. La cavidad se llena1 con la suspensin bacteriana. Se calcula la media del n de bacterias de cada una de las series de cuadrados y se multiplica por un factor que proporciona el recuento por mililitro. Las bacterias mviles son difciles de contar por este mtodo y como pasa con otros mtodos microscpicos, las clulas muertas son demasiado similares a las vivas que se quieren contar. Adems se requiere una concentracin bastante alta de bacterias, de unos 10 millones de bacterias por ml. La principal ventaja es que no se necesita ningn tiempo de incubacin. Su uso se reserva en situaciones en que el tiempo es el factor principal.

Tcnica de llenado de cmara de recuento: Tomar el inculo con una pipeta Pasteur y acercarla al borde del cubre permitiendo que entre la muestra por capilaridad a la cmara de recuento. Observar con objetivo x60 aumentos.

CRECIMIENTO POBLACIN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS

37

4.3 CRECIMIENTO POBLACIN MICROORGANISMOS.

El crecimiento de una poblacin microbiana se mide siguiendo el incremento del nmero de clulas. La velocidad de multiplicacin vara de una especie a otra y depende de las condiciones de cultivo (nutrientes, temperatura, pH, etc.). Para unas condiciones determinadas, el crecimiento no es uniforme sino que vara a lo largo del tiempo. Estas variaciones dependen de factores como el agotamiento de nutrientes, la acumulacin de sustancias txicas, etc. Si se representan grficamente estas variaciones en funcin del tiempo, obtenemos una curva en la cual se diferencian cuatro periodos diferentes:

1. Fase de latencia Periodo de tiempo entre inoculacin y la tasa de crecimiento mxima. Depende de factores como: a. Edad cultivo b. Medio de cultivo Durante algn tiempo hay poco o ningn cambio en el nmero de clulas debido a que no se reproducen inmediatamente en medio nuevo. Este periodo se llama fase de latencia y puede durar desde una hora a varios das. Pero en este tiempo las clulas no se encuentran inactivas. La poblacin microbiana presenta una intensa actividad metablica, particularmente de sntesis enzimtica. Si el inculo procede de un cultivo en fase estacionaria, o si ha cambiado de medio de cultivo, debe adaptarse primero a las nuevas condiciones de crecimiento: sntesis de RNA (aumenta entre 8-12 veces), ribosomas y enzimas.

CRECIMIENTO POBLACIN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS

38

Cerca del final de la fase de latencia algunas clulas doblarn o triplicarn su tamao, preparndose para la reproduccin.
Fase logartmica
Finalmente las clulas empiezan a dividirse y entran en un periodo de crecimiento exponencial. La reproduccin celular adquiere una actividad mxima durante este periodo y el tiempo de generacin llega a un mnimo constante. Existe aparentemente un tiempo de generacin mnimo caracterstico determinado genticamente en cada especie (TD). Enterobacterias 15-30', Bacterias

del suelo 60-150' , Nitrosomas y Nitrobacter 5-10 h.

Como el tiempo de duplicacin es constante la representacin logartmica del crecimiento durante esta fase exponencial es una linea recta. Durante esta fase logartmica las clulas empiezan a mostrar sus caractersticas visibles: Morfologa, color, densidad... Es tambin cuando son metablicamente activas. Por otra parte durante la fase logartmica del crecimiento, los microorganismos son mas sensibles de lo normal a las condiciones adversas. El tamao celular y el contenido en protenas es constante

en la fase logartmica (clulas estndar). Ello implica la fiabilidad de las tcnicas de medicin indirecta. Fase idnea para estudiar influencia de factores ambientales (pH, temperatura, aireacin, etc) o capacidad de usar diversos sustratos nutritivos.
Fase estacionaria
Si el crecimiento exponencial continua sin control da lugar a un nmero de clulas asombrosamente altos. Pero esto no ocurre. Finalmente la velocidad del crecimiento disminuye el nmero de clulas muertas compensa al de clulas vivas y la poblacin se estabiliza. Las actividades metablicas de las clulas supervivientes tambin se hacen ms lentas en esta fase. Este periodo se llama fase estacionaria.

CRECIMIENTO POBLACIN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS

39

Las razones del cese del crecimiento exponencial son siempre claras. Se acumulan productos de degradacin txicos par las clulas y se agotan ciertos nutrientes esenciales. Disminucin de presin

parcial de O2.
Tambin tienen lugar variaciones del pH y de temperatura.

En fase estacionaria slo las clulas muy sensibles mueren rpidamente, las clulas puede an: a. utilizar materiales de reserva b. descomponer parte de los ribosomas c. sintetizar enzimas En muchos procesos microbianos la fase estacionaria es la fase de produccin de un metabolitosecundario (p.ej. Penicilina). En Biotecnologa: a. Trofofase: Fase de nutricin o crecimiento b. Idiofase: Fase de produccin Aunque las clulas no crezcan durante la idiofase, se aaden sustratos que actan como precursores del producto objeto de la produccin.

Fase de muerte
Normalmente el nmero de clulas muertas supera al de clulas formadas y la poblacin entra en la fase de muerte o fase de descenso logartmico.

Causas poco conocidas en general. Algunas debido a: produccin de cidos (e.coli, lactobacilos) autolisis (por la accin de los propios enzimas)
4.3.1 MEDIDA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO.

Hay una serie de mtodos para medir el crecimiento bacteriano. Algunos mtodos miden el nmero de clulas (Breed, cmara de recuento), otros la masa total de la poblacin, que es frecuentemente proporcional al nmero de clulas. Las medidas de poblacin se refieren normalmente al nmero de clulas que hay en un mililitro de muestra o en un gramo de material slido. Debido a que las poblaciones bacterianas suelen ser muy grandes la mayora de mtodos de cuantificacin estn basados en mediciones directas o indirectas de muestras muy pequeas, despus se determina mediante clculos el tamao de la poblacin total.

CRECIMIENTO POBLACIN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS

40

A)

TURBIDIMETRA

En algunos tipos de trabajos experimentales, la medida de la turbidez (turbidimetra) es un mtodo muy prctico para seguir el crecimiento bacteriano.

Los cultivos bacterianos actan como suspensiones coloidales, absorbiendo y reflejando la luz que incide sobre ellos. La turbidimetra mide la cantidad de luz transmitida por la suspensin. Por este procedimiento se puede estimar el nmero de bacterias en el cultivo, ya que, dentro de un rango, la luz absorbida por una suspensin bacteriana es directamente proporcional a la concentracin de clulas en el cultivo. La dispersin depende de: 1. 2. 3. 4. Tamao y peso molecular de las partculas Longitud de onda de la luz incidente Longitud detector-cubeta Concentracin partculas

Si las lecturas de absorbancia se comparan con el recuento en placa del mismo cultivo esta correlacin se puede utilizar en estimaciones futuras del nmero de bacterias hechas directamente por turbidimetra. Para que sean visibles las primeras trazas de turbidez es necesario mas de un milln de clulas por ml., y entre 10 - 20 millones por ml. para que la sustancia sea suficientemente turbia como para ser medida por un espectrofotmetro. Por tanto la turbidimetra no es un mtodo til para medir la contaminacin de lquidos para un nmero relativamente pequeo de bacterias.
ESPECTROFOTMETRO

El espectrofotmetro es el aparato que se utiliza para la medida de la luz transmitida. Este aparato proporciona luz monocromtica por medio de un filtro que permite slo el paso de la longitud de onda elegida. La cantidad de luz transmitida por una suspensin bacteriana es medida por una clula fotoelctrica, siendo inversamente proporcional a la cantidad de bacterias.

CRECIMIENTO POBLACIN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS

41

En general, el crecimiento bacteriano no se expresa como disminucin de la luz transmitida (transmitancia), sino como aumento de la luz absorbida (absorbancia), ya que esta ltima es directamente proporcional al nmero de bacterias presentes en la suspensin (Ley de Beer2) La relacin entre Transmitancia (T) y Absorbancia (A) se expresa matemticamente por: Io ----->

7 -------> I

T=

Is I0

%T= Para %T = 0

Is I0

100 => Absorbancia =

Para %T = 100

=> Absorbancia = 0;

Absorbancia = 2 - log % de Transmitancia

Fuente de luz. Luz monocromtica ( nica). Se obtiene seleccionando una onda de una fuente de luz policromtica. La seleccin se realiza mediante:

a. Filtros de vidrios coloreados que absorben las radiaciones no deseadas. b. Prismas o redes de difraccin (espectro fotmetro) Cubeta. Recipiente donde se coloca la muestra (l = 1 cm en general) Detector. Convierte la energa luminosa que recibe en energa elctrica. Sistema de registro Convierte seales elctricas del detector en seales registradas de lectura.
Fases de utilizacin (con aparato calibrado) 1. Conectar el aparato 15 m. antes, para estabilizar componentes elctricos y fuente de luz. 2. Seleccionar la longitud de onda adecuada. 3. Ajustar la absorbancia a 0 con el blanco (medio de cultivo empleado)
2

Ley de Beer. Establece la relacin entre el grado de absorbancia de una disolucin y otras dos variables: La concentracin del absorbente y la longitud del trayecto que el haz recorre a travs de la solucin. Segn esta ley la absorbancia de una solucin es directamente proporcional a la concentracin y a la longitud del paso de luz. (A = abc), siendo:

A = absorbancia b = longitud del paso de la luz en cm.

a = coeficiente de absorcin c = concentracin del absorbente

CRECIMIENTO POBLACIN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS

42

CURVA DE CRECIMIENTO

Suponiendo que un cultivo bacteriano crece a razn de una divisin cada 20 min. Si se ha partido inicialmente de 1 clula, tendramos:
Tiempo en min. N de bacterias (N) N = 2n n = n divis. celulares 0
1 20 0

20
2 21 1

40
4 22 2

60
8 23 3

80
16 24 4

100
32 25 5

120
64 26 6

140
128 27 7

160
256 28 8

180
512 29 9

200
1.024 210 10

220
2.048 211 11

240
4.096 212 12

Se produce un crecimiento exponencial. Siendo N = No 2n , si aplicamos logaritmos log N = log No + nlog 2 y n=

log Nlog N 0 log 2

La tasa de crecimiento (v = nmero de divisiones celulares/hora) ser: v=

n t

log Nlog N 0 (tt 0 )$log 2

El tiempo necesario para un ciclo de divisin es el tiempo de generacin: g=

t n

1 v

En la representacin grfica del crecimiento bacteriano, se obtiene una curva exponencial. Dicha curva no es apropiada para expresar un nmero grande de divisiones celulares, porque segn que escala escojamos , se reconocern nicamente, o bien las primeras divisiones, o bien las ltimas.

El crecimiento exponencial se caracteriza por una relacin lineal entre el tiempo y el logaritmo del nmero de clulas, se habla por tanto de crecimiento logartmico. Por ello se prefiere la representacin semilogartmica, en la cual se coloca en ordenadas el logaritmo del nmero de clulas. En este tipo de representacin se obtiene una recta. La pendiente de dicha recta refleja la velocidad del crecimiento celular.

CRECIMIENTO POBLACIN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS

43

Clculo del Tiempo de duplicacin (Td) y la Tasa especfica de crecimiento () En los clculos se toma como base la densidad bacteriana (x) o alguna magnitud proporcional a ella (nmero de clulas, absorcin).

La tasa de crecimiento (pendiente de la recta) El tiempo de duplicacin es td =

ln 2 

=

ln x t ln x o (tt o )

==================================================================
Ejercicio: Clculo de los parmetros (Td) y () Microorganismo utilizado Escherichia coli Medio de cultivo utilizado TSB Longitud de onda 540 nm Anota en la tabla siguiente los resultados obtenidos: Se utilizar como datos de clculo, las absorciones siguientes medidas en un espectrofotmetro de un cultivo de E.Coli. Tiempo 0 30' 60' 90' 120' 150' 180' 210' 240'
2

Absorbancia

0,104 0,180 0,360 0,587 0,990 1,356 1,750 1,852 1,850

1,5

Absorbancias

Efectuar el clculo del tiempo de duplicacin (Td) y de la tasa especfica de crecimiento ( ) del microorganismo en el tramo: 60' - 150' (fase exponencial del crecimiento).

0,5

0 0 50 100 150 200 250 300

tiempos (min)

Tiempo de duplicacin. Td (min) Tasa especfica de crecimiento (h-1)

CRECIMIENTO POBLACIN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS

44

TIPOS DE MORFOLOGAS COLONIALES (siembra en placa)

TIPOS DE MORFOLOGAS COLONIALES (siembra en tubo)

CRECIMIENTO POBLACIN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS

45

PRCTICA 4.1) AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS Muestra problema: Disolucin ringer , Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis. A) Aislamiento por dilucin

1. 2. 3. 4.

Preparar 2 placas (xG) de agar nutritivo Preparar 4 tubos con 9 ml. de d Ringer 3. Esterilizar. Preparar un banco de diluciones decimales (-1, -2, -3, -4) con la muestra disponible. Sembrar en superficie 0,1 ml. de cada una de las diluciones con asa Digralsky en placas con agar nutritivo (G1: -1, -3; G2: -2, -4). 5. Incubar 48 h. a 37 C. 6. Realizar el clculo del n de U.F.C./mL en la muestra con los resultados obtenidos. 7. Describe las morfologas coloniales observadas (A, B, C, ...). 8. Completar la tablas de observaciones. 9. Hacer un esquema del banco de diluciones y de las siembras que has realizado. 10. Proseguir con el procedimiento B.

B) Aislamiento por agotamiento en placa

1. Preparar y esterilizar los medios slidos: Mc Conkey, Manitol Salt; G:2 Sabouraud CAF, Levine. 2. Marcar placas Petri. Distribuir los medios. Enfriar. 3. Rotular en la parte posterior de cada placa (excepto Levine), tantos sectores como microorganismos se tengan que sembrar. ( A. Sabouraud 1 sector ms) 4. Tomar del agar nutritivo una colonia del tipo "A" obtenida en el protocolo n 4.1 y sembrarla en estra por agotamiento, en agar Mc Conkey, en uno de los sectores. 5. Repetir la operacin con los agares Manitol Salt, Sabouraud. 6. Proceder de igual manera con las colonias del tipo "B" , "C", .... Evitar que se superpongan las estras. 7. Sembrar Saccharomyces cerevisiae en un sector del A. Sabouraud 8. Incubar las placas en la estufa de cultivos a 37 C durante 48 h.(A.Sabouraud a 27 C) 9. Hacer un esquema con la metodologa seguida. 10. Observar los resultados obtenidos, completando los cuadros correspondientes. 11. A partir de una colonia que haya dado positivo en el Agar Mc. Conkey, resembrar en siembra escocesa en medio agar Levine (xG). 12. En otra placa de Agar Levine realizar una siembra escocesa a partir de un cultivo puro de Enterobacter cloacae. 13. Incubar 24-48 h a 37 C. 14. Efectuar lectura de los resultados obtenidos. Obtener conclusiones. Cuestionarios. 15. Consultar la composicin y caractersticas de los medios de cultivo que se emplean en esta prctica e indicar que funcin cumplir cada uno de ellos.

CRECIMIENTO POBLACIN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS

46

PRACTICA 4.2 Crecimiento poblacin microorganismos. Turbidimetra.

A)Crecimiento poblacin Saccharomyces cerevisiae. Clculo parmetros (v) y (g).

1. Disolucin nutritiva: En un frasco de 250 ml, preparar una de solucin de 25 ml de vino blanco (sin tratar), en 25 ml de agua destilada, y aadir 1,2 g de azcar. 2. Inculo. Resuspender 2 g de levadura en 100 ml de solucin salina. 3. En dos tubos de ensayo con S.S. preparar diluciones decimales -1, -2, del inculo. 4. En 1 erlenmeyer de 100 ml., colocar 50 ml de solucin nutritiva. Sembrar 1 ml de inculo de la dilucion (-2). 5. Incubar a 22 C durante 7 das. Agitar suavemente el cultivo con periodicidad 6. Hacer un recuento de levaduras en cada sesin de prcticas, mediante: a. Cmara de recuento. b. Mtodo Breed. 7. Calcular la tasa de crecimiento v (nmero de dividiones celulares por da) y el tiempo de generacin g (en horas). B) Curva crecimiento Escherichia coli. Turbidimetra.

1. Preparar un tubo inclinado con agar nutritivo. 2. Sembrar en estra un inculo de E. coli. Incubar 48 h. a 37 C 3. Aadir solucin salina estril al tubo inclinado de E. coli hasta cubrirlo completamente (entre 2 y 3 ml) y resuspender las bacterias en la solucin salina por agitacin. 4. Tomar 1 ml de la suspensin bacteriana con una pipeta estril y aadirlos a un matraz con 100 ml de TSB estril. 5. Incubar el matraz en la estufa de cultivos a 37 C, con agitacin 200 rpm (si disponible) 6. Medir la absorbancia del cultivo a distintos tiempos: 0, 30, 60,....y 180 minutos (longitud de onda aconsejada: 540 nm). Ajustar el espectrofotmetro a 0 % de absorbancia con un tubo de TSB estril antes de cada medida (blanco). 7. Dibujar una curva de crecimiento, en papel milimtrico, con los datos obtenidos, colocando en el eje de abscisas los valores del tiempo y en el de ordenadas los de absorbancia. 8. Efectuar el clculo del tiempo de duplicacin (Td) y de la tasa especfica de crecimiento ( ) del microorganismo en fase exponencial del crecimiento.