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3.- OBTENCION DE EMULSINA

3.- OBTENCION DE EMULSINA

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Obtención de la enzima emulsina a partir de almendras dulces por medio de una extracción.
Obtención de la enzima emulsina a partir de almendras dulces por medio de una extracción.

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Categories:Types, Research, Science
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PRÁCTICA # 3
“ 
OBTENCIÓN DE EMULSINA
” 
OBJETIVOS
Obtener una enzima, la emulsina, a partir de almendras dulces.INTRODUCCIÓNEl nombre proteína proviene de la palabra griega
 proteios
, que significa lo primero. Las proteínas constituyen gran partedel cuerpo animal: lo mantienen como unidad y lo hacen funcionar. Se las encuentra en toda la célula viva. Son elmaterial principal de la piel, los músculos, tendones, nervios y la sangre, enzimas, anticuerpos y muchas hormonas.(Sólo los ácidos nucleicos que controlan la herencia pueden desafiar la posición de las proteínas, además aquellosdesafían la síntesis de estas.)Desde un punto de vista químico las proteínas son polímeros grandes. Son poliamidas, y los monómeros de los cuálesse derivan los ácidos
α
-aminocarboxílicos. Una sola molécula proteínica contiene cientos, e incluso miles de unidadesde aminoácidos, que pueden ser de unos 20 tipos diferentes. El número de moléculas proteínicas diferentes que puedenexistir es casi infinito.Las proteínas son compuestos a base de carbono, hidrógeno, oxígeno, nitrógeno y generalmente azufre y fósforo. Elelemento característico es el nitrógeno. Todas las enzimas, algunas hormonas y muchos componentes estructuralesimportantes de la célula son proteínas.Las moléculas de proteína son muy grandes y contienen miles de átomos; su estructura es extremadamente compleja.Gran parte de las proteínas intracelulares son enzimas, sustancias que regulan la rapidez con que se han de tener numerosas reacciones celulares.Las moléculas de proteína están formadas por componentes más simples llamados aminoácidos. Puesto que cadaproteína puede tener cientos de aminoácidos combinados en ciertas proporciones y orden es posible una variedadprácticamente infinita de moléculas de proteína. Se han ideado métodos de análisis para reconocer la disposición exactade aminoácidos en una molécula proteínica.ESTRUCTURAS DE LAS PROTEÍNAS:Pueden distinguirse varios niveles de organización en la molécula de proteína. El primer nivel es la llamada estructuraprimaria, que depende de la serie de aminoácidos en la cadena de polipéptidos. Esta serie, está determinada a su vez,por la serie de nucleótidos de RNA y DNA del núcleo de la célula. Un segundo nivel de organización de las moléculasproteínicas supone la adopción de la forma de hélice u otra configuración regular por la cadena de polipéptidos. Estascadenas ordinariamente no se encuentran planas en una molécula de proteína, sino que adoptan formas espiralazaspara dar una estructura tridimensional. Una de las estructuras secundarias comunes de las moléculas proteínicas es elhélice en
α
, que se supone una formación espiralaza de la cadena de polipéptidos básica. La hélice en
α
es unaestructura geométrica muy uniforme con 3.6 aminoácidos que ocupan cada vuelta de la hélice. La estructura helicoidales determinada y mantenida por la formación de enlaces de hidrógeno entre residuos de aminoácidos en vueltassucesivas de espiral.Un tercer nivel de estructura de moléculas proteínicas es el desdoblamiento de la cadena de péptidos sobre sí mismapara formar proteínas globulares. De nuevo enlaces débiles como enlaces de hidrógeno, iónicos e hidrofóbicos seforman entre una parte de la cadena de péptidos y la otra parte, de modo que la cadena se desdobla de una maneraespecífica para dar una estructura general específica de la molécula proteínica. Enlaces covalentes como los dedisulfuro (-S-S-) son importantes en la estructura terciaria de muchas proteínas. La actividad biológica de una proteínadepende en gran parte de la estructura primaria específica que es mantenida junta por esos enlaces.Cuando una proteína se calienta o trata con cualquiera de una variedad de productos químicos, se pierde la estructuraterciaria. Las cadenas de péptidos espiralazas se desdoblan para dar una configuración aleatoria acompañada por unapérdida de la actividad biológica de la proteína. Este cambio se llama
“desnaturalización
”.Los 20 aminoácidos aminados que suelen encontrarse en las proteínas poseen todos un grupo amino (-NH
2
) y un grupocarboxílico (-COOH), pero sus cadenas laterales son distintas. El mas simple de todos, la glicina, tiene como cadenalateral un H; la alanita, un grupo –CH
3
. El grupo amino permite al aminoácido aminado actuar como base y combinarsecon ácidos; el grupo ácido, le permite combinarse con las bases.
 
Los aminoácidos y las proteínas sirven de
amortiguadores
y pueden resistir a cambios de acidez y alcalinidad. Losaminoácidos se unen entre sí para formar proteínas mediante un
enlace peptídico
entre el grupo amino de una moléculay el grupo carboxilo de la otra.Los aminoácidos puros obtenidos de las proteínas tienen sabor dulce. Cuando se ingieren proteínas son hidrolizadas aaminoácidos antes de ser absorbidas a la corriente sanguínea. Los aminoácidos son llevados a todas las regiones delorganismo, donde sirven para la elaboración de nuevas proteínas, o son metabolizados para liberar energía. Lasproteínas tienen importancia primordial como componentes estructurales de las células y como constituyentesfuncionales de enzimas y algunas hormonas, pero pueden servir también como combustible para producción de energía.Los aminoácidos pierden primero su grupo amino por una reacción enzimática llamada
desaminación.
El grupo aminoreacciona con otras sustancias para formar urea, que se excreta. El resto de la molécula puede transformarse por unaserie de fases intermedias en glucosa, que se utiliza pronto como combustible, o almacenarse como glucógeno.Las plantas pueden sintetizar todos los aminoácidos a partir de sustancias simples. Los aminoácidos que los animalesno pueden sintetizar y que deben obtener en su alimentación se llaman
aminoácidos esenciales.
Debe comprenderseque estos aminoácidos no son más esenciales que otros; sólo lo son respecto a la alimentación, pues no es posiblesintetizarlos.
PEPTIDOS
Los péptidos son un tipo demoléculasformadas por la unión de variosaminoácidosmedianteenlaces peptídicos. Los péptidos, al igual que lasproteínas, están presentes en la naturaleza y son responsables de un gran número defunciones, muchas de las cuales todavía no se conocen.La unión de un bajo número de aminoácidos da lugar a un péptido:Oligopéptido: Número de aminoácidos < 10.Polipéptido: Número de aminoácidos > 10.Proteína: número de aminoácidos > 100.Los péptidos se diferencian de lasproteínasen que son más pequeños (tienen menos de diez mil o doce mil Daltons)y que las proteínas pueden estár formadas por la únión de varios polipéptidos y a vecesgrupos prostéticos. Unejemplo de polipéptido es la insulina la cual se compone de 55 aminoácidos y se conoce como una hormona´deacuerdo a la función que tiene en el organismo de los seres humanos.En cuanto a las reacciones del grupo amino, es muy interesante la reacción con el reactivo de Sanger parasecuenciar, ya que si tenemos el 2,4-dinitrofenil-péptido y lo hidrolizamos por hidrólisis ácida, se hidrolizarán todoslos enlaces peptídicos y obtendremos el dinitrofenil del primer aminoácido de la secuencia, el
NH 
2
terminal, más elresto de los aminoácidos disgregados en el medio.Con esta reacción Sanger consiguió secuenciar la insulina.En esta reacción, el núcleo coloreado de dinitrobenceno se une al átomo de nitrógeno del aminoácido para producir un derivado amarillo, el derivado 2,4-dinitrofenil o DNP-aminoácido. El compuesto DNFB reaccionara con el grupoamino libre del extremo amino de un polipéptido, así como también con los grupos amino de los aminoácidos libres.El enlace C – N que se forma es por lo general mucho más estable que un enlace peptídico. De esta forma, haciendoreaccionar una proteína nativa o un polipéptido intacto con el DNFB, hidrolizando la proteína en acido y aislando losDNP-aminoácidos coloreados, puede identificarse el grupo amino terminal del aminoácido en una cadenapolipeptídica. El grupo amino-terminal de la lisina y algunos otros grupos funcionales de las cadenas lateralestambién reaccionaran con el DNFB.Sin embargo, después de la hidrólisis, solo el derivado del grupo amino terminal del aminoácido original tendrá sugrupo α-amino bloqueado; asimismo, tales DNP-α-aminoácidos pueden separarse de otros derivados DNP medianteprocedimientos de extracción simples. Con cualquiera de los variados métodos cromatograficos se podrá identificar alos DNP-α-aminoácidosPero este proceso consume mucha energía, ya que, teniendo el primer aminoácido hay que obtener los demásrompiendo por otras zonas. Esto se evita con el procedimiento de Edman (también es una reacción de aminoácidos):Como la ciclación se da en condiciones ácidas suaves, no se rompen los enlaces, y se da la feniltiohidantoína delaminoácido
NH 
2
-terminal + el resto del péptido intacto.
2
 
Se separan ambos compuestos y por cromatografía se detecta. Con el resto del péptido se sigue con el mismoprocedimiento hasta tener la secuencia completa. Éste método se conoce como Degradación de Edman, y es lareacción que usan los secuenciadores automáticos de proteínas. Pero estos secuenciadores sólo pueden secuenciar los 20-30 primeros aminoácidos, por lo que tendremos que hidrolizar y seguír después. Esto es porque el rendimientono es del 100% y perdemos péptido poco a poco, y al final no nos queda. Sólo las enzimas consiguen un rendimientoal 100%.Reacciones del grupo carboxiloTambién podemos secuenciar empezando por el extremo carboxilo-terminal, para lo que se usan enzimas como lacarboxipeptidasa. Es una proteasa que hidroliza los enlaces peptídicos. Ésta en concreto es una exoproteasa (atacaa la proteína por un extremo) que ataca al extremo carboxilo-terminal. Se emplean 2 tipos, la carboxipeptidasa A y B.Catalizan la misma reacción, pero tienen especificidad distinta. La A sólo rompe el enlace peptídico si el aminoácidocarboxilo-terminal es hidrofóbico. La B lo rompe si es básico. Hay que controlar muy bien el tiempo de reacción, yaque cuando se libera un carboxilo-terminal el siguiente aminoácido se convierte en el carboxilo-terminal.Reacciones de los grupos RRespecto a las reacciones de los grupos R, existen muchos reactivos que reaccionan de forma específica condeterminados grupos R (OH de la serina, tiol de la cisteína...). Esto se usa para ver qué aminoácido es esencial parael funcionamiento de la proteína. Dentro de las reacciones de ls grupos R, una interesante desde el punto de vista deaislamiento y purificaciñon de proteínas es la del grupo tiólico (SH) de la cisteína, que es fuertemente reductor. Enpresencia de O2 tiene mucha tendencia a oxidarse. Si hay dos moléculas de cisteína; en presencia de oxígeno, seoxidan para originar una molécula de cistina:Esto ocurre frecuentemente en una proteína, cuando se pliega y dos moléculas de cisteína quedan próximas en elespacio, generando un puente disulfuro. El puente disulfuro ocurre de forma natura, y debe formarse para estabilizar la estructura tridimensional de la proteína. Sin embargo, puede que no deba ocurrir de forma natural, por ejemplo, sihay cisteínas esenciales expuestas (necesarias para la funcionalidad). Cuando aislamos una proteína de su entornonatural, ponemos a la proteína en presencia de oxígeno, con lo que esos grupos tiólicos se pueden oxidar, y laproteína perder su funcionalidad. Para evitar esto, en los medios de aislamiento y purificación de proteínas añadimosβ-mercapto-etanol, cuyo grupo tiólico es más reductor que el de la propia cisteína; tiene más tendencia a oxidarse.De modo que al añadir β-mercapto-etanol, éste se oxida y protege así los grupos tiólicos de la cisteína.Cuando queremos estudiar la composición de aminoácidos de una proteína tenemos que hidrolizarla completamente,con lo que tenemos una mezcla de todo el conjunto de aminoácidos libres que consituyen dicha proteína. Para evitar,en toda esta manipulación, que las Cys que tengamos en el medio se oxiden, tenemos que proteger su grupo tiólicoañadiendo como reactivo
iodoacetato
:Así transformamos la cisteína en carboximetilcisteína.
3

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