Comparacin de dos procesos cromatogrficos para la purificacin de lactoferrina a partir de suero de queso

Martnez-Garca M. J., Guzmn-Partida, A. M., Vzquez-Moreno, L y Ramos-Clamont M. G*.

Centro de Investigacin en Alimentacin y Desarrollo A.C. Carretera a la Victoria Km 0.6 Hermosillo, Sonora. Coordinacin de Ciencia de los Alimentos. Tel/fax 662 280 00 58. email gramos@ciad.mx

Resumen El suero lcteo subproducto de la elaboracin de queso cuya Demanda Bioqumica de Oxgeno (DBQ) es de 50,000 ppm se descarga contaminado las aguas y suelos mexicanos. La recuperacin de sus nutrientes, entre ellos, las protenas, disminuye la DBQ hasta en un 95%. Las protenas del suero pueden utilizarse en las industrias alimentaria y farmacutica, como la Lactoferrina (Lf), protena con funciones antibacterianas, antioxidantes e inmunomodulatorias. Se compararon dos procesos para la purificacin de Lf, las cromatografas de intercambio inico (IEC) y de afinidad por metales inmovilizados (IMAC). En la IEC se utiliz Sulfopropil-Sefarosa, la adsorcin de protenas se promovi con solucin de fosfatos (PBS), pH 6.7 y la elucin aplicando un gradiente de NaCl (0.1 a 1 M). La matriz acept hasta 800 mg de protena de suero obtenindose 3.29 1.4 mg de Lf. Para IMAC se utiliz Sefarosa-IDA-Cu++, la adsorcin de las protenas se promovi con Tris-Ac. Actico 0.05M, NaCl 0.5M, pH 5 y la elucin con la misma solucin a pH de 4 y 3. La matriz acept hasta 80 mg de protena de suero obtenindose 0.08 mg de Lf contaminada con inmunoglobulinas. En conclusin IEC fue ms efectiva que IMAC para la purificacin de lactoferrina.

Abstract Whey is a byproduct of the cheese making process with a biological oxygen demand (BOD) of 50, 000 ppm. Whey represents an environmental problem for Mexico because is disposed in water and lands. However the nutrient recovery of whey can reduce DOD in 95%. Whey proteins have potential applications in food and clinical industries. One of them, Lactoferrin (Lf) is know to act as antibacterial, antioxidant and immunomodulator factor. A comparison of two chromatography process for lactoferrin purification was done. For LF purification with Ion Exchange Chromatography (AEC) a Sulphopropyl-Sepharose matrix was used. Protein adsorption was promoted with PBS buffer, pH 6.7 while elution

was complete using a NaCl gradient (0.1 a 1 M). Matrix accepted up to 800 mg of whey proteins and eluted 3.29 1.4 mg of Lf. Purification of Lf by Immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) was done using a Sepharose-IDA-Cu++ matrix. Protein adsorption was promoted with 0.05M Tris-Acetic acid, 0.5M NaCl, pH 5 while elution was complete using the same solution at pH of 4 y 3 respectively. Sepharose-IDA-Cu++ matrix accepted up to 80 mg of whey protein and eluted 0.08 mg of lactoferrin and immunoglobulins. In conclusion AEC was more effective for Lf purification than IMAC.

Introduccin La produccin de queso en Mxico es una actividad rentable que aumenta ao con ao. Sin embargo, durante el proceso de elaboracin, se genera una gran cantidad (relacin 9:1 con respecto al queso) de suero lcteo el cual generalmente se elimina como efluente, constituyendo un problema potencial de contaminacin. La Demanda Bioqumica de Oxgeno (DBO) del suero es de 50,000 ppm, un programa de recuperacin de nutrientes del suero podra reducir hasta en un 95% el valor de la DBO de las aguas residuales de la industria lctea. Esto tambin aumentara la rentabilidad de la empresa (CONAMA, 1998). Entre las protenas del suero que pueden recuperarse se encuentra la lactoferrina (Lf). Esta glicoprotena de 80 kDa tiene la capacidad de unir y transportar el hierro a travs de la sangre. Adems, presenta otras funciones como su actividad bactericida, antioxidante e inmunomodulatoria, que pueden aprovecharse tanto en la industria alimentaria como en la farmacutica. Las principales fuentes comerciales de Lf son el suero de queso y la leche descremada, ambas de origen bovino (Tomita et al., 2002). Para el 2003, se estim una produccin mundial de 73 toneladas de Lf; Nueva Zelanda es el principal productor, mientras que Asia y Europa la consumen como suplemento alimenticio o como antimicrobiano en cosmticos y pastas de dietes. Recientemente la FDA aprob el uso de lactoferrina en canales de carne para el control del crecimiento microbiano (Wakabayashi et al., 2006). El aislamiento y purificacin de protenas se basa en estrategias que propiedades exploten

fsicas qumicas y biolgicas de la molcula tales como su carga, su

tamao, su solubilidad, o sus propiedades de unin especfica a otras molculas. En base a lo anterior, las protenas pueden separarse por diversos mtodos entre los que destacan la precipitacin por salado o con solventes y los mtodos cromatogrficos. Estos ltimos presentan la ventaja de ser ms especficos y flexibles en lo que al establecimiento de condiciones se refiere, lo que permite preservar ms fcilmente la estabilidad y la actividad biolgica de la protena purificada (Burnouf, 1995). En este

trabajo se comparan dos tipos de cromatografas IEC e IMAC para la purificacin de lactoferrina a partir de suero de queso.

Materiales y Mtodos Materiales Los ensayos de inmunodeteccin se realizaron con anti-Lf bovina producida en cabra y anti IgG de cabra ligada a peroxidasa producida en conejo de los Laboratorios Bethyl Labs (Montgomery, TX, EUA). La matriz cromatogrfica Sulfopropil-Sefarosa se adquiri en GE Healthcare (Upsala, Suecia). La matriz cromatogrfica Sefarosa-IDA se sintetiz en la Universidad de Arizona segn Porath y Olin (1995). El resto de los reactivos utilizados se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). El suero se obtuvo de la elaboracin de queso fresco por el mtodo tradicional.

Purificacin de lactoferrina La purificacin se llev a cabo en un equipo KTA Purifier (GE Healthcare,

Suecia). Para la IEC se utiliz una matriz de Sulfopropil-Sefarosa empacada en una columna XK16 a un volumen de cama (VC) de 10 mL. La matriz se equilibr con 5 VC de pBS 10 mM, pH 6.7 (Solucin A). El suero (200-1600 mg de protena total), se aplic a la columna y se promovi la adsorcin de sus protenas en presencia de la solucin A, misma que se utiliz como fase mvil y solucin de lavado. Las protenas dbilmente unidas se eliminaron con solucin A con NaCl 0.1 M. La elucin se promovi desarrollando un gradiente de 0.11 M de NaCl. La columna se regener con 5 VC de NaCl 1 M, 2 VC de NaOH 1 M y 10 VC de agua Milli Q. Para la purificacin de Lf por IMAC se utilizaron 10 mL de VC de Sefarosa-IDACu . La matriz se equilibr con 5 VC de Tris-Ac. Actico 0.05M, NaCl 0.5M, pH 5 (Solucin B). Las protenas del suero (20-80 mg) se aplicaron a la columna, se promovi la adsorcin con solucin B y la elucin fue con la misma solucin a distinto pH (4 y 3). La matriz se regener con 5 VC de Guanidina 4M, 5 VC de EDTA 10 mM y 10 VC de agua MilliQ. En ambos casos la protena se estim por el mtodo de Bradford (1970) utilizando una curva estndar de albmina de suero bovino (BSA). La caracterizacin de las fracciones cromatogrficas de IEC e IMAC se realizo por electroforesis SDS-PAGE en geles de poliacrilamida al 10% tiendo con plata (Laemmli, 1970) y por inmunodeteccin con anti-lactoferrina bovina con Western Blot con el sistema avidina-peroxidasa (Towbin et al., 1979).
++

Resultados y Discusin En la figura 1 se muestra el cromatograma tpico de la purificacin de lactoferrina por cromatografa de intercambio inico. El pico 1 muestra la fraccin de lavado obtenida con 16 VC, los picos restantes son las eluciones de las protenas adsorbidas. Las protenas que no se adsorbieron especficamente (pico 2), fueron retiradas de la matriz con 7 VC de la solucin A conteniendo NaCl 0.1 M. Posteriormente se realiz un gradiente de NaCl de 0.1-1 M en solucin A y se obtuvieron otros dos picos de elucin (picos 3 y 4). El pico 3 eluy con 12 VC a una concentracin entre 0.1-0-5 M de NaCl a mientras que el pico cuatro se obtuvo entre 0.5-1.0 M de NaCl con 12 VC. Las alturas mximas de los picos 3 y 4 se obtuvieron a 0.24 M y 0.75 M de NaCl, respectivamente. Se cargaron desde 200 hasta 1600 mg de protenas de suero a la matriz cromatogrfica, pudindose trabajar a un flujo de fase mvil de 5 mL/min. Los balances de materia mostraron que la columna se satura al aplicar 800 mg de protenas de suero y que la capacidad de la matriz es de 0.33 mg de lactoferrina /mL de matriz cromatogrfica. Sin embargo, la lactoferrina ms pura (1.60 0.12 mg) se obtiene aplicando 400 mg de protena a la matriz. La cantidad obtenida corresponde al contenido reportado en la literatura. La duracin del proceso fue de 4 h.

4,5

- 1.0 - 0.9 - 0.8

3,5

kDa 197 126 66

- 0.7 - 0.6

absorbancia (280 nm )

NaCl (M)

2,5

45
2

- 0.5 - 0.4 - 0.3

31
1,5

21
1

14
1
0,5

- 0.2

36
- 0.1

0 0 - 0,5

1
20 40

2
60 80

3
100 120

4
140 160 180

-0
200

fracciones

Figura 1. Cromatograma tpico de la purificacin de lactoferrina por intercambio inico. La adsorcin de protenas se promovi en presencia de PBS pH 6.7 (pico 1). Las protenas que no se unieron de manera especfica fueron desprendidas con NaCl 0.1 M (pico 2). Posteriormente se eluy con un gradiente de 0.1-1 M de NaCl (picos 3 y 4). En el extremo izquierdo se muestra la electroforesis del pico 4 en el que se obtuvo la Lf (carril 2) y la

confirmacin por inmunodeteccin con anti-lactoferrina (carril 3). En el extremo derecho de la figura 1 se muestra la migracin electrofortica del pico 4 (carril 2) al aplicar 400 mg de protena de suero de queso. Se observa una banda de 80 kDa correspondiente a la masa molecular de la Lf bovina (Levay y Viljoen, 1995). No se observa contaminacin con alguna otra protena. La inmunodeteccin con antilactoferrina bovina (carril 3), confirmo la presencia de la protena.

La figura 2 presenta el cromatograma tpico y la electroforesis de las fracciones obtenidas por IMAC para la purificacin de Lf. En el cromatograma se observan 3 picos correspondientes al lavado (Solucin B, pH 5) y a las eluciones con solucin B a pH 4 y 3, respectivamente. La matriz acept desde 20 a 50 mg de protenas de suero saturndose con 40mg. La velocidad mxima de la fase mvil fue de 1 mL/min. La capacidad de la matriz fue de 0.1 mg de protena /mL de matriz, obtenindose un mximo de 0.08 mg de protena en un proceso de 4 h. Sin embargo, la Lf no pudo obtenerse pura en este tipo de cromatografa como indica el carril 4 de la figura 2B en el que se observa una banda de 80 kDa correspondiente a la Lf y otras bandas de 66, 55 y 25 kDa correspondientes a la albmina srica y a las cadenas pesadas y ligeras de las inmunoglobulinas, respectivamente. Debido a esta contaminacin, fue necesario acoplar una columna de Sefarosa-Heparina a IMAC, con el fin de aplicarle la elucin a pH 4 y obtener la Lf pura aadiendo 4 h ms al proceso (Datos no mostrados).

En el Cuadro 1 se resumen los aspectos ms relevantes de la comparacin de ambos procesos cromatogrficos. Como puede observarse la cromatografa de intercambio inico requiere de la mitad del tiempo de proceso (4 h) para obtener de 18 a 20 veces ms lactoferrina que la cromatografa de afinidad por metales inmovilizados. En este ltimo proceso debe adems, acoplarse una cromatografa de afinidad por heparina para obtener la lactoferrina pura, ya que, como se observ en los patrones electroforticos de la figura 2, la Lactoferrina obtenida por IMAC se encuentra contaminada con albmina e inmunoglobulinas. Otro aspecto importante es que, debido a que la matriz de intercambio inico acepta mayores flujos de la fase mvil sin comprimirse (5 mL/min) y acepta una mayor cantidad de protenas sin saturarse, tiene capacidad de escalamiento del proceso

Figura 2. Purificacin de lactoferrina de suero de queso por IMAC. A) Cromatograma tpico. La adsorcin se promovi en presencia de solucin Tris Ac. Actico, pH 5 (pico 1. La elucin de las protenas adsorbidas se realiz con la misma solucin pero a pH 4 y 3 (picos 2 y 3), respectivamente. B SDS-PAGE al 10% de las fracciones cromatogrficas. Carril 1 estndares de masa molecular, carril 2 suero de queso, carril 3 fraccin de lavado (pico1), carril 4 fraccin de elucin a pH 4 (pico 2), carril 5 fraccin de elucin a pH 3. La tabla 1 resume los aspectos ms relevantes en la comparacin de los dos procesos de purificacin.

Cuadro 1. Comparacin de los dos procesos cromatogrficos para purificacin de lactoferrina de suero de queso
Tipo de cromatografa Matriz cromatogrfica Cantidad de protena que acepta la matriz Velocidad de flujo Capacidad de la matriz Lactoferrina obtenida Intercambio Inico Afinidad por Metales Inmovilizados Sefarosa-IDA-Cu++ 35-40 mg 0.5-1 mL/min 0.1 mg protena/mL de matriz Contaminada, se requiere acoplamiento con cromatografa en Sefarosa-Heparina 0.08 a 0.14 mg

Sulfopropil-Sefarosa 400-800 mg 5-10 mL/min 0.33 mg de Lf/ml de matriz Pura

Lactoferrina/corrida

1.60 a 3.29 mg

Referencias Bibliogrficas Bradford, M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye-binding. Anal. Biochem. 72:248-254. Burnouf, T. 1995. Chromatography in plasma fraction: benefits and future trends. J. Chromatogr. B. 664:3-15. CONAMA. 1992. Gua para el control y la prevencin de la contaminacin industrial. Productos Lcteos. Comisin Nacional del Medio Ambiente. Chile Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head bacteriophage T4. Nature. 227:680-685. Levay, P.F., and Viljoen, M. 1995. Lactoferrin: a general review. Acta Haematol. 80:252-267 Towbin, H., Staehelin, T., and Gordon, J. 1979. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. 76:4350-4354. Tomita, M., Wakabayashi, H., Yamauchi, K., Teraguchi, S., and Hayasawa, H. 2002. Bovine lactoferrin and lactoferricin derived from milk: production and applications. Biochem. Cell Biol. 80:109-112.