Professional Documents
Culture Documents
1
CAPITOLUL I
MICROORGANISME IMPLICATE IN OBTINEREA DROJDIEI
FURAJERE
2
inocularea cu Torula utilis. Astfel la cultivarea drojdiei Torula utilis prin procedeul
continuu pe borhot de melasa, pot apare in scurt timp si alte drojdii printre care si
Candida mycoderma, a carei proportie poate creste pana la 90%. Aceste contaminari
nu sunt periculoase in masura in care nu conduc la micsorarea randamentului si a
continutului in proteine a produsului finit.
In fabricile de drojdie furajera se folosesc de obicei pentru inoculare
amestecuri de 3-4 tulpini de drojdii (Torula utilis, Candida tropicalis, Candida
lypolitica), proportia dintre ele modificandu-se esential in timpul fabricatiei.
La fabricarea drojdiilor furajere se pot utilize si amestecuri de
microorganisme din diferite genuri: genul Candida, genul Trichosporon, genul
Torulopsis etc.
- Candida tropicalis realizeaza o productivitate mica, desi utilizeaza in
proportie insemnata zaharurile din solutie (75-80%), pe care le consuma specific,
sintetizand cantitati mari de acid glutamic si tirozina. Amestecurile de Candida
tropicalis, Candida arboreea si T. utilis multiplicate in comun, se plaseaza sub
aspectul epuizarii zaharurilor in zona valorilor satisfacatoare (78%), reprezentand in
acelasi timp o compozitie aminoproteica de buna calitate.
- Candida scottii se prezinta, din punct de vedere morfologic, sub forma de
celule oval elipsoidale dispuse sub forma de lant, cate 5-7-12 celule cu inmugurire
multipolara. Coloniile dezvoltate pe agar de bere sunt de culoare alb-crem, cu
suprafata marunt ridata, cu granulatie fina. Aceste drojdii asimileaza bine atat
hexozele cat si pentozele, precum si acizii organici si uronici. Avand un mare
randament in biomasa si continut ridicat de proteine drojdia Candida scottii poate fi
introdusa in fabricatie industriala atat sub forma de cultura pura cat si sub forma de
cultura mixta, in combinatie cu celelate specii de drojdie Candida.
- Trichosporon cutaneum are o viteza de crestere comparativ redusa cu
celelalte tipuri de drojdii, insa asigura o asimilare mai profunda a substantelor
organice, in particular a acizilor organici.
- Candida mycoderma face parte din microflora epifita a fructelor si a unor
legume, in cazuri rare se intalneste in microflora semintelor oleaginoase si cerealiere.
3
Asimileaza glucoza, zaharoza, maltoza, lactoza si poate utiliza etanolul ca unica sursa
hidrocarbonata. Formeaza glucoza, fructoza, zaharoza. Nu formeaza rafinoza. Poate
consuma CH3COOH din mediu simultan cu etanolul si are sulfitorezistenta redusa.
Temperatura propice de inmultire este de: minim 6-16ºC, maxim 24-36ºC, iar cea de
crestere optima este de 18-22ºC. Coloniile pe mediu solidificat prezinta un perimetru
slab-lobat, neregulat cu diameter cuprinse intre 2,5-5,8mm. Suprafata coloniei are un
aspect mat, cutat, de culaoare alb-cenusiu sau alb-crem. In mediu lichid formeaza un
voal alb (pelicula) subtire, la suprafata mediilor slab-alcoolice. In timp voalul se
destrama si se depune in sediment pulverulent.
Rhodotorula glutinis formeaza pe MEA, dupa 3 zile de cultivare, colonii cu
diametrul de 1,5-3mm, convexe, cu perimetru circular, cu suprafata lucioasa sau
aspect mucos, de culaore rosu pastelat. Dupa 7 zile, coloniile ajung la diametrul de 5-
10mm dar isi mentin caracterele morfologice. Celulele dezvoltate pe MEA timp de 3
zile au forma elipsoidala si dimensiuni medii de 4-5,5µm reproducerea are loc prin
imugurire pe intreaga suprafata. Unele tulpini pot forma celule alungite.
Se pot dezvolta pe mediul Czapek, cand formeaza celule cu dimensiuni de
2,3-5µm sau 12-16µm si pseudomiceliu. Poate deci folosi azotati ca sursa de azot. Nu
se dezvolta pe MEA cu 0.5% acid acetic. Se dezvolta in domeniul de temperaturi de
la 25ºC la 35ºC in produse cu aw minim de la 0,92. Cresterea este oprita in medii cu
pH 2,2 sau in prezenta de conservanti. Acidul benzoic sau acidul sorbic ii inhiba
cresterea la concentratii mai mici de 100mg/kgsi pH4. Sunt drojdii termorezistente.
Sunt inactivate prin incalzire la 62,5ºC timp de 10 min. Asimileaza glucoza,
galactoza, zaharoza, maltoza, xiloza, celobioza, alcoolul etilic, glicerolul si acizi
organici (lactic, succinic si citric). Rhodotorula glutinis, ca si Rhodotorula rubra, este
larg raspandita pe suprafata fructelor si legumelor proaspat recoltate dar produce rar
alterari ale acestora. Se intalneste in microbiota epifita a frunzelor si tulpinilor, a
boabelor de cereale, a maslinilor. Poate produce alterari ale sucurilor de mere si
capsuni insuficient pasteurizate.
4
Fig. 1. Drojdii utilizate ca drojdii furajere
a - Rhodotorula glutinis; b - Trichosporon cutaneum; c - Candida tropicalis
5
CAPITOLUL II
2.1. MATERIALE
6
2.1.2. Medii de cultura
Compozitia mediilor de cultura si scopul in care acestea au fost folosite in
experimentari sunt prezentate in tabelul 1.
7
Melasa-40%
Mediu de cultura (NH4)2HPO4-0,02%
Mediu de cultura de
cu melasa si (NH4)2SO4-0,01%
MMp 5,5-6 utilizat pentru
adaos de extract MgSO4·7H2O-0,005%
cultivarea drojdiilor
de porumb H2O- ~60%
Extract de porumb
Melasa-40%
Mediu de cultura (NH4)2HPO4-0,02%
Mediu de cultura de
cu melasa si (NH4)2SO4-0,01%
MMd 5,5-6 utilizat pentru
adaos de extract MgSO4·7H2O-0,005%
cultivarea drojdiilor
de drojdie H2O- ~60%
Extract drojdie
Melasa-40%
(NH4)2HPO4-0,02% Mediu de cultura de
Mediu de cultura
MM (NH4)2SO4-0,01% 5,5-6 utilizat pentru
cu melasa
MgSO4·7H2O-0,005% cultivarea drojdiilor
H2O- ~60%
8
Extractul de porumb prezinta aminoacizi ce au rol de biostimulatori si
vitamine, dintre care biotina este prezenta in cantitati apreciabile(150 – 200 mg/100g
produs)
9
2.2.1. Metode de izolare
Metodele prin raspandire sunt larg raspandite deoarece sunt usor de executat,
avand ca principiul raspandirea celulelor aflate in populatii eterogene in medii
naturale, prin diluare in medii lichide sau raspandire pe suprafata mediilor sterile
solidificate.
Metoda Koch se bazeaza pe raspandirea microorganismelor recoltate din
medii naturale intr-un mediu nutritiv si fixarea distantata a celulelor in urma
solidificarii mediului cu formare prin multiplicare de colonii izolate intre ele.
Metoda este folosita in special pentru izolarea culturilor pure de drojdii. Mediul de
raspandire este mustul de malt cu gelatina, repartizat cate 20 cm³ in 3 eprubete,
fluidificat si mentinut la 35-40ºC. Din proba aleasa pentru izolare se recolteaza
celulele cu ajutorul unei anse, care apoi este trecuta succesiv in cele 3 eprubete. Dupa
inoculare si uniformizare, continutul fiecarei eprubete se repartizeaza in cate o placa
Petri, iar prin solidificarea mediului celulele care raman fixate in gel vor forma prin
multiplicare colonii izolate.
In functie de densitatea celulelor Fig. 3.
recoltate initial, in placa a 2-a sau a 3-a
pot exista colonii izolate, iar dupa
studiul caracterelor microscopice ale
coloniilor reprezentative se face
repicarea in ebrubete cu slant agar,
obtinandu-se culturi pure.
10
2.2.2 Metode de numararea celulelor
1
mm ). Astfel, volumul de lichid plasat pe fiecare patratel elementar este cm 3 .
4 ⋅ 10 6
11
microscopice ( ∑ n = 100 ) si se calculeaza numarul mediu de celule pe un patratel
∑n
elementar ( n = ).
10 ⋅ 16
Numarul de celule prezente intr-un cm³ de suspensie de analizat se determina cu
formula:
N= n · 4 · 10 6 ⋅ k
In care: n- numarul mediu de celule pe un patratel elementar;
k- coefficient de dilutie;
12
La stabilirea sursei de izolare se au in vedere urmatoarele criterii:
a)o asociere intre microorganism si substrat (amidon-tarate, faina, paine,
suprafata fructelor etc);
b)densitatea microorganismului in mediul din care se face izolarea;
c)variatia densitatii celulelor in functie de conditiile de mediu (pentru a crea acest
fenomen numarul de tulpini izolate in aceasta etapa trebuie sa fie de ordinul sutelor si de
obicei mai mult de 500).
Pentru a facilita izolarea de tulpini variate se aplica metode selective de izolare.
Aceste metode se bazeaza pe prop biologice si de termorezistenta a sporilor. Tulpinile
izolate nu au identitate si poarta denum de izolat. Fiecare tulpina izolata se pastreaza in 2
exemplare si pentru a evita degenerarea acestora se pastreaza in stare liofilizata.
• 2.Controlul puritatii culturii care se realizeaza prin examen macroscopic si
microscopic si se studiaza caracterele culturale prin cultivare pe medii specifice cu agar
rezultand colonii la care se urmaresc caracterele macroscopice:
- pigmentatia,
- aspectul,
- diametrul coloniei
si caracterele microscopice:
- forma
- dimensiunea celulelor,
- prezenta sporilor,
- unele particularitati privind reproducerea, etc
In urma acestui studiu fiecare tulpina este asociata unei specii si unui gen. Lucrul acesta
poate sa ofere date privind puritatea izolatelor si stabilitatea genetica.
13
1.Preselectia (selectia calitativa) se aplica tuturor tulpinilor izolate si urmareste
eliminarea tulpinilor inactive. De obicei se aplica cultivarea in placi Petri pe medii de
cultura cu agar iar drept criterii de selectie se utilizeaza urmatoarele:
-dezvoltarea coloniala exprimata prin diametrul coloniei, acesta se exprima in mm
sau viteza de dezvoltare coloniala care se masoara in mm/h;
-consumul de substrat se exprima semicantitativ printr-un raport consum/ colonie;
.2.Selectia cantitativa se aplica tulpinilor selectionate in etapa anterioara iar drept
criteriu de selectie este randam de biosinteza.
Daca este vorba de un compus extracelular randamentul se masoara in g/dm3
mediu de cultura.
Daca ne referim la o enzima – UA/dm3 mediu de cultura.
Daca ne referim la compusi mintracelulari unitatea de masura este g/g s.u.
biomasa. Si cantitatea de enzime intracelulare se masoara deasemeni in UA/g s.u
biomasa.
In aceasta etapa cultivarea se realizeaza pe mediu lichid in culturi pe agitator sau
in bioreactoare de mica capacit aceasta insemnand de la 1-3 litri. In urma selectiei se
mentin in competitie 1-5 tulpini inalt active.
In urma selectiei tulpinii de drojdie, am observat urmatoarele:
- pigmentatia: rosu-portocaliu(specifica pigmentilor carotenoidici);
- aspectul coloniilor este rugos si mat;
- diametrul coloniei variaza intre 2 si 4 mm;
- forma coloniei este ovoidala;
- dimensiunea celulelor variaza inte 4 si 4,8 μm;
- nu prezinta spori.
14
Pentru a studia caracterele microscopice ale coloniilor reprezentative s-a folosit
un preparat in stare proaspata (preparate umede, preparat intre lama si lamela). In general
preparatele proaspete sunt folosite pentru cercetarea miscroorganismelor in stare vie.
Cercetarea celulei microbiene in stare vie permite studierea formei ei reale.
Executarea unui preparat umed s-a facut tinand cont de urmatoarele etape:
- pregatirea lamei si lamelei- lama curate si degresata se sterilizeaza trecand
ambele suprafete prin flacara becului de gaz. Lamela se sterge cu hartie de filtru;
- realizarea suspensiei de celule pe lama- se depune o picatura de apa sterila pe
lama de sticla sterilizata, in zona centrala. Pentru recoltarea microorganismelor aflate in
mediul lichid, in vederea realizari suspensiei, se foloseste ansa sau pipeta sterile.
- realizarea preparatului intre lama si lamela- dupa obtinerea suspensiei de
celule, lamela curata se sprijina si se deplaseaza pe lama la un unghi de 45º, pana cand
devine tangenta la picatura, apoi es lasa sa cada peste aceasta. Lichidul in exces se
absoarbe pe marginile lamelei cu hartie de filtru.
Un preparat bun nu trebuie sa prezinte bule de aer, acestea putand determina
aglomerari de celule si ingreuna studiul preparatului microscopic. Toate manipularile se
realizeaza in conditii aseptice.Preparatele umede se mai numesc si preparate temporare,
deoarece, prin folosirea apei sau a serului fiziologic steril ca lichid de relizare a
suspensiei de celule, studiul trebuie efectuat imediat pentru ca se produce destul de rapid
uscarea preparatului.
15
Tipul aparatului Scopul utilizarii
Dimensionarea, numararea si fotografierea
Microscop Karl Zeiss Jena
microorganismelor.
Balanta analitica
Balanta precizie 0.001g. Denver Determinari gravimetrice
Balanta precizie 0.1g
Spectrofotometru Determinari spectrofotometrice
16
se adauga 1000cm³ apa de retea. Se pastreaza amestecul timp de 24 de ore la rece apoi se
face fierberea timp de 30 de minute. Dupa filtrare in strat de vata se completeaza volumul
la 1000cm³ si se adauga suplimentar 1-10g peptona si 5g NaCl. Se ajusteaza pH-ul la
7,00. Se foloseste sub forma lichida sau ca mediu dens, prin adaugare de agenti de
solidificare. Sterilizarea se face timp de 20 min la 121ºC. In locul bulionului de carne se
poate folosi extract de carne in concentratie de 3g la 1000cm ³ apa.
Mustul de malt - este un mediu general pentru cultivarea drojdiilor si
mucegaiurilor. Se obtine din faina de malt si apa de retea in proportie de 1:4. Se cantaresc
50g faina de malt si se introduc intr-un vas tarat si se amesteca cu 200 cm³ apa cu
temperature de 47 ºC, astfel incat temperatura amestecului sa fie de 45ºC. Se mentine
aceasta temperatura timp de 30 min ,in conditii de agitare a probei. In acest interval de
timp, denumit interval de proteoliza, sub actiunea enzimelor proteolitice din malt are loc
hidroliza protidelor cu formarea de compusi solubili (peptone, peptide, aminoacizi). Se
ridica progresiv temperature, cu 1ºC /pe min, pana la 70 º C, se adauga 100cm³ cu aceasi
temperatura si se mentine la aceasta temperatura timp de 10-30 min, interval in care sub
actiunea enzimelor amilolitice (α-amilaza si β- amilaza) are loc zaharificarea amidonului
pana la compusi care nu mai dau coloratie cu solutia de Lugol. Dupa zaharificare se face
racirea si se adauga apa pana la greutatea finala de 450g. Extractul se obtine dupa
filtrarea plamezii prin strat de vata sau hartie de filtru cutata. In filtrate se determina
concentratia cu un aerometru Balling sau gradul refractometric. Pentru obtinera mustului
cu o anumita concentratie se face diluarea corespunzatoare cu apa de retea. Pentru
cultivarea mucegaiurlor se recomanda must cu 3-4 º Bllg, pentru drojdii cu 6-8 º Bllg,
pentru bacterii lactice 8-12º Bllg. Sterlizarea mustului se face la 0,5atm, timp de 20-30
min.
17
• Mediul Andreev • Mediul Rieder
18
asimilare.În aceste materii prime utilizate ca medii de cultură pentru drojdii se găsesc, în
anumite cantităţi, o serie de glucide cum sunt: glucoza, xiloza, maltoza, zaharoza,
manoza, galactoza, arabinoza, pe care drojdiile le pot folosi ca sursă de carbon şi energie.
În majoritatea ţărilor producătoare de proteine de biosinteză se folosesc leşiile
bisulfitice rezultate de Ia fabricarea hârtiei şi celulozei (S.U.A., Franţa, Germania). În
fosta U.R.S.S., se folosesc leşiile bisulfitice şi borhotul de la fabricarea alcoolului, iar în
Bulgaria, în afara leşiilor bisulfitice rezultate din hidroliza lemnului, se folosesc şi cele
obţinute din hidroliza cocenilor de porumb şi cojilor de floarea-soarelui.
Melasa
Prin melasă se înţelege ultimul reziduu care rămâne de la fabricarea zahărului, în
urma cristalizării repetate a zaharozei şi din care nu se mai poate obţine economic zahăr
prin cristalizare. În timpul primului război mondial, ca urmare a faptului că cerealele nu
mai erau în cantităţi suficiente, la fabricarea drojdiei plămezile amidonoase zaharificate
au fost înlocuite cu melasă, care avea un preţ mai convenabil şi era mai uşor de depozitat
decât cerealele. În prezent, în S.U.A., Europa, Australia ca şi la noi în ţară, melasa este
principala materie primă folosită la fabricarea drojdiei de panificaţie şi în condiţii
dirijate, 4 g melasă (aproximativ 2 g zaharoză) pot contribui la obţinerea unui gram de
drojdie de panificaţie
Caracteristici fizico-chimice
19
Din punct de vedere fizic, melasa se prezintă ca un lichid vâscos, având o culoare
brună-neagră, cu miros plăcut de cafea proaspăt prăjită şi un gust dulce-amărui. Reacţia
melasei este, de regulă, uşor alcalină.
Compoziţia chimică a melasei variază în funcţie de materia primă folosită la
fabricarea zahărului (sfeclă sau trestie de zahăr) şi de procesul tehnologic aplicat în
fabricile de zahăr (tabelul 3).
Provenienţa melasei
Compusul
Sfeclă de zahăr Trestie de zahăr
Apă, % 20-25 15-20
Substanţă uscată, % 75-80 80-85
Zahăr total, % 44-52 50-55
Zahăr invertit, % 0,1-0,5 20-23
Rafinoză, % 0,6-1,8 -
Azot total, % 1,2-2,4 0,3-0,6
Substanţe minerale, % 7,6-12,3 10-12
PH 6,0-8,6 <7
Melasa din sfeclă de zahăr are avantajul că favorizează obţinerea unui produs de
culoare mai deschisă, în schimb conţine betaină ce nu este asimilată de către drojdie şi
astfel prin deversarea apelor reziduale creşte consumul biochimic de oxigen. De
asemenea poate fi deficitară în biotină, vitamină necesară creşterii drojdiilor.
20
drojdiei
Substanţă uscată, % 71,0 85,0 74,0 min. 75,0
Zahăr (polarimetric), % 40,0 54,0 46,0÷50,0 min. 45,0
Zahăr invertit, % 9,1 10,0 max. 1,0 max. 1,0
Rafinoză, % - 2,5 max. 1,0 -
Azot total, % 0,5 2,1 min. 1,4 min. 1,4
Azot aminic, % 0,1 0,5 min. 0,3 min. 0,4
Cenuşă (fără Ca), % 5,0 12,0 max. 7,0 max. 12
Potasiu (K2O),% 2,0 5,0 min.3,5 -
Calciu (CaO), % 0,1 1,5 max. 1,0 -
Biotină, mg/t 30 125 200 -
SO2(anhidridă sulfurică),% 0,01 0,07 max. 0,05 max. 0,08
Acizi volatili, % 0,5 1,8 max. 1,2 max. 1,2
Culoare, ml iod 0,1 n la
0,4 10,0 max. 2,0 -
100ml melasă 2%
Ph 4,9 8,5 6,5÷8,5 min. 7,0
Melasa din trestie de zahăr este bogată în biotină, în schimb biomasa de drojdie
obţinută are o culoare mai închisă, încât sunt necesare operaţii suplimentare de spălare.
Pentru a asigura un mediu optim de creştere, se pot folosi melase cupajate în care se
adaugă fosfaţi, surse de azot, factori de creştere; totuşi, la noi în ţară se preferă utilizarea
melasei din sfeclă de zahăr la fabricarea drojdiei de panificaţie, melasa din trestie de
zahăr fiind folosită la fabricarea alcoolului. Compoziţia chimică a melasei obţinută la
fabricarea zahărului din sfeclă de zahăr este prezentată în tabelul 4
Concentraţia în substanţă uscată a melasei se exprimă în practică în grade Balling
(Bllg) sau Brix (Bx), care reprezintă procente masice de substanţă uscată dizolvată.
Glucidele din melasa de sfeclă de zahăr sunt reprezentate în cea mai mare parte
din zaharoză, alături de care se mai găsesc cantităţi mici de rafinoză şi zahăr invertit. Un
procent mai ridicat de 1% denotă contaminarea melasei cu microorganisme care produc
invertirea zaharozei.
Nezahărul melasei cuprinde atât substanţe organice (substanţe azotoase şi
neazotoase) cât şi săruri minerale.
Substanţele cu azot sunt reprezentate în special prin produse de descompunere a
proteinelor şi în mai mică măsură prin proteine macromoleculare. Dintre acestea în
21
cantitatea cea mai mare se găseşte betaina, care poate să ajungă până la circa 5% faţă de
melasă. Dintre aminoacizi în cantitatea cea mai mare se află acidul glutamic.
Cantitatea de substanţe azotoase, exprimate sub formă de azot total variază între
1,2 şi 2,4%, din care azotul asimilabil reprezintă 0,4÷0,6%, cantitate care este insuficientă
pentru nutriţia drojdiei. Din această cauză, atât la fabricarea alcoolului cât şi a drojdiei
este absolut necesară adăugarea de săruri de azot sub formă de sulfat de amoniu, fosfat de
amoniu, apă amoniacală, uree, ş.a.
Substanţele fara azot cuprind:
• pectine,
• hemiceluloze şi produsele lor de hidroliză (arabinoză şi galactoză)
• săruri ale acizilor organici.
Dintre vitamine s-au găsit în melasa din sfeclă de zahăr, tiamina, piridoxina şi
acidul pantotenic. Conţinutul melasei în vitamine prezintă o mare importanţă la fabricarea
alcoolului şi mai ales a drojdiei.
Sărurile minerale se află în proporţie de 6÷8% faţă de melasă şi sunt reprezentate
de săruri de K, Na, Ca şi Mg ale acizilor carbonic, sulfuric, fosforic, ş.a. Conţinutul în
fosfor al melasei este foarte scăzut, de aceea în procesul de fabricaţie se procedează la
corectarea conţinutului în fosfor al melasei prin adaos de superfosfat sau fosfat de
amoniu. Melasa conţine cantităţi suficiente de Ca, în timp ce conţinutul ei în magneziu
este scăzut, în special atunci când se tratează zemurile pentru purificare cu schimbători de
ioni. Deficitul de magneziu al melasei se corectează prin adaos de sulfat de magneziu.
Dioxid de sulf ce provine din procesul tehnologic de obţinere a zahărului, fiind
folosit pentru decolorarea zemurilor de difuziune, cât şi nitriţi formaţi prin reducere din
nitraţi. Prezenţa SO2 şi nitriţilor este nedorită deoarece inhibă activitatea drojdiilor. Din
acest motiv conţinutul melaselor în SO2 nu trebuie să depăşească 0,008% (Hopulele, T.,
1980).Un loc aparte în compoziţia melasei îl ocupă coloizii de natură proteică, pectică,
melanoidinică, care împiedică funcţionarea normală a celulei de drojdie şi produc o
spumă abundentă, nedorită, în linurile de fermentare. Din această cauză este necesară
limpezirea melasei.
22
Melasa mai conţine substanţe colorante, care se compun din melanoidine,
melanine, caramel, cât şi suspensii formate prin coagularea coloizilor şi precipitarea unor
săruri anorganice şi organice.
Compoziţia şi calitatea melasei diferă de la fabrică la fabrică şi chiar în cadrul
aceleaşi campanii, în raport cu:
- calitatea sfeclei de zahăr;
- natura solului pe care a fost cultivată sfecla de zahăr;
- cantitatea şi calitatea îngrăşămintelor aplicate solului;
- factorii meteorologici şi climatici;
- procesul tehnologic de extracţie a zahărului;
- condiţiile de depozitare a melasei.
Compoziţia chimică medie a melasei, în principalele microelemente este
prezentată în tabelul 5
Tabelul 5. Compoziţia chimică medie a melasei din sfeclă de zahăr (%)
Carbon
33
Azot 1,5÷2
Fosfor 0,03
Potasiu 6
Magneziu 0,025
Calciu 0,3
Vitaminele din melasă sunt reprezentate, în principal, din biotină, acid pantotenic
şi inozitol (tabelul 6)
23
(Acid
pantotenic)
B9 570*104
÷ 800*10
4
600*104
1000000
(Inozitol)
24
a drojdiilor. Conţinutul în nitriţi de 0,0004% reduce înmulţirea drojdiilor de cultură cu
50%, iar în cantitate de 0,02%, inhibă aproape în totalitate creşterea şi înmulţirea
celulelor, iar o parte din drojdii mor, în primul rând mugurii.
Dacă concentraţia nitriţilor în mediu se micşorează de la 0,0037 la 0,001 % în
cursul înmulţirii drojdiilor, randamentul drojdiei se îmbunătăţeşte cu 8÷10%, iar de la
concentraţii de 0,009 la 0,002% cu 17÷21% (Notkima, 1975).
Melasa are o încărcare microbiană ridicată şi se consideră o melasă bună aceea
care conţine până la 2·103 celule/g; cea de calitate inferioară are peste 3·104 celule/g.
25
Fosfatul diamoniacal tehnic (îngrăşământul complex), se utilizează ca sursă de
fosfor şi azot asimilabil în procesul de multilplicare a drojdiei. Este un amestec de mono
şi diamonofosfaţi, (NH4)H2PO4 şi (NH4)2HPO4, cu un conţinut foarte ridicat de fosfor
(54% P2O5) şi de azot (21% N2). Este solubil în apă (42 g/100 ml la 25 0C, 47,5 g/100 ml
la 500C şi 51,5 g/100 ml la 700C). Este insolubil în alcool etilic. Soluţia apoasă 1% are
pH-ul = 4,7, iar soluţia saturată are pH-ul = 3,1. Produsul trebuie să conţină minimum 95
% substanţă pură, max. 3 mg As/kg, max. 10 mg Pb/kg şi max. 20 mg/kg alte metale
grele.
Sulfatul de magneziu (MgSO4 · 7H2O) se utilizează ca sursă de magneziu la
multiplicarea drojdiei. Produsul pulbere trebuie să conţină 16,3% MgO şi să nu conţină
arsen mai mult de 0,0005%.
Amoniacul (NH3) se comercializează sub formă de soluţie de amoniac de sinteză
dizolvat în apă, cu o concentraţie minimă de 25%. Se utilizează ca sursă de azot şi pentru
corectarea pH-ului. Amoniacul se adaugă, de regulă, sub formă de apă amoniacală
obţinută prin diluarea amoniacului cu apă în raport de 1:5.
Superfosfatul de calciu se obţine prin tratarea făinii de oase cu acid sulfuric şi este
un amestec format din 3 moli de fosfat monocalcic şi 7 moli sulfat de calciu. Este o sursă
de fosfor ce conţine 16÷18% P2O5. Conţinutul în arsen trebuie să fie de maximum
0,006%.
Ureea este o sare solubilă în apă ce conţine circa 46% azot din s.u., utilizându-se
sub formă de soluţie prin diluare cu apă în cantitate de 10÷12 litri la 1 kg de substanţă.
Acidul ortofosforic (H3PO4) se utilizează ca sursă de fosfor şi pentru reglarea pH-
ului plămezilor. În industria drojdiei de panificaţie se utilizează H3PO4 tehnic, care să
conţină minimum 73% H3PO4 şi maximum 0,0001% As.
Clorura de potasiu (KCl) se foloseşte pentru corectarea plămezilor de melasă în
potasiu. Trebuie să conţină minimum 57÷60% KCl pură.
Factorii de creştere.
Pentru multiplicare, drojdiile sunt dependente de prezenţa în mediul de culturã a
unor substanţe numite factori de creştere.
26
Biotina intervine în multe din reacţiile metabolismului glucidelor şi azotului şi în
biosinteza proteicã (în carboxilarea acidului piruvic, în sinteza acizilor nucleici, în
formarea bazelor purinice şi pirimidinice) şi în sinteza acizilor graşi.
Celula de drojdie nu este capabilã sã sintetizeze biotina, dar prezenţa ei în mediu este
necondiţionat legatã de o producţie rentabilã. Cerinţa drojdiei în biotinã scade parţial la
prezenţa în mediu a aminoacizilor dicarboxilici (acid aspartic şi acid glutamic).
Eficacitatea aminoacizilor se măreşte în condiţii de aerare intensã. De exemplu, dacã
la aerarea slabã a mediului, care conţine aminoacizi dicarboxilici, la 100 g drojdie sunt
necesare 200 μg biotinã, atunci în condiţii de aerare intensã sunt suficiente 50 μg. În
melasã biotina se găseşte în cantitate de aproximativ 80 μg/kg. Acizii graşi, saturaţi si
nesaturaţi cu lanţ de 16 si 18 atomi de C şi esterii lor etilici adăugaţi împreunã cu acidul
aspartic sunt capabili sã înlocuiască biotina în creşterea drojdiilor de panificaţie în
condiţii aerobe.
Acidul pantotenic influenţează metabolismul drojdiilor atât în condiţii aerobe cât
şi anaerobe. El participã în transferul grupării acyl, ca un component al coenzimei A, în
metabolismul glucidelor şi al acizilor graşi. Vitamina B3 este unul din cei mai importanţi
stimulatori ai creşterii şi activităţii fermentative a drojdiilor. Ea se găseşte în melasã în
cantităţi suficiente (50 ppm).
Inozitolul stimulează creşterea drojdiilor, deficitul în inositol producând o slăbire
a metabolismului glucozei atât în condiţii aerobe cât şi anaerobe. Inositolul, în special
ataşat de lipide, acţionează ca un component structural. Activitatea fosfofructokinazei
este afectatã de deficitul în inositol (Ghosh si Bhattacharyya, 1967).
Tiamina catalizează decarboxilarea acizilor α-cetonici, ca acidul piruvic, acidul
α-cetoglutaric, are un rol fundamental în metabolismul aerob al glucidelor. Derivatul
tiaminei, tiamino-pirofosfatul este cofactor pentru multe enzime, care catalizează
procesele de decarboxilare: piruvatdecarboxilaza, piruvat-dehidrogenaza. Celula de
drojdie este capabilã sã sintetizeze tiamina în prezenţa ATP şi ionilor de magneziu, totuşi
adaosul de tiaminã în mediu stimulează suplimentar creşterea culturii. Tiamina este
termostabilã rezistând la sterilizarea mediului.
27
Piridoxina participã la decarboxilarea, dezaminarea şi transaminarea
aminoacizilor absorbiţi, iar acidul paraaminobenzoic la fixarea polipeptidelor.
Riboflavina este sintetizată de către toate drojdiile. Derivaţii riboflavinei, cum ar
fi flavinadenindinucleotidul (FAD), flavinmono-nucleotidul(FMN) şi alţii, sunt cofactorii
multor oxidoreductaze şi joacă un rol important în reacţiile de oxidoreducere. Riboflavina
este termostabilă. Atunci când celulele de drojdie de panificaţie sunt transferate din
condiţii anaerobe de cultură în condiţii aerobe, în timpul propagării industriale, conţinutul
de riboflavină creşte, iar creşterea este maximă în faza de creştere semiaerobă.
Produse biostimulatoare:
Extractul de porumb - obţinut prin concentrarea apelor de înmuiere ale
porumbului şi obţinerea de amidon poate fi o sursă de microelemente şi vitamine din
grupul B. Compoziţia sa este prezentată în tabelul 7
În extract se află aminoacizi cu rol de biostimulatori şi vitamine, dintre care
biotina este prezentă în cantităţi apreciabile (150÷200 mg/100 g).
28
constată de asemenea că proteinele din extract pot lega biotina într-o formă inaccesibilă
pentru celula de drojdie.
Extractul apos din radicele de malţ
Prin obţinerea de extracte 1:10 şi păstrare 2 ore la 500C şi filtrare, filtratul poate conţine
1,9% glucide/s.u. şi 2,3% azot solubil/s.u. Prin concentrare la 50% substanţă uscată se
poate conserva. Radicelele de malţ conţin vitamine din grupul B, vitamina E,
provitaminele A şi D, biotină şi aminoacizi cu rol biostimulativ. Compoziţia chimică
medie a radicelelor de malţ este prezentată în tabelul 8.
Germeni de cereale (grâu şi porumb). Germenii de cereale sunt subproduse rezultate din
procesul de măcinare, în proporţie de până la 10% din greutatea cerealelor supuse
prelucrării.
Germenii de cereale conţin pe lângă lipide, protide, numeroase substanţe care
îndeplinesc rolul de factori de creştere pentru drojdii (vitamine şi aminoacizi), şi conţin
în cenuşă, microelemente cu rol de activatori ai enzimelor celulare participante la
metabolismul fermentativ/oxidativ al drojdiei-tabelul 9.
Germenii de grâu sunt utilizaţi şi ca sursă de vitamină E. Valorificarea principală a
germenilor de porumb o constituie extragerea uleiului care are un conţinut ridicat de acid
linoleic şi, prin aceasta, proprietăţi dietetice.
29
Tabelul 9. Compoziţia germenilor de cereale (grâu şi porumb) în substanţe cu rol
favorizant în activizarea drojdiei Saccharomyces cerevisiae
Tabelul 10.
Tabel 11.
Aminoacizi g / 100g extract
Substanţe
Arginina 0,38 0,51 Concentraţie
Lizina 0,34 0,36 minerale
Metionina 0,08 0,1 Ca 0,014 ÷ 0,018%
Valina 0,27 0,33
Histidina 0,15 0,19 P 2,33 ÷ 2,34%
Izoleucina 0,28 0,26 K 2,34 ÷ 2,36%
Leucina 0,42 0,44
Na 0,092%
Treonina 0,4 0,28
Cisteina 0,09 0,08 Mg 0,1÷1,23%
Fenilalanina 0,19 0,31 Zn 201 ppm
Triptofan 0,06 0,08
Tirozina 0,24 0,35 Fe 203 ppm
30
Mn 54 ppm
Cu 15,5 ppm
31
Acidul sulfuri se utilizează pentru corectarea Ph-ului mediilor de cultură. Are o
concentraţie de circa 96÷98% substanţă pură. Se foloseşte acid sulfuric obţinut prin
procedeul de contact care conţine o cantitate redusă de arsen de max. 10 mg/kg. Întrucât
la diluarea acidului sulfuric se dezvoltă o cantitate mare de căldură este interzis să se
toarne apă în acid, ci în mod treptat acid în apă, sub agitare.
Substanţele antispumante
La fabricarea alcoolului şi în special a drojdiei de panificaţie şi furajere se
formează cantităţi mari de spumă datorită coloizilor din melasă care se dispun la
suprafaţa bulelor de aer care barbotează în mediu, stabilizând spuma formată. Cu cât
melasa este mai bogată în substanţe coloidale şi deci insuficient limpezită cu atât
cantitatea de spumă formată este mai mare.
Substanţele antispumante se utilizează pentru împiedicarea formării spumei sau
pentru distrugerea spumei deja formate. Ca antispumanţi se utilizează acidul oleic, uleiul
siliconic, octadecanolul, polipropilenglicolul, hidrocarburi parafinice, ş.a.
Substanţele antispumante folosite trebuie să fie inofensive pentru drojdie sau chiar
asimilabile, să nu producă murdărirea utilajelor şi conductelor tehnologice şi să nu
influenţeze negativ asupra aspectului exterior, gustului şi mirosului drojdiei de
panificaţie.
Substanţele antiseptice şi dezinfectante
Atât la fabricarea alcoolului cât şi a drojdiei sunt folosite o serie de substanţe cu
acţiune antiseptică sau dezinfectantă.
Substanţele antiseptice se folosesc pentru combaterea microorganismelor de
contaminare în cursul fermentaţiei plămezilor, în doze bine stabilite, la care să nu fie
influenţată negativ activitatea fermentativă a drojdiei.Dintre antisepticii mai des utilizaţi
sunt acidul sulfuric, formalina şi pentaclorfenolatul de sodiu.
Prin adăugare de acid sulfuric în plămezile de drojdie se creează o aciditate
ridicată care inhibă dezvoltarea bacteriilor de contaminare, în timp ce activitatea drojdiei
este puţin influenţată. Prin tratarea laptelui de drojdie cu acid sulfuric până la un pH
scăzut de 2,0÷2,4 se realizează, de asemenea, o purificare a drojdiei în vederea
însămânţării.
Formalina se foloseşte ca antiseptic în special la fermentarea plămezilor din
cereale şi cartofi, fiind utilizată în doze de 0,015÷0,02% faţă de plămadă si deasemeni se
foloseşte ca dezinfectant în soluţii cu concentraţia de 3÷5% aldehidă formică şi chiar
până la 10% pentru dezinfectarea conductelor şi utilajelor tehnologice. Fiind o substanţă
volatilă, se sporeşte eficienţa ei prin introducere de abur în urma tratamentului cu
formalină.
Pentaclorfenolatul de sodiu se utilizează ca antiseptic la fermentarea plămezilor
de melasă în cantităţi de 60÷90 g/tona de melasă, sub forma unei soluţii alcoolice cu
concentraţia de 12÷17% substanţă pură. Prin adaos de pentaclorfenolat de sodiu se pot
fermenta plămezile din melasă fără sterilizare termică. Nu se recomandă folosirea acestui
antiseptic atunci când din borhotul obţinut de la fabricarea alcoolului din melasă urmează
să se producă drojdie furajeră, deoarece antisepticul se acumulează în drojdie şi este
dăunător pentru animale şi păsări.
Pentru a obtine mai mult mediu de lucru s-a facut multiplicarea in 10 eprubete pe mediu
MMA. Mediul de lucru astfel obtinut sa intodus la termostatare timp de 3 zie la temperaura de
25ºC.
Drojdia izolata dintr-o colonie rosie rezultata din microbiota epifita a merelor a format
pe MEA, dupa 3 zile de cultivare, colonii cu diametrul de 1,5-3mm, cu perimetrul circular, cu
suprafata striata rosu caramiziu. Celulele dezvoltatepe MEA timp de trei zile au forma ovoidala
si dimensiuni medii de 4-5μm, reproducerea avand loc prin imugurire pe intreaga suprafata.
Caracteristicile drojdiei sunt in concordonanta cu descrierea drojdiei Phaffia rhodozyma,
drojdie izolata de catre Herman Paff in anul 1960 si cunoscuta pentru abilitatea sa de a produce o
mare cantitate de astaxanthina.
35
Nr. Caractere morfologice
Drojdie
Crt. Macroscopice Microscopice
Phaffia rhodozyma Colonie cu Ø 2-2,5 Dim.celulei – 4,8μm
1
Drojdie izolata in laborator Perimetrul circular Forma ovoidala
Phaffia rhodozyma Colonie cu Ø 1,5-5 Dim.celulei 4-5 μm
2
Tulpina industriala Perimetrul circular Forma ovoidala
In mod normal, pentru identificarea unei drojdii sunt necesare teste biochimice prin care se pune
in evidenta capacitatea ei de a asimila si / sau fermenta anumite glucide, precum si preferintele
acestora pentru anumite surse de azot.
In lipsa posibilitatii de a investiga caracterele biochimice si fizice ale drojdiei izolate, se poate
concluziona doar ca drojdiile izolate de pe mere ar putea fi din genul Phaffia.
36
CAPITOLUL IV
PRODUCEREA DE BIOMASA DE
Phaffia rhodozyma
Se obtin prin dozarea si dizolvarea succesiva sau suspendarea in apa a unor ingrediente de
natura organica / anorganica, conform retetelor de obtinere.Gratie utilizarii metodelor matematice
de planificare a experientelor a fost elaborat un mediu de cultura, prin intermediul caruia este
posibila majorarea productivitatii in biomasa drojdiei Phaffia rhodozyma.
. Dupa sterilizarea mediului de cultura a avut loc inocularea acestuia. Inocularea s-a
realizat cu ajutorul unui inocul ce contine o concentratie de 1,2· 108
cel/cm . Dozarea acestuia s-
3
Dupa inoculare paharele Erlenmayer s-au pus pe agitator timp de 24h. Urmatoarea
operatie dupa agitare a fost colectarea lichidului de la suprafata mediului de cultura care a fost
supus unei citiri cu refgractometrul, acest indice ajuta la determinarea cantitati de glucoza al
lichidului cultural. In paralel cu probele de analizat s-a citit indicele de refractie si la lichidul
prelevat de la mediul de cultura neinoculat.
Rezultatele sunt afisate in tabelul 12 de mai jos:
Nr.crt Lichidul supus citirii Indicele de refractie
37
.
1 Proba martor- mediu de cultura neinoculat 3.8
2 Proba 1 1.1
3 Proba 2 1
Dupa cultivare, centrifugare si uscare biomasa a fost separata intr-un vas steril, in conditii
aseptice, fiind mai apoi pastrata la frigider, pana in momentul extractiei, in vederea dezvoltarii
cantitatii de astaxantina.
Extractia de astaxantina s-a realizat amestecand 13 ml suspensie de drojdie cu 6 bile mici,
de metal, dupa care s-a introdus in moara cu bile in vederea distrugerii peretilor celulari ai
drojdiei. Extragerea metabolitului s-a realizat prin precipitare, folosidu-se ca agent de precipitare
acetona. Procesut a trecut prin trei etape repetitive pana la colectarea finala, dupa care s-a efectuat
4.3. Astaxanthina
Din punct de vedere chimic are o structura asemanatoare cu β- carotenul (din morcovi) si
vitamina A.
38
Astaxanthina este consumata de multe organisme acvatice inclusiv crustacee, printer care
si crevetele care secreta pigmentul in exoschelete si care ii da culaorea rosie. Crustaceele sunt la
randul lor consumate de catre pesti (pastrav, somon) sau pasari (flamingo, pasari rosii). Acestea
depoziteaza pigmentul la randul lor in piele si tesutul gras. Acesta este motivul pentru care
somonul si celelalte animale au culoarea rosie. Astaxanthina nu-si pierde din intensitate si de
aceea animalele raman cu coloratie roz-rosie. Prin includerea astaxanthinei in dieta pestilor,
functionand si ca un puternic antioxidant, este responsabila si pentru cresterea duratei de viata,
pentru imbunatatirea ratei de crestere si supravietuire a puietului, a imunitatii si rezistentei la stres
si foarte important a fecunditatii.
In prezent, pentru om, astaxanthina este utilizata ca un supliment alimentar. Cercetarile
arata ca datorita activitatii astaxanthinei ca puternic antioxidant ar putea fi benefic si in anumite
boli cardiovasculare si neurodegenerative. Cercetarile sustin ca imbunatateste sistemul imunitar
prin cresterea numarului de celule care produc anticorpi.
CAPITOLUL V
39
Imbunatatirea compozitiei mediului de cultura
in vederea produceri de astaxanthina
In vederea obtinerii unei cantitatati mai mare de produs de biosinteza, am adaugat o serie
de factori de crestere pentru a imbunatati conditiile optime in care drojdia produce cea mai mare
cantitate de astaxantina. Astfel am adaugat mediului de cultura, repartizat in mod egal in 6
eprubete, diverse adaosuri de:
Extract de drojdie
Extract de porumb si
Uree .
Amestecul din fiecare eprubeta a fost repartizat in cate o placa Petri si s-a procedat la
inocularea punctiforma in 5 locuri distincte a fiecareia cu drojdia Phaffia rhodozyma, placile fiind
termostatate timp de 3 zile la o temperatura de 25ºC.
Rezultatele cultivarii sunt cel mai bine reprezentate de figura 8
a) b)
40
c) d)
e) f)
Fig.8. Variatia intensitatii pigmetului la Phaffia rhodozyma, in urma cultivarii pe MM cu
adaos de diversi factori de crestere
a - 0,1 ml. uree; b - 0,2 ml. uree;
c - 0,1 ml. extract de drojdie; d - 0,2 ml.. extract de drojdie;
e - 0,1 ml.. extract porumb; f - 0,2 ml. extract porumb
Dupa cum se observa si in imagini culoarea drojdiei Phaffia rhodozyma difera in functie
de factorii de crestere folositi. Pe mediul cu uree culoarea este mult mai intensa.
41
CAPITOLUL VI
6.1.Carotenoidele
Reprezinta unul din cele mai numeroase si raspandite grupuri de pigmenti naturali. In
functie de natura carotenoidului, in prezent, ei se obtin prin sinteza chimica, sinteza microbiana
sau sunt extrasi din materie vegetala. Aproximativ 10% din carotenoizi sunt precursori ai
vitaminei A. In multe tari pigmentii carotenoidici sunt utilizati ca supliment alimentar dar isi
gasesc utilizarea si in cosmetologie si acvacultura.
Cererea de pigmenti carotenoizi, care este in permanenta crestere, impune necesitatea
maririi numarului de surse potentiale de obtinere a lor.
Pentru obtinerea unui bun producator de pigmenti carotenoidici s-a folosit ca agent
mutagen inhibitor al sintezei de steroli sau carotenoizi- clotrimazolul.
In acest scop s-au folosit trei eprubete cu continut de mediu initial si 2 % agar peste care
s-a adaugat clotrimazol dupa cum urmeaza:
• in prima eprubeta 0,32 mg
1g……………………10 mg clotrimazol
0,032 g……………….x mg clotrimazol
x = 0,32 mg clotrimazol
42
0,32 mg ………………….9 ml clotrimazol
y mg ……………………100 ml clotrimazol
y = 3,555 mg clotrimazol
1g……………………10 mg clotrimazol
0,067 g……………….x mg clotrimazol
x = 0,67 mg clotrimazol
y = 7,444 mg clotrimazol
1 g……………………10 mg clotrimazol
0,102 g……………….x mg clotrimazol
x = 1,02 mg clotrimazol
43
1,02 mg ………………….9 ml clotrimazol
y mg ……………………100 ml clotrimazol
y = 11,333 mg clotrimazol
Continutul fiecarei eprubete se repartizeaza uniform in cate o placa Petri, iar dupa
solidificarea mediului se trece la inteparea acestora cu drojdie Phaffia rhodozyma. Cele trei placi
Petri sunt intoduse la termostatare timp de 3 zile la o temperatura de 25ºC.
44
Dupa termostatare s-a facut o observare vizuala, dupa cum reiese din urmatorul tabel:
Tabel nr.13.
Nr. Clotrimazol Numar replicate Procentaj supravietuire
crt. (g)
1 0,032 5 80%
2 0,067 5 80%
3 0,102 5 100%
Din prima placa s-au prelevat celule de drojdie si s-a facut inocularea in doua eprubete cu
continut de MMA, in mod similar sa procedat si cu celelalte doua placi. Eprubetele astfel obtinute
au fost supuse operatiei de termostatare timp de trei zile la o temperatura de 25ºC.
Pentru continuarea experimentului s-au pregatit trei placi Petri ce contin mediu cu 2 %
agar si diferite cantitati de uree : in prima placa 0,1 ml uree (2 picaturi), in a doua placa 0,4 ml
uree (4 picaturi), iar cea de-a treia este folosita ca placa martor (fara uree). Din cele 6 eprubete,
45
scoase de la termostatare, s-a prelevat celule de drojdie si s-au inoculat in mediile pregatite, in
prealabil, in cele 3 placi.
Printr-o simpla observare vizuala se poate vedea o mai buna dezvoltare si o culoare mult
mai intensa a coloniilor de drojdie in placa cu continutul cel mai ridicat de uree. Clotrimazolul,
in concentratiile testate, nu a fost un bun agent mutagen iar in cercetarile viitoare se va incerca
imbunatatirea celulelor de drojdie, in vederea producerii de astaxantina, cu concentratii mai mari
de clotrimazol.
46
CONCLUZII
1. S-a realizat izolarea unei drojdii de culoare rosie in vederea producerii de astaxantina.
2. Pe baza caracterelor morfologice de natura macroscopica si microscopica drojdia a fost
identificata ca facand parte din genul Phaffia ssp. Rhodozyma
3. Drojdia izolata de pe mere si cultivata mai apoi pe mediu cu melasa a avut ca produs de
biosinteza astaxantina. In urma biosintezei s-a obtinut o cantitate de pigmenti
carotenoidici egala cu 0,194 mg / m drojdie.
4. In laborator s-au efectuat testari privind imbunatatirea mediului de cultura in vederea
obtinerii unui randament ridicat de astaxantina. Mediul cu continutul cel mai mare de uree
as-a dovetit a fi favorabil in vederea producerii unei cantitati mai mari de astaxantina fata
de celelalte medii utilizate anterior.
5. S-a incercat obtinerea unui mutant de drojdii, folosind ca agent mutagen Clotrimazolul in
concentratii de :
• 0,032 mg;
• 0,067 mg;
• 0,102 mg
47