KROMATOGRAFI KOLOM

Tresna Lestari, M.Si., Apt

PENGERTIAN
Kromatografi kolom adalah kromatografi yang menggunakan kolom sebagai alat untuk memisahkan komponen-komponen dalam campuran.

KROMATOGRAFI KOLOM
Merupakan kelanjutan dari KLT Prinsip sama dengan kromatografi lapis tipis Digunakan untuk memurnikan senyawa atau memisahkan campuran Dilaksanakan dalam suatu kolom yang diisi dengan fase diam Fase diam : Padat, cair Fase gerak : Cair, gas

PEMBAGIAN KROMATOGRAFI KOLOM

Fase Diam Fase Gerak Cair Padat Gas Cair Gas Jenis Kromatografi KK, KCV, KCKT KG KCKT KG

Cair

MAKANISME PEMISAHAN KROMATOGRAFI KOLOM

Kromatografi Adsorbsi, komponen yang dipisahkan secara selektif teradsorbsi pada permukaan adsorben. Kromatografi Partisi, analit mengalami partisi antara lapisan cairan fase diam (stasioner) & eluen sebagai fase gerak (mobile). Kromatografi Pertukaran Ion, komponen berbentuk ion yang terikat pada penukar ion sebagai fase stasioner secara selektif akan terlepas/terelusi oleh fase mobile.

Kromatografi Filtrasi Gel, fase diam berupa gel permeabel, pemisahan berlangsung spt proses pengayakan yg didasarkan pd ukuran molekul dr komponen yg dipisahkan.

KROMATOGRAFI ADSORBSI
Zat padat sebagai adsorben / fase stasioner Alumina & silika gel paling populer Urutan dari kemampuan adsorbsi besar ke kecil : Alumina Charcoal Silika gel Magnesium Kalium karbonat Sukrosa Starch Selulosa

POLAR

 Zat cair sebagai fase gerak/mobile

Elusi terlalu cepat tidak mampu memisahkan campuran dengan baik

Elusi terlalu lambat menyebabkan waktu retensi terlalu lama

Golongan pelarut yang diurutkan berdasarkan kenaikan adsorbilitasnya pd kolom alumina :

Perfluorokarbon Hidrokarbon jenuh Hidrokarbon tak jenuh Halida & eter Aldehid & keton Alkohol & thiol Asam & basa

POLAR

KROMATOGRAFI KOLOM KLASIK

Didasarkan pada adsorbsi komponen campuran dengan afinitas berbeda terhadap permukaan fase diam. Adsorben bertindak sebagai fase diam dan fase geraknya adalah cairan yang mengalir membawa komponen campuran sepanjang kolom. Sampel yang mempunyai afinitas besar terhadap adsorben akan secara selektif tertahan dan afinitasnya paling kecil akan mengikuti aliran pelarut.

Cara Penggunaan Kromatografi Kolom

1. Sampel dikeringkan menggunakan fase diam 2. Sampel dituangkan melalui atas kolom 3. Masukkan pelarut ke dalam kolom 4. Komponen dalam sampel teradsorbsi oleh bahan penyerap berupa pita sempit pada permukaan kolom.

5. Dengan penambahan pelarut secara terus menerus, masing-masing komponen akan bergerak turun melalui kolom dan akan terbentuk pita yang setiap zona berisi satu macam komponen.

6. Setiap zona yang keluar kolom dapat ditampung dengan sempurna sebelum zona yang lain keluar kolom.

Gambar kromatogafi kolom

HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY

Fase stasioner berupa cairan dan padatan Fase diam cair :
Pelarut lebih polar (kromatografi fase normal) Pelarut non polar (krom fase terbalik)

Fase diam padat :

Pellicular beads Bagian dalam padat tidak berpori Terbuat dari silika Microporous particle Ukurannya kecil 3-10mm sehingga luas permukaan besar Effisiensi tinggi karena jumlah plat teoritik 10.000 dalam kolom 25 cm.

HPLC FASE NORMAL

a. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan mungkin kurang dari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm. b. Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan fase gerak non polar misalnya heksan. c. Senyawa-senyawa polar dalam campuran akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding dengan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar akan lebih cepat melewati kolom.

HPLC FASE TERBALIK

a. Ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. b. Fase gerak yang digunakan pelarut polar berupa campuran air dan alkohol seperti metanol. c. Senyawa-senyawa non polar akan terikat lebih lama di dalam kolom sehingga memiliki waktu retensi yang lebih lama.

Rangkaian Dasar Kolom HPLC

1. Eluen, berfungsi sebagai fase gerak yang akan membawa sampel masuk ke dalam kolom pemisah. 2. Pompa, berfungsi untuk mendorong eluen dan sampel masuk ke dalam kolom. Kecepatan alir dapat dikontrol dan perbedaan kecepatan bisa mengakibatkan perbedaan hasil. 3. Injektor, tempat memasukkan sampel dan selanjutnya sampel dapat didistribusikan masuk ke dalam kolom.

4. Kolom pemisah, untuk memisahkan komponen yang ada dalam sampel.

5. Detektor, berfungsi membaca komponen yang lewat ke dalam detektor.

6. Rekorder data, berfungsi merekam dan mengolah data yang masuk

KOLOM
Dari bahan stainless steel. Panjang 10-25 cm dan diameter 4,5-5,0 mm yg diisi dg fase stationer berukuran rata-rata 5-10mm.

DETEKTOR
Mempunyai sensitivitas yang tinggi
Bersifat linear untuk jangka konsentrasi tertentu Dapat mendeteksi eluen tanpa mempengaruhi resolusi kromatogam

Tidak terlalu peka terhadap perubahan berbagai parameter terutama suhu & tekanan

MACAM DETEKTOR
Detektor UV
Untuk senyawa yang mempunyai serapan khusus di daerah UV & sinar tampak.

Pengukuran secara kuantitatif berdasar Hk Lambert-Beer yang menghubungkan besaran absorbansi dengan konsentrasi solut.
Terdapat daerah deteksi UV (200-400nm) dan sinar tampak (400-700 nm) sehingga dapat mendeteksi hampir semua senyawa organik.

Detektor Fluoresensi

Untuk senyawa yang dapat berfluoresensi seperti aflatoksin, seny aromatik berinti banyak, vitamin tertentu & derivat asam amino.

Sangat peka & dapat mendeteksi kadar senyawa yang sangat kecil
Kepekaan terhadap senyawa asing sebagai kontaminan dalam eluen dapat mengganggu kuantifikasi senyawa yg diukur.

 Detektor Konduktivitas

Untuk mengukur senyawa yang bersifat ionik Perlu dihindari penggunaan buffer ion karena mempunyai konduktivitas yang tinggi

Detektor Indeks Refraksi

Prinsip kerja perubahan nilai indeks refraksi dari suatu cairan yang mengalir

Untuk analisis gula dan lemak

Detektor FID (Flame Ionization Detector)

Senyawa pelarut dihilangkan dahulu Eluen dr kolom dialirkan ke evaporator kemudian ke alat pirolisis dan ke FID Yang dianalisa hanya senyawa target

Interaksi Antara Fase Diam dan Analit (Adsorbsi Isotermik)

a. Tipe konkap, terjadi bila mula-mula linarut tidak kuat interaksinya. tetapi kemudian menjadi lebih kuat sehingga terikat lama pada fase diam. berarti K < 1

b. Tipe normal (linier), ikatan yang terjadi pada setiap saat panggah atau tetap. Sehingga berupa garis lurus dan K = 1. c. Tipe konvek, adsorpsi mula-mula terikat dengan kuat oleh fese diam, tetapi makin lama makin lemah sehingga bentuk kurvanya menjadi konvek atau harga K>1

Contoh Gambar Adsorbsi Isotermik

Gambar:

23

Retensi (Tambat)
Sifat retensi suatu linarut menggambarkan jenis distribusi linarut diantara fase gerak dan fase diam Retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu. Retensi ini dinyatakan sebagai VR (volume tambat) atau tR (waktu tambat)

 Volume fase gerak yang diperlukan untuk membawa linarut dari kolom sampai ke detektor dinamakan volume retensi (VR)

Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor disebut waktu retensi (tR)

Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada: Tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut) Kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran partikel) Komposisi yang tepat dari pelarut Temperatur pada kolom

Tambat Relatif Tambat relatif () merupakan rasio tambat antara dua linarut yang berbeda setelah dielusi Makin besar harga akan makin besar selisih waktu tambat linarut 2 - waktu tambat linarut 1. Berarti kedua puncak linarut tersebut dapat terpisah dengan baik. Keadaan tersebut menggambarkan kemampuan fase membedakan linarut 1 dan linarut 2.

27

Puncak dan Bercak

Campuran sebelum elusi

Keterangan
Puncak pada KCKT p-dihidroksi benzen paling lama tertahan dalam kolom dengan fase diam silika gel. Karena iktannya paling kuat. Bercak pada KLT p-dihidroksi benzin paling pendek migrasinya, karena ikatan dengan fase diam silika paling kuat. Makin dekat gugus hidroksil, ialah meta dihidroksi dan o dihidroksi benzen paling mudah terelusi oleh pelarut karena ikatan adsorbsinya dengan silika makin lemah.
29

KROMATOGRAFI GAS
Adalah teknik untuk memisahkan senyawa atsiri dalam fase gas melalui fase diam

Macam Kromatografi Gas

Kromatografi gas - padat : fase diam adalah butiran-butiran adsorben dan fase gerak adalah gas Kromatografi gas - cair : fase diam adalah cairan yang disalutkan pada permukaan tipis butiran padat dan fase gerak adalah gas

http://www.catatankimia.com

RANGKAIAN DASAR ALAT KROMATOGRAFI GAS

Bagian dasar kromatografi gas : 1. Sistem gas pembawa

2. Sistem pemasukan cuplikan

3. Sistem pemanasan kolom

4. Kolom
5. Sistem deteksi 6. Sistem pengolah data

Syarat Sampel
Harus memiliki keatsirian yang cukup (Volatil) Stabil terhadap panas

Tidak terdekomposisi pada suhu operasional KG (< 450oC)

Syarat Gas Pembawa

1. 2. 3. 4. 5. Lembam Koefisien difusi gas rendah Kemurnian tinggi Mudah didapat dan murah Cocok dengan detektor yang dipakai

Contoh gas pembawa : N2, He, H2, Ar, dll

PRINSIP KERJA KROMATOGRAFI GAS

Injektor merupakan tempat masuknya sampel ke dalam sistem KG Injektor dipanaskan antara 150 ~ 250oC guna menguapkan sampel dan pelarutnya.

Linarut-linarut yang berfase uap ini akan digerakkan ke kolom oleh gas pembawa.
Kolom berada dalam oven yang terkontrol suhunya. Laju migrasi komponen sampel dalam kolom ditentukan oleh : sifat-sifat fisikokimianya, suhu dan komposisi kolom.

 Dalam kolom, komponen sampel mengalir dengan kecepatan yang berbeda-beda.

Komponen yang bergerak tercepat akan keluar dari kolom paling awal dan diikuti dengan sisanya.
Komponen yang terpisah menuju detektor akan menghasilkan sinyal listrik yang besarnya proporsional. Sinyal listrik tersebut akan diperkuat oleh amplifier.

Kromatogram akan dicatat oleh rekorder berupa puncak.

GAS DAN DETEKTOR

Detektor Gas Pembawa
He/Ar/N2/H2

Gas Pembakar
__

Gas Pendukung
_____

1. TCD

2. FID
3. FTD 4. FPD 5. ECD

He/N2
He/N2 He/N2 N2

H2
H2 H2 __

Udara
Udara Udara _____

GAS DAN TEKANAN

Tipe Gas Tekanan Gas yang dibutuhkan

1. Gas Pembawa
2. Gas Pembakar

7 kg/cm2 atau lebih tinggi

2 kg/cm2 atau lebih tinggi

3. Gas Pendukung 2 kg/cm2 atau lebih tinggi

SISTEM DETEKSI ( DETEKTOR)

Detektor Senyawa yang terdeteksi
TCD Semua senyawa kecuali gas pembawa Senyawa organik Senyawa halogen/logam organik Senyawa nitrogen/fosfor organik

Jumlah minimum
10 ppm (10 ng)

FID ECD

0,1 ppm (0,1 ng) 0,1 ppb (0,1 pg)

FTD

1 ppb (1 pg)/ 0,1 ppb (0,1 pg)

THERMAL CONDUCTIVITY DETECTOR (TCD)

Mendeteksi semua senyawa yang memiliki perbedaan konduktivitas dengan gas pembawa.

FLAME IONIZATION DETECTOR (FID)

Sensitif terhadap senyawa-senyawa organik pada umumnya.

ELECTRON CAPTURE DETECTOR (ECD)

Sensitif terhadap senyawa-senyawa halogen dan logam organik.

Biasanya untuk analisis pestisida organoklorin

FLAME THERMIONIC DETECTOR (FTD /NPD)

Sensitif terhadap senyawa fosfor organik dan nitrogen organik. Biasanya untuk analisis pestisida dan produk medikal.

FLAME PHOTOMETRIC DETECTOR (FPD)

Sensitif terhadap senyawa-senyawa fosfor organik, sulfur organik dan timah organik. Biasanya untuk analisis pestisida dan flavour.

SISTEM PENGOLAH DATA

Sinyal yang didapat dari detektor akan direkam dalam bentuk kromatogram dan diolah.

KROMATOGRAM
Kromatogram ideal mempunyai deretan puncak yang rapat namun tidak bertumpukkan.

Ukuran puncak hasil analisis berhubungan banyaknya senyawa dalam cuplikan.

Bila konsentrasi sebuah senyawa bertambah maka ukuran puncakpun membesar.

Contoh Kromatogram

Contoh Kromatogram

TERIMAKASIH