Un cromforo es la parte de una molcula responsable de su color.

El color surge cuando una molcula absorbe ciertas longitudes de onda de la luz visible y transmite o refleja otras. El cromforo es una regin en la molcula, donde la diferencia de energa entre dos orbitales moleculares diferentes cae dentro de la gama del espectro visible. La luz visible que incide en el cromforo por lo tanto puede ser absorbido mediante la excitacin de un electrn desde su estado fundamental a un estado excitado. En las molculas biolgicas que sirven para capturar o detectar la energa de la luz, el cromforo es el resto que causa un cambio conformacional de la molcula cuando son golpeados por la luz. Conjugados cromforos sistema pi-bonos En los cromforos conjugados, los electrones saltan entre los niveles de energa que se extienden orbitales pi, creado por una serie de alterna enlaces simples y dobles, a menudo en sistemas aromticos. Los ejemplos ms comunes incluyen, diversos colorantes retina alimentos, colorantes textiles, indicadores de pH, el licopeno,-caroteno, y antocianinas. Varios factores en la estructura de un cromforo entran en la determinacin en qu regin de longitud de onda en un espectro del cromforo va a absorber. Alargamiento de prolongar un sistema conjugado con los bonos ms insaturados en una molcula tiende a desplazar la absorcin a longitudes de onda ms largas. Reglas de Woodward-Fieser se pueden utilizar para longitud de onda de mxima absorcin ultravioleta-visible aproximado en compuestos orgnicos con sistemas pi-enlace conjugado. Algunos de estos son cromforos de complejos metlicos, que contienen un metal en un complejo de coordinacin con los ligandos. Ejemplos son la clorofila y la hemoglobina. En estos dos ejemplos, un metal est complejado en el centro de un anillo de porfirina: siendo el metal de hierro en el grupo hemo de la hemoglobina, o de magnesio en el caso de la clorofila. El sistema pi-unin altamente conjugado del anillo de porfirina absorbe la luz visible. La naturaleza del metal central tambin puede influir en el espectro de absorcin del complejo o propiedades tales como la vida del estado excitado metaloporfirina. Auxochrome Un auxochrome es un grupo funcional de los tomos unidos al cromforo que se modifica la capacidad del cromforo para absorber la luz, alterando la longitud de onda o la intensidad de la absorcin. Halochromism en cromforos Halochromism se produce cuando una sustancia cambia de color como los cambios de pH. Esta es una propiedad de los indicadores de pH, cuya estructura molecular cambios sobre ciertos cambios en el pH circundante. Este cambio en la estructura afecta a un cromforo en la molcula de indicador de pH. Por ejemplo, la fenolftalena es un indicador de pH cuya estructura cambia a medida que los cambios de pH como se muestra en la tabla siguiente: En un intervalo de pH de aproximadamente 0-8, la molcula tiene tres anillos aromticos, todos los unidos a un tomo de carbono hibridado sp3 tetradrica en el medio que no hace que el p-unin en el conjugado de anillos aromtico. Debido a su limitada extensin, los anillos aromticos slo absorben luz en la regin ultravioleta, por lo que el compuesto parece incoloro en el rango de pH 0-8. Sin embargo, como el pH aumenta ms all de 8,2, que el carbono central se convierte en parte de un doble enlace convertirse hibridacin sp2 y dejando un orbital p a solaparse con la p-unin en los anillos. Esto hace que los tres anillos conjugan entre s para formar un cromforo que absorbe la luz visible extendida mayor longitud de onda para mostrar un color fucsia. En los rangos de pH fuera 0-12, otra estructura molecular cambios dan lugar a otros cambios de color; ver fenolftalena para ms detalles. Efecto hipercrmico El efecto hipercrmico es el incremento de absorbancia en un material. El caso opuesto es el efecto hipocrmico. El caso ms conocido es la hipercromicidad del ADN, que ocurre cuando el dplex se desnaturaliza, dando dos cadenas sencillas que absorben ms en el ultravioleta. Esta caracterstica del ADN es una forma de seguir el proceso de desnaturalizacin de la molcula: a medida que el proceso avanza, se observa un incremento en la absorbancia.

La espectrofotometra UV-Vis tiene multitud de aplicaciones fisicoqumicas, que en parte estn basadas en la fuerte dependencia de los espectros UV-vis con la temperatura, el pH, el estado fsico de la muestra, el disolvente, etc., dependencias que siempre se pueden relacionar con propiedades fisicoqumicas de las molculas de que est formada la sustancia. Hay un experimento interesante que se puede hacer en la cocina: la observacin del cambio de color con el pH de los pigmentos contenidos en la col lombarda (derecha), como lo prueba la figura que encabeza este artculo, en la que se han etiquetado los valores de pH (de 1 a 12) en una serie de tubos que contienen extractos de este vegetal. En general, los compuestos que cambian de color con el pH son susceptibles de utilizarse como indicadores para detectar el punto de equivalencia en lasvolumetras cido-base. Como se sabe, estas sustancias presentan distintos colores a distintos pH debido a que, dependiendo de la concentracin de protones en el medio, estarn en una forma qumica u otra, existiendo un equilibrio entre ellas. Por ejemplo, si el indicador es un cido orgnico (llammoslo HA), estar en equilibrio con su base conjugada A de este modo: HA + H2O A + H3O
+ -

La proporcin relativa de HA y A depender de la concentracin de protones. As, si el indicador est en presencia de un cido, habr exceso de iones H3O y el equilibrio del indicador se desplazar hacia la izquierda (por el principio de Le Chtelier), predominando entonces la especie HA sobre la de A . Como ambas especies son de distinto dolor diferente, la disolucin mostrar el color de HA. Pero si agregamos una base, sus iones OH reaccionarn con los H3O , provocando que estos ltimos desaparezcan. Para restaurar el equilibrio, HA tendr a disociarse ms, favoreciendo la formacin de A . La disolucin se ver, entonces, del color de esta ltima especie. Evidentemente, el hecho de que HA y A tengan colores diferentes tiene que verse reflejado en sus espectros UV-Vis. De hecho, en los indicadores, los espectros de sus formas cida y bsica son, normalmente, muy diferentes. Cuando ambas formas coexisten en disolucin, lo que vemos es la suma de ambos espectros, como se ilustra en la siguiente figura:
+ +

Veamos un ejemplo concreto: el del indicador naranja de metilo(derecha) que en una valoracin cido-base cambia de rojizo a amarillo-anaranjado al ir aumentando el pH. La siguiente imagen muestra tresespectros de absorcin UV-visible superpuestos del naranja de metilo a otros tantos valores de pH. Los espectros resaltados en rojo y naranja son, esencialmente, los de la forma cida (HA) del naranja de metilo (con un mximo de absorcin a 506 nm) y de la forma bsica (A , con mximo a 464 nm), respectivamente. En cuanto al espectro trazado en color negro en la figura, es la suma de los correspondientes a ambas especies en las concentraciones relativas en que se encuentren a ese pH.
-

Los dos puntos en que las absorbancias del espectro global coinciden a todos los pH (puntos que se han destacado dentro de crculos azules) se llamanisosbsticos y su aparicin denota la existencia de un equilibrio qumico entre especies. Estos puntos, como se observa, tienen la propiedad de que en ellos la absorbancia es independiente del pH. (Por ello, son muy tiles en anlisis cuantitativo.) En esta otra imagen, que contiene espectros de naranja de metilo a nueve valores de pH, se observan an mejor:

Clculo de la constante de disociacin de un indicador cido Todas estas consideraciones nos van a permitir entender cmo puede determinarse por espectrometra UV-Vis la constante de acidez de un indicador cido dbil. El equilibrio qumico de este indicador (HA) con su base conjugada (A ) es: HA + H2O A + H3O La constante de equilibrio, Ka, de esa reaccin viene dada por: Ka = (a H3O+) (aA- ) / aHA donde las a son las actividades de las especies en disolucin. Si las disoluciones estn suficientemente diluidas, las actividades de las especies cida y bsica del indicador pueden igualarse a las concentraciones ( c) y podramos establecer la siguiente aproximacin: Ka (a H3O+) (cA- ) / cHA Tomando logaritmos y teniendo en cuenta las definiciones de pKa y pH: pKa = log Ka pH = log (a H3O+) se puede escribir: pKa pH + log (cHA / cA-) De la ltima expresin podremos conocer el pKa del indicador (y, por tanto, su contante de disociacin como cido, Ka) haciendo lo siguiente: 1. 2. 3. preparar una serie de tampones de pH bien conocidos y aadirles una pequea cantidad de indicador HA a todas; medir la relacin de concentraciones (cHA / cA-) de todas esas disoluciones (ms abajo explicamos cmo); calcular el pKa a partir de la expresin escrita ms arriba con los datos de todas las disoluciones debe obtenerse ms o menos el mismo valor y obtener la media; o bien, de forma ms elegante y que permite hacer una mejor estimacin de errores, representar grficamente log (cHA / cA-) frente al pH, representacin que debe dar una recta de ordenada en el origen pKa y pendiente 1. Pero, cmo calcular los valores de (cHA / cA-) que necesitamos. Muy sencillo: todo se basa en que las concentraciones de las especies son proporcionales a las absorbancias de sus bandas de absorcin medidas en un espectro UV-Vis segn establece la ley de Beer: A = cl siendo la absortividad molar de la especie, c su concentracin y l la longitud del camino ptico que recorre la radiacin. Se trabaja de este modo: 1. 2. 3. Se obtiene un espectro del indicador a pH muy bajo y otro a pH muy alto. De ese modo, tendremos los espectros de las especies cida (HA) y bsica (A ) del indicador (se muestran en una figura ms arriba). Observando los dos espectros, se elige una longitud de onda a la que las absorbancias de la especie cida ( AHA) y la bsica (AA-) sean muy diferentes (cuanto ms diferentes sean, menos error cometeremos en el clculo de Ka). Se obtienen varios espectros a pH intermedios (para lo cual el indicador se habr aadido a tampones de pH conocidos) y se miden las absorbancias Ade los espectros obtenidos a la misma longitud de onda a la que se midieron las absorbancias de las especies cida (AHA) y bsica (AA-). Con esos datos, y haciendo uso de la ley de aditividad de las absorbancias, segn la cual para cualquier longitud de onda debera cumplirse (en el caso ideal, si no existen interacciones intermoleculares):
+ -

A = AHA + AAno es difcil demostrar que (cHA / cA-) = (AA- A) / (A AHA)

La espectrometra de absorcin UV-vis tiene infinidad de aplicaciones en Qumica. Muchas sustancias absorben radiacin visible o ultravioleta caracterstica, es decir, tienen espectros de absorcin especficos que aporta informacin esencial para identificarlas. (En la figura anterior se muestran de izquierda a derecha las sales CuCl22H2O, CuSO45H2O, CoCl26H2O y NiCl26H2O; sus distintos colores indican distintas absorciones de radiacin). Adems, las medidas de la cantidad de radiacin absorbida (absorbancia) permiten, en general, cuantificar la concentracin de la sustancia. Cabe destacar un procedimiento especial para hacerlo: la valoracin fotomtrica, consistente en detectar el punto de equivalencia de una valoracin por medidas de absorbancia UV-Vis, siendo la tcnica especialmente adecuada cuando no se produce un cambio de color visible por el ojo pero s un cambio de absorcin detectable por un espectrofotmetro UV-Vis.

Una valoracin fotomtrica consiste en ir aadiendo reactivo valorante a la disolucin que contiene el analito que queremos determinar, el cual se sabe que presenta una banda de absorcin de determinada longitud de onda. Al ir reaccionando el valorante con el analito, este ltimo va desapareciendo y la absorbancia de la banda que estamos siguiendo disminuye. Es muy fcil saber cundo la reaccin a terminado (es decir, cuando el analito se ha consumido) porque desde ese momento la absorbancia se mantiene constante aunque aadamos ms valorante).

RESUMEN La espectrofotometra UV-visible es una tcnica analtica que permite determinar la concentracin de un compuesto en solucin. Se basa en que las molculas absorben las radiaciones electromagnticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la concentracin. Para hacer este tipo de medidas se emplea un espectrofotmetro, en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una solucin y medir la cantidad de luz absorbida por la misma. En esta prctica se darn a conocer las caractersticas generales y conceptos relacionados con la espectrofotometra. A continuacin y tras la explicacin del funcionamiento del espectrofotmetro se harn espectros de absorcin con el fin de determinar la longitud de onda donde la muestra presenta la mxima absorcin, y tras realizar las correspondientes rectas de calibrado se cuantificarn las concentraciones de distintas biomolculas. Palabras clave : Absorbancia; transmitancia; colorimetra; cromforo; espectro; rectas de calibrado. Abreviaturas empleadas. A: Absorbancia; 4-AP: 4-Aminoantipirina; FMN: flavin mononucletido; FMNH2: forma reducida del flavin mononucletido; I: intensidad de luz; N-NEDA: N-Naftol-1-etilendiamino; p-NP: p-nitrofenol; POD: Peroxidasa; T: transmitancia; UV: luz ultravioleta.

1. INTRODUCCIN Y OBJETIVOS

El estudio a nivel bioqumico de cualquier biomolcula requiere la utilizacin de tcnicas analticas que permitan su determinacin cualitativa y cuantitativa, as como su caracterizacin fsico-qumica y biolgica. Uno de los mtodos ms sencillos, accesibles, tiles y utilizados es la espectroscopa, en general, y la espectroscopa ultravioleta-visible, en particular. Se pueden identificar y cuantificar biomolculas en solucin y en muestras biolgicas, con el empleo de reactivos especficos que reaccionan con el compuesto a analizar y forman un producto coloreado que permite detectarlo en muestras complejas. El fundamento de la espectroscopa se debe a la capacidad de las molculas para absorber radiaciones, entre ellas las radiaciones dentro del espectro UV-visible. Las longitudes de onda de las radiaciones que una molcula puede absorber y la eficiencia con la que se absorben dependen de la estructura atmica y de las condiciones del medio (pH, temperatura, fuerza inica, constante dielctrica), por lo que dicha tcnica constituye un valioso instrumento para la determinacin y caracterizacin de biomolculas. Las molculas pueden absorber energa luminosa y almacenarla en forma de energa interna. Esto permite poner en funcionamiento ciclos vitales como la fotosntesis en plantas y bacterias. Cuando la luz (considerada como energa) es absorbida por una molcula se origina un salto desde un estado energtico basal o fundamental, E 1, a un estado de mayor energa (estado excitado), E2. Y slo se absorber la energa que permita el salto al estado excitado. Cada molcula tiene una serie de estados excitados (o bandas) que la distingue del resto de molculas. Como consecuencia, la absorcin que a distintas longitudes de onda presenta una molcula -esto es, su espectro de absorcin-constituye una sea de identidad de la misma. Por ltimo, la molcula en forma excitada libera la energa absorbida hasta el estado energtico fundamental.

Figura 1. Diagrama de niveles de energa en una molcula. La absorcin de energa luminosa hace que la molcula pase desde un

E -E = h 2 1

estado fundamental (E1) a otro excitado (E2). Posteriormente la molcula relaja su energa mediante distintos mecanismos (vibracin, rotacin, etc.)

En espectroscopa el trmino luz no slo se aplica a la forma visible de radiacin electromagntica, sino tambin a las formas UV e IR, que son invisibles. En espectofotometra de absorbancia se utilizan las regiones del ultravioleta (UV cercano, de 195-400 nm) y el visible (400-780 nm). 400 nm 700 nm

Luz visible Longitud de onda (metros)

Rayos gama Frecuencia (hertz) energa (electrnvoltios)

Rayos X

ultravioleta

infrarrojo

microondas

Figura 2. Espectro electromagntico

La regin UV se define como el rango de longitudes de onda de 195 a 400 nm. Es una regin de energa muy alta. Provoca dao al ojo humano as como quemadura comn. Los compuestos con dobles enlaces aislados, triples enlaces, enlaces peptdicos, sistemas aromticos, grupos carbonilos y otros heterotomos tienen su mxima absorbancia en la regin UV, por lo que sta es muy importante para la determinacin cualitativa y cuantitativa de compuestos orgnicos. Diversos factores -como pH, concentracin de sal y el disolvente- que alteran la carga de las molculas, provocan desplazamientos de los espectros UV. La fuente de radiacin ultravioleta es una lmpara de deuterio. En la regin visible apreciamos el color visible de una solucin y que corresponde a las longitudes de onda de luz que transmite, no que absorbe. El color que absorbe es el complementario del color que transmite. Por tanto, para realizar mediciones de absorcin es necesario utilizar la longitud de onda en la que absorbe luz la solucin coloreada. La fuente de radiacin visible suele ser una lmpara de tungsteno y no proporciona suficiente energa por debajo de 320 nm. longitud de onda aproximada 390 - 435 435 - 490 490 - 580 580 - 595 595 - 650 650 - 780 1.1. Transmitancia y Absorbancia Cuando un rayo de luz de una determinada longitud de onda de intensidad Io incide perpendicularmente sobre una disolucin de un compuesto qumico que absorbe luz o cromforo, el compuesto absorber una parte de la radiacin incidente (Ia) y Io color de luz que se absorbe Violeta Azul Verde Amarillo Naranja Rojo color de luz que se refleja o ve Amarillo verdoso Amarillo Rojo Azul Azul verdoso Verde azulado Ia It

dejar pasar el resto (It), de forma que se cumple: Io = Ia + It

La transmitancia (T) de una sustancia en solucin es la relacin entre la cantidad de luz transmitida que llega al detector una vez que ha atravesado la muestra, It, y la cantidad de luz que incidi sobre ella, Io, y se representa normalmente en tanto por ciento: % T = It/Io x 100 La transmitancia nos da una medida fsica de la relacin de intensidad incidente y transmitida al pasar por la muestra. La relacin entre %T y la concentracin no es lineal, pero asume una relacin logartmica inversa. La absorbancia (A) es un concepto ms relacionado con la muestra puesto que nos indica la cantidad de luz absorbida por la misma, y se define como el logaritmo de 1/T, en consecuencia: A = log 1/T = -log T = -log It/ Io. Cuando la intensidad incidente y transmitida son iguales (Io = It), la transmitancia es del 100% e indica que la muestra no absorbe a una determinada longitud de onda, y entonces A vale log 1 = 0. La cantidad de luz absorbida depender de la distancia que atraviesa la luz a travs de la solucin del cromforo y de la concentracin de ste. 1.2. Ley de Lambert-Beer Esta ley expresa la relacin entre absorbancia de luz monocromtica (de longitud de onda fija) y concentracin de un cromforo en solucin: A = log I/Io = cl La absorbancia de una solucin es directamente proporcional a su concentracin a mayor nmero de molculas mayor interaccin de la luz con ellas-; tambin depende de la distancia que recorre la luz por la solucin a igual concentracin, cuanto mayor distancia recorre la luz por la muestra ms molculas se encontrar-; y por ltimo, depende de , una constante de proporcionalidad -denominada coeficiente de extincin- que es especfica de cada cromforo. Como A es adimensional, las dimensiones de dependen de las de c y l. La segunda magnitud (l) se expresa siempre en cm mientras que la primera (c) se hace, siempre que sea posible, en M, con lo que las -1 -1 dimensiones de resultan ser M cm . Este coeficiente as expresado, en trminos de unidades de concentracin molar (o un submltiplo apropiado), se denomina coeficiente de extincin molar ( M). Cuando, por desconocerse el

peso molecular del soluto, la concentracin de la disolucin se expresa en otras unidades distintas de M, por -1 -1 -1 ejemplo gL , las dimensiones de resultan ser distintas, por ejemplo g Lcm , y al coeficiente as expresado se denomina coeficiente de extincin especfico (s). La ley de Lambert-Beer se cumple para soluciones diluidas; para valores de c altos, vara con la concentracin , debido a fenmenos de dispersin de la luz, agregacin de molculas, cambios del medio, etc. 1.3. Instrumentacin para la medicin de absorbancias de la luz visible y ultravioleta: espectrofotmetro UVvisible La medicin de absorbancia de la luz por las molculas se realiza en unos aparatos llamados espectrofotmetros. Aunque pueden variar en diseo, en especial con la incorporacin de ordenadores para el anlisis de datos, todos los espectrofotmetros constan, segn se indica en la figura, de: 1. Una fuente de energa radiante: lmpara de deuterio y tungsteno. 2. Un monocromador para la seleccin de radiaciones de una determinada longitud de onda: filtros, prismas, redes de difraccin. 3. Un compartimento donde se aloja un recipiente transparente (cubetas o tubos) que contenga la muestra Pueden ser de vidrio, cuarzo o plstico transparente. Para medir en UV se deben usar las de cuarzo o slice fundido, porque el vidrio no transmite la radiacin UV. 4. Un detector de luz y un amplificador convertidor de las seales luminosas en seales elctricas. 5. Un registrador o sistema de lectura de datos. Desde el punto de vista operativo, el primer paso es seleccionar la fuente de luz y longitud de onda a la que se va a realizar la medida. Hay espectrofotmetros de un solo haz (con una sola celdilla para alojar la cubeta con la muestra) y de doble haz (con dos celdillas para dos cubetas); en nuestro caso se trabajar con los de un solo haz. Se mide primero la absorbancia del disolvente (conocido como blanco) y al que se le asigna el valor de cero mediante el ajuste del mando, de forma que la intensidad incidente y transmitida sean iguales (I o = It), y por tanto la absorbancia es cero. A continuacin se pone en la celdilla la cubeta con la muestra y se lee la absorbancia de sta. ESPECTROFOTMETRO OH

Detector NO2 p-Nitrofenol Rendija salida Prisma dispersin Rendija entrada Muestra

Fuente luminosa Ajuste de longitud de onda Compartimento muestra ON/OFF Ajuste 0% T Ajuste de 100% T

1.4 Obtencin de un espectro de absorcin El espectro de absorcin es una representacin grfica que indica cantidad de luz absorbida () a diferentes valores de . A partir de una solucin diluida de un compuesto, cuya absorbancia mxima entra dentro del rango de medida del espectrofotmetro, se ver el valor de absorbancia a diferentes longitudes de onda frente a un blanco que

contenga el disolvente de la solucin de la muestra a caracterizar. A partir del espectro de absorcin se obtendr el valor de al que el compuesto presenta la mayor absorbancia ( max). Dicho se utilizar a la hora de hacer determinaciones cualitativas y cuantitativas del compuesto. El espectro de absorcin de un cromforo depende, fundamentalmente, de la estructura qumica de la molcula.

loroplasto pigmentos Absorcin de los

Clorofila a Clorofila b Carotenoides

Espectros de absorcin de tres pigmentos fotosintticos cloroplastdicos. Observar que un compuesto puede tener ms de un pico de absorcin (max).

Longitud de onda (nm) No obstante, hay una gran cantidad de factores que originan variaciones en los valores de max y M, entre los que se incluye el pH, la polaridad del solvente o molculas vecinas y la orientacin de los cromforos vecinos; y cada uno afecta de forma particular. Por ejemplo, variaciones originadas por cambios de pH son debidas al efecto de ste sobre la ionizacin del compuesto. A continuacin se muestran como ejemplo los espectros de absorcin de HNTS (un reactivo empleado para la determinacin de especies oxidantes) y comprobndose que por espectrotometra se puede seguir el efecto que ejercen el pH y los oxidantes.

Efecto del pH en la absorcin de HNTS. Espectros 1 y 2 en medio cido (mximo de absorcin a 370 nm); espectros 3 y 4 en medio bsico (mximo a 410 nm). 1.5 Curvas de calibrado

Desplazamiento del mximo de absorcin y descenso de absorbancia cuando el HNTS se incuba con H2O2 a distintos tiempos (0, 5, 10 y 15 minutos).

Para obtener una curva de calibrado de un compuesto se preparan soluciones de diferentes concentraciones del mismo, determinndose para cada una de ellas el valor de absorbancia a max. Estos valores de absorbancia se representan en el eje de abscisas (eje de x) y los de concentracin en el eje de ordenadas (eje de y). Se observar que, a bajas concentraciones, el aumento de concentracin se corresponde con un incremento lineal en la absorbancia (zona de cumplimiento de la ley de Lambert-Beer). A concentraciones altas la linealidad se pierde y se observa que la lnea se aplana, por lo que las medidas son poco fiables. La representacin de Lambert-Beer, A = cl, nos permitir calcular el valor del coeficiente de extincin molar, que corresponde a la pendiente de la recta.