GUIA DE VALIDACIN DE METODOS ANALITICOS

Definiciones: ESPECIFICIDAD: Habilidad de evaluar inequvocamente el analito en presencia de componentes que se puede esperar que estn presentes. Tpicamente stos pueden incluir impurezas, productos de degradacin, la matriz, etc. EXACTITUD: (VERACIDAD): Expresa la cercana entre el valor que es aceptado, sea como un valor convencional verdadero (material de referencia interno de la firma), sea como un valor de referencia aceptado (material de referencia certificado o estndar de una farmacopea) y el valor encontrado (valor promedio) obtenido al aplicar el procedimiento de anlisis un cierto nmero de veces. INTERVALO DE LINEALIDAD: mbito entre la menor y la mayor concentracin de analito en la muestra (incluyendo stas concentraciones) para las cuales se ha demostrado que el procedimiento analtico tiene el nivel adecuado de precisin, exactitud y linealidad. LIMITE DE CUANTIFICACION: Cantidad ms pequea del analito en una muestra que puede ser cuantitativamente determinada con exactitud aceptable. Es un parmetro del anlisis cuantitativo para niveles bajos de compuestos en matrices de muestra y se usa particularmente para impurezas y productos de degradacin. Se expresa como concentracin del analito. LIMITE DE DETECCION: Cantidad ms pequea de analito en una muestra que puede ser detectada por una nica medicin, con un nivel de confianza determinado, pero no necesariamente cuantificada con un valor exacto. Es comnmente expresado como concentracin del analito. LINEALIDAD: Habilidad (dentro de un mbito dado) del procedimiento analtico de obtener resultados de prueba que sean directamente proporcionales a la concentracin de analito en la muestra. MATERIAL DE REFERENCIA (PATRN TERCIARIO): Material o sustancia, en el cual una o ms de sus propiedades estn suficientemente bien establecidas para que sea usado en la calibracin de un aparato, la estimacin de un mtodo de medicin o para asignar valores a los materiales. MATERIAL DE REFERENCIA CERTIFICADO (PATRN SECUNDARIO): Material en el que los valores de una o ms de sus propiedades estn certificados por un procedimiento tcnicamente validado, bien sea que este acompaado de, o pueda obtenerse, un certificado u otra documentacin emitida por un ente certificador. MATERIAL ESTANDAR DE REFERENCIA (PATRN PRIMARIO): Material emitido por la Oficina Nacional de Normas de Estados Unidos (U.S National Bureau of Standars) cuyo nombre fue cambiado recientemente a Instituto Nacional para Normas y Tecnologa (National Institute for Standards and Technology, NIST.)

METODO ANALITICO: Adaptacin especfica de una tcnica analtica para un propsito de medicin seleccionado. PARAMETROS DE DESEMPEO ANALITICO: Caractersticas de validacin que necesitan ser evaluadas y que tpicamente corresponden a la siguiente lista: exactitud, precisin, especificidad, lmite de deteccin, lmite de Cuantificacin, linealidad, intervalo de linealidad y robustez. LIBROS OFIACIALES: Los aprobados mediante el decreto 28466-S y sus modificaciones. PRECISION: expresa la cercana de coincidencia (grado de dispersin) entre una serie de mediciones obtenidas de mltiples muestreos de una misma muestra homognea bajo condiciones establecidas. Puede considerarse a tres niveles: repetibilidad, precisin intermedia y reproducibilidad. Debe determinarse utilizando muestras originales y homogneas. Sin embargo, si no es posible obtener una muestra homognea puede ser determinada usando muestras preparadas o una disolucin de la muestra. PRECISION INTERMEDIA: Precisin obtenida dentro del laboratorio por diferentes analistas, diferentes equipos, das distintos con la misma muestra homognea. PROCEDIMIENTO ANALITICO: Forma en que se realiza el anlisis. Debe describir en detalle los pasos necesarios para realizar cada prueba analtica. Puede incluir, pero no necesariamente los siguientes conocimientos: caractersticas de la muestra, preparacin de los estndares de referencia y reactivos, uso de los aparatos o instrumentos, generacin de la curva de calibracin, uso de frmulas para los clculos. PROCEDIMIENTO ANALITICO OFICIAL: Procedimiento analtico estandarizado contenido en una farmacopea oficial o libros oficiales. Se les supone validados y los laboratorios que los utilizan no estn obligados a validar la exactitud de los mismos, solamente demostrar su aptitud para aplicarlos, validando la linealidad y precisin del sistema. REPETIBILIDAD (REPETITIVIDAD): Precisin obtenida bajo las mismas condiciones de operacin en un intervalo corto de tiempo (mismo da), por un mismo analista, en la misma muestra homognea y en el mismo equipo. REPRODUCIBILIDAD: Expresa la precisin entre laboratorios como resultado de estudios interlaboratoriales diseados para estandarizar la metodologa. ROBUSTEZ: Medida de la capacidad de un procedimiento analtico de permanecer inafectado por pequeas pero deliberadas variaciones en los parmetros del mtodo y provee una indicacin de su fiabilidad en condiciones de uso normales. SELECTIVIDAD: Describe la habilidad de un procedimiento analtico para diferenciar entre varias sustancias en la muestra y es aplicable a mtodos en los que dos o ms componentes son separados y cuantificados en una matriz compleja.

SESGO: Se usa en el sentido de exactitud de un promedio a largo plazo (valor esperado) de una serie de promedios. Es la diferencia en el valor esperado (tericamente igual al promedio de un nmero infinito de valores individuales independientes) del valor verdadero, correcto o asumido. SISTEMA ANALITICO: Est compuesto por: equipos, reactivos, materiales, documentos, patrones, materiales de referencia, analistas y variables operativas, que se utilizan en un mtodo de anlisis. TECNICA ANALITICA: Principio cientfico que se ha encontrado til para proveer informacin sobre la composicin de un determinado producto o material VALIDACIN: Confirmacin que se da por la recopilacin y anlisis de la evidencia objetiva de que se cumplen los requisitos particulares para el uso especfico propuesto. VALIDACIN DE UN PROCEDIMIENTO ANALITICO: Procedimiento para establecer por medio de estudios laboratoriales una base de datos que demuestren cientficamente que un mtodo analtico tiene las caractersticas de desempeo que son adecuadas para cumplir los requerimientos de las aplicaciones analticas pretendidas. Implica la demostracin de la determinacin de las fuentes de variabilidad y del error sistemtico y al azar de un procedimiento, no solo dentro de la calibracin sino en el anlisis de muestras reales. 1 Exactitud:

Existen diferentes maneras de determinar la exactitud, los siguientes son los ms frecuentes en la literatura, y pueden ser utilizados en todos los tipos de anlisis. 1.1 Comparacin con un mtodo oficial, validado o estandarizado:

Verificacin La muestra debe ser analizada, utilizando el mtodo a validar y un segundo mtodo bien caracterizado, el cual debe tener una exactitud bien definida y establecida. Se analizan 6 muestras por replicado a la concentracin normal de trabajo por ambos mtodos. Criterio de aceptacin: Se lleva a cabo un anlisis de varianza (ANOVA), del porcentaje de recuperacin o del error relativo en porcentaje, para determinar si hay o no diferencia significativa entre la exactitud de los mtodos comparados. 1.2 Verificacin Se puede llevar a cabo de dos maneras diferentes: 3 Adicin estndar:

1.2.1 Con placebo: Se utiliza una mezcla preparada en el laboratorio de todos los componentes de la matriz de la muestra sin el principio activo a determinar, luego el placebo se enriquece con estndar. 1.2.2 Con muestra: Cuando no es posible contar con un placebo, se determina por replicado el contenido promedio del analito en la muestra con el mtodo a validar; una vez conocido el contenido promedio se procede a enriquecer las muestras con estndar. Para preparar las soluciones, en este caso se mantiene constante la cantidad de muestra tomada y se agregan cantidades variables del estndar. En ambos casos se preparan soluciones de placebo o de muestras enriquecidas a tres niveles de concentracin diferentes, valores sugeridos en la literatura son 80, 100 y 120 % de la concentracin normal de trabajo del mtodo. ICH (International Conference Harmonization), recomienda preparar muestras independientes por triplicado a cada nivel de concentracin. En el caso en que se trabaje con muestra enriquecida, para llevar a cabo el clculo del porcentaje de recuperacin, se requiere contar con los datos de contenido del principio activo en la muestra antes de la adicin estndar. Criterios de aceptacin Tabla 1 Concentracin del analito Ensayo Criterio de aceptacin

1. Placebo enriquecido Porcentaje de recuperacin esperado debe encontrarse entre el 98%-102%. Lo cual es equivalente a 2 % de error relativo. Al graficar la cantidad recuperada contra la cantidad adicionada, debe obtenerse un coeficiente de correlacin de 1.00, una pendiente de 1.00 y el intercepto debe ser 0.00. Lo cual puede ser corroborado estadsticamente. 2. Muestra enriquecida

Los porcentajes de recuperacin obtenidos, deben encontrarse dentro del 100% 4S, donde S es la mayor desviacin estndar obtenida en la determinacin de la precisin del mtodo o del 4

sistema Al graficar la respuesta del ensayo (cantidad total encontrada), contra la cantidad de analito adicionada, la pendiente debe ser mayor o igual a 0.95 y el intercepto debe ser igual a la concentracin inicial.

Trazas Sobre 100 ppb (ng/ L) Menos de 100 ppb (ng/ L ) Menos 1 ppb 80%-100% de recuperacin 60%-110 % de recuperacin 70%-120% de recuperacin

1.3

Comparacin de las curvas de regresin lineal de estndares con curvas de regresin lineal de placebos enriquecidos (mtodos de curvas de respuesta relativa):

Verificacin Este mtodo es una modificacin del mtodo de adicin estndar a placebo. Se preparan soluciones a diferentes niveles de concentracin de placebo enriquecido ( 80, 100, 120%) y soluciones de estndares a los mismos niveles de concentracin. Separadamente se evala la regresin lineal de ambos grupos y se lleva a cabo la comparacin de las pendientes y los interceptos. Criterio de aceptacin: Los efectos de la interaccin entre la matriz y el analito, se encuentran ausentes si los interceptos del placebo enriquecido y los estndares son estadsticamente iguales a cero, (informacin que a la vez permite establecer la especificidad del mtodo respecto a la matriz). El error sistemtico proporcional se encuentra ausente si la razn de las pendientes de las curvas de respuesta para el placebo y los estndares es estadsticamente equivalente a 1. 1.4 Comparacin de los resultados obtenidos de un estndar o material de referencia certificado:

Verificacin El material de referencia puede ser obtenido en el mercado por algn suplidor o puede ser preparado internamente en el laboratorio. Se analiza por replicado el material, por el mtodo a validar y se compara el resultado obtenido con el valor verdadero declarado, este mtodo se encuentra limitado por la disponibilidad y la 5

estabilidad del material de referencia, as como por el grado de certidumbre que se tenga del valor verdadero de la concentracin del material de referencia.

Criterio de aceptacin 98%-102% de recuperacin o 2% de error relativo 2 Precisin

Verificacin Existen diferentes formas de evaluar la precisin: repetibilidad, precisin intermedia, reproducibilidad En trminos generales la precisin, debe determinarse, analizando un nmero suficiente de alcuotas, que permitan calcular estadsticamente la desviacin estndar y la desviacin estndar relativa. La ICH, recomienda llevar a cabo un total de nueve determinaciones, que cubran el intervalo especificado en el procedimiento. Para ello se pueden trabajar tres niveles diferentes de concentracin ( 80, 100, 120 %), con tres muestras independientes de cada nivel. Datos con los que se cuenta si al evaluar la exactitud, se llev a cabo por el mtodo de Adicin estndar. Otra forma de evaluarlo es, analizando por lo menos seis muestras independientes a la concentracin normal de trabajo. Criterios de aceptacin: Existen diferentes criterios de aceptacin, sin embargo se puede generalizar que en el caso de la repetibilidad y la precisin intermedia la desviacin estndar relativa, para evaluar la precisin del sistema o del mtodo debe ser menor o igual al 2 %, y en algunos casos puede ser igual o menor del 3%, la reproducibilidad, puede ser 2 o 3 veces la repetibilidad. 3 Linealidad e intervalo

Verificacin El comportamiento lineal de un mtodo, debe ser demostrado dentro del intervalo en el cual es probable que se trabaje. Este intervalo vara dependiendo del tipo de determinacin a realizar. Por esta razn se establece los intervalos dentro de los cuales deben llevarse a cabo las pruebas para cada anlisis: Tabla 2 Anlisis Intervalo de trabajo Ensayo del principio activo 80-120 % de la concentracin de trabajo Determinacin de impurezas 50-120% de la especificacin Ensayo de Uniformidad de contenido 70-130% de la concentracin de trabajo, o alguna modificacin del mismo, dependiendo de la naturaleza de la forma dosificada 6

Prueba de disolucin

20 % sobre la especificacin, en el caso de la liberacin controlada, en que existe una especificacin mnima al inicio de la prueba y una mxima al finalizar, el intervalo debe ser menos un 20% de la especificacin mnima y ms 20% de la especificacin mxima.

Para llevar a cabo la determinacin de la linealidad y el intervalo, se deben seguir los siguientes pasos: 3.1 Verificacin 1. Preparar en forma independiente soluciones de estndar al menos 5 niveles de concentracin, las cuales deben encontrarse dentro de los intervalos establecidos para cada tipo de anlisis. 2. Este procedimiento debe repetirse en forma independiente por lo menos 3 veces, para evaluar estadsticamente la regresin lineal del sistema. 3. Con estos datos se grafica la respuesta de la medicin, contra la concentracin del analito. Se verifican datos con comportamiento atpico mediante mediciones adicionales. 4. Realizar un anlisis de varianza de la regresin lineal 5. Calcular el coeficiente de regresin (calcular por lo menos tres curvas independientes) 6. Calcular y graficar los residuos (valor real de la concentracin el calculo por la ecuacin de regresin para cada valor de X) 3.2 Verificacin 1. Preparar soluciones de muestra o placebo enriquecidos a cinco niveles de concentracin, los cuales deben encontrarse dentro de los intervalos establecidos por la USP para cada tipo de anlisis, y que fueron verificados previamente al llevar a cabo la determinacin de la linealidad del sistema. 2. Este procedimiento debe repetirse en forma independiente por lo menos 3 veces, para evaluar estadsticamente la regresin lineal del mtodo 3. Con estos datos se grafica la respuesta de la medicin, contra la concentracin del analito. Se verifican datos con comportamiento atpico mediante mediciones adicionales. 4. Realizar un anlisis de varianza de la regresin lineal 5. Calcular el coeficiente de regresin con la totalidad de los datos (por los menos tres curvas independientes) 6. Calcular y graficar los residuos (valor real de la concentracin el calculado por la ecuacin de regresin para cada valor de X) Linealidad e intervalo del mtodo Linealidad e intervalo del sistema:

Criterios de aceptacin Se confirma linealidad si se cumplen los siguientes criterios: 1. Homocedasticidad (la varianza es constante para todas las concentraciones) 2. El Anlisis de varianza de la regresin lineal debe demostrar: a- paso del intercepto por cero, mediante un test de t o mediante el intervalo de confianza con un de 0.05. b- desviacin no significativa con respecto a la regresin 3. Distribucin aleatoria de los residuos (Tendencias sistemticas son indicativas de no linealidad 4. El coeficiente de correlacin de la regresin lineal debe encontrarse entre 0.98 y 1.00, el coeficiente de correlacin al cuadrado debe ser mayor de 0.995 4 Lmite de deteccin

El lmite de deteccin puede ser establecido de diferentes maneras dependiendo del tipo de mtodo: 4.1 Mtodos no instrumentales

4.1.1 Por comparacin de blanco y blanco enriquecido a una sola concentracin. Verificacin El lmite de deteccin se determina por medio del anlisis comparativo de un blanco y de muestras independientes de blanco enriquecido con diferentes niveles de concentraciones conocidas del analito. Se compara el comportamiento de las muestras con el blanco y se establece el nivel mnimo al cual el analito puede ser realmente detectado. En el caso del lmite de deteccin del sistema, el blanco est constituido por los solventes utilizados en el anlisis. En el caso del mtodo, el blanco est constituido por los solventes y por la matriz de la muestra. 4.2 Mtodos instrumentales

En el caso de mtodos establecidos como oficiales casi nunca es necesario determinar el lmite actual de deteccin. Preferiblemente el lmite de deteccin de trabajo debe ser ms bajo del nivel de deteccin requerido por la especificacin. Por ejemplo, si se requiere detectar una impureza al nivel del 0.1%, se debe demostrar que el procedimiento realmente detecta la impureza a este nivel. Existen diferentes formas de determinar el lmite de deteccin, cualquiera que sea el mtodo utilizado, se requiere del anlisis de un nmero adecuado de muestras conocidas que deben estar cercanas o preparadas a la concentracin del lmite de deteccin requerido para el tipo de ensayo a realizar.

4.2.1 Por comparacin de blanco y blanco enriquecido a una sola concentracin.

Determinacin Se utiliza cuando la desviacin estndar del blanco es diferente de 0. Se preparan no menos de 10 blancos independientes y 10 blancos enriquecidos a la concentracin ms baja aceptada. Una vez preparadas las soluciones, se llevan a cabo las mediciones de cada una y posteriormente se calcula la desviacin estndar de cada grupo de datos. Con estos datos se puede calcular el lmite de deteccin LD= Valor promedio del blanco + 3S Donde S es la desviacin estndar de la muestra enriquecida 4.2.2 Blanco enriquecido a una sola concentracin Determinacin En este caso se analizan y cuantifican no menos de 10 soluciones de blanco enriquecidas o muestras enriquecidas preparadas a la concentracin menor para la que se puede obtener un grado aceptable de incertidumbre. Se lleva a cabo la cuantificacin para cada una de las soluciones, se calcula el valor promedio de las concentraciones obtenidas y la desviacin estndar. LD= Concentracin promedio obtenida para el blanco o la muestra enriquecida + 4.65 S

4.2.3 Comparacin del comportamiento de blanco con blanco enriquecido a diferentes concentraciones Determinacin 9

Se preparan soluciones independientes de blanco y de blanco enriquecido a diferentes niveles de concentracin bajos, cercanos al lmite de deteccin esperado. Se determina aquella concentracin a la cual la seal del analito es igual a la seal del blanco (Ca). Se calcula el lmite de deteccin. Puede calcularse de dos maneras.

1. LD = Ca + 2 S

Donde: Ca es la concentracin del analito determinada S la desviacin estndar del blanco 2. Se debe construir la regresin lineal de los blancos enriquecidos para determinar el valor de la pendiente (m), tambin debe calcularse el valor promedio de la seal del blanco y su desviacin estndar. Con estos datos se calcula el lmite de deteccin de la siguiente manera L.D. = Sm-Sbl m
Sm

=Sbl + K Sbl

Sm se puede determinar realizando 20-30 medidas del blanco preferiblemente a lo largo de un perodo de tiempo extenso. _ Sbl = seal media del blanco Sm = seal analtica mnima distinguible Sbl= Desviacin estndar del blanco m = pendiente de la regresin lineal K = mltiplo de la desviacin estndar del blanco, valores recomendados en la literatura son 2 o 3 4.2.4 Determinacin del corredor de error Determinacin Se preparan de 7 a 10 soluciones independientes, a tres niveles de concentracin (baja, intermedia y alta). Se construye el corredor de error a un nivel de confianza adecuado 95%, graficando la concentracin versus la seal obtenida. Utilizando para ello un programa estadstico apropiado.

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4.2.5 Mtodo de comparacin Seal / Ruido Determinacin En el caso de procedimientos analticos instrumentales que estn sujetos a ruido de fondo, los documentos de la International Conference Harmonization describen una aproximacin comn que consiste en comparar las seales de muestras con concentraciones bajas (conocidas) del analito, contra las seales del blanco. Se preparan muestras de concentracin baja conocida a diferentes niveles de concentracin, de acuerdo con el mtodo en estudio. Se prepara un blanco, y se miden las seales de las soluciones preparadas. El Lmite de deteccin corresponde a la concentracin mnima a la cual el analito es detectado con una relacin seal ruido de 2:1 o 3:1 5 5.1 Lmite de cuantificacin Mtodos no instrumentales

5.1.1 Con muestras preparadas Determinacin Se preparan varias muestras de concentraciones conocidas del analito en anlisis. Se analiza cada una de las muestras preparadas por el mtodo en estudio. El lmite de cuantificacin es la mnima concentracin cuantificable con una precisin y exactitud aceptable. (ver tabla 1) 5.2 Mtodos instrumentales

5.2.1 Con muestras preparadas Se procede de la misma manera que en el caso de los mtodos no instrumentales. 5.2.2 Mtodo de comparacin de Seal / Ruido Determinacin: Se preparan muestras de concentracin conocida a bajos niveles, de acuerdo al mtodo en estudio. Se prepara un blanco, y se mide la seal de las soluciones preparadas. 11

El lmite de cuantificacin es la concentracin de analito en la que se pueden dar cualquiera de las siguientes situaciones: - Relacin seal / ruido es 10:1. -Relacin seal / ruido es al menos 10 y la precisin de menos de 10% (Desviacin estndar relativa) -Relacin seal / ruido es mayor de 20 y la precisin menor de 5% (Desviacin estndar relativa)

5.2.3 Mtodo de respuesta de lnea base (cromatografa lquida o gaseosa) Determinacin Se debe preparar una solucin de blanco y se corre el cromatograma por un tiempo igual a 20 veces el ancho del pico obtenido para el analito. Se obtiene la medida de ruido como: -La ms grande fluctuacin pico a pico -La desviacin ms grande (positiva o negativa) de la respuesta media Se calcula el lmite de cuantificacin, utilizando la siguiente frmula: LC = 10 x Desviacin mnima x la pendiente de la curva de calibracin. Donde la pendiente de la curva de calibracin se obtiene del estudio de linealidad del mtodo. 5.2.4 Mtodo de la inyeccin doble de la muestra de analito Determinacin Se preparan muestras del analito a bajas concentraciones. Se llevan a cabo dos corridas para cada una de las soluciones. Se calcula el Lmite de cuantificacin como la concentracin ms baja del analito a la cual la desviacin estndar relativa de las dos mediciones es 2% 6 Especificidad

La especificidad puede verificarse de diferentes maneras, dependiendo del tipo de anlisis a realizar. Es importante tomar en cuenta, que en aquellos casos en que la matriz de la muestra es variable, tanto en trminos de su composicin (productos 12

biolgicos o de origen natural), as como en la fuente de las materias primas que las componen (diferentes proveedores, diferentes orgenes), se recomienda que la especificidad se establezca para las diferentes composiciones o fuentes en forma independiente. 6.1 Anlisis Tipo I: contenido. Potencia, disolucin y uniformidad de

Se puede demostrar de diferentes maneras:

6.1.1 Comparacin del comportamiento de la matriz o impurezas con respecto al comportamiento del estndar. Verificacin Se prepara una solucin estndar del analito a la concentracin esperada en el procedimiento de ensayo, y una solucin de matriz a la misma concentracin relativa. Se lleva a cabo una comparacin de las mediciones de ambas soluciones.

Criterio de aceptacin La matriz no debe presentar ningn tipo de seal que interfiera con la seal que se encuentra para el estndar. 6.1.2 Comparacin del comportamiento de muestra con respecto al comportamiento del estndar. Verificacin Se prepara una solucin estndar del analito a la concentracin esperada en el procedimiento de ensayo y una solucin de muestra a la misma concentracin. Se lleva a cabo una comparacin de las mediciones de ambas soluciones. Criterio de aceptacin La muestra no debe presentar ningn tipo de seal que interfiera con la seal que se encuentra para el estndar.

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6.1.3 Comparacin del comportamiento de muestra enriquecida con matriz con respecto al comportamiento de estndar enriquecido con matriz. Verificacin Se prepara una solucin estndar del analito a la concentracin esperada en el procedimiento de ensayo, y una solucin de muestra a la misma concentracin. Ambas soluciones son enriquecidas con una cantidad equivalente de matriz. Se lleva a cabo una comparacin de las mediciones de ambas soluciones enriquecidas. Criterio de aceptacin El criterio de aceptacin es que el comportamiento de las muestras enriquecidas y del patrn enriquecido, debe ser los ms cercano posible, en aquel punto en que se lleva a cabo la medicin del analito. Lo cual es indicativo de que la matriz, no aporta ningn tipo de seal que interfiera con la medicin.

6.1.4 Comparacin del comportamiento de muestras enriquecidas con analito con respecto al comportamiento de estndar enriquecido con analito. Verificacin Se prepara una solucin estndar del analito a la concentracin esperada en el procedimiento de ensayo, y una solucin de muestra a la misma concentracin. Ambas soluciones son enriquecidas con una cantidad equivalente de analito. Se lleva a cabo una comparacin de las mediciones de ambas soluciones enriquecidas.

Criterio de aceptacin El criterio de aceptacin es que el comportamiento de las muestras enriquecidas y del patrn enriquecido, debe ser los ms cercano posible, en aquel punto en que se lleva a cabo la medicin del analito. Lo cual es indicativo de que la matriz, no aporta ningn tipo de seal que interfiera con la medicin

Algunos autores recomiendan enriquecer tanto las muestras como el patrn con cinco niveles de concentracin del analito, y llevar a cabo la comparacin del comportamiento de las soluciones a los diferentes niveles. Esto permitira determinar el grado de interferencia, dependiendo de la concentracin del analito a determinar. Estos datos pueden obtenerse del estudio de linealidad del mtodo utilizando la adicin estndar.

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6.1.5 Procedimientos adicionales para verificar la especificidad, pueden ser: a. Ensayo de la pureza de pico, cuando se cuenta con un detector de arreglo de diodos o con espectrometra de masas. b. Reanlisis del pico, cuando el analito de inters es recogido y reanalizado bajo diferentes condiciones cromatogrficas o con mtodos sensitivos a la estructura del analito c. Comparacin de resultados obtenidos cuando la muestra puede ser analizada por dos o ms mtodos de separacin o de deteccin.

6.2

Anlisis Tipo II: Pruebas cuantitativas para la determinacin del contenido de impurezas o de valores lmites para el control de impurezas

6.2.1 Adicin estndar de impurezas a la muestra:

Verificacin Este mtodo se utiliza, si se encuentran disponibles en el mercado los patrones correspondientes a las impurezas. Se agrega a la muestra, diferentes concentraciones de impurezas, a la concentracin normal de trabajo Criterio de aceptacin Se debe demostrar que el contenido de impurezas determinado en el ensayo tienen una exactitud y precisin apropiadas para el mtodo al lmite de cuantificacin. 6.2.2 Comparacin de mtodos Verificacin En los casos en que los patrones de impurezas no estn disponibles, la especificidad puede ser demostrada por comparacin de los resultados del ensayo con el mtodo propuesto, con resultados obtenidos por un segundo mtodo bien caracterizado u oficial. La comparacin debe incluir muestras almacenadas bajo condiciones extremas relevantes ( luz, calor, humedad, hidrlisis cida o bsica, oxidacin ). Estas condiciones deben ser escogidas de acuerdo a la estructura qumica del analito, que determinar la susceptibilidad del mismo a la descomposicin. Criterio de aceptacin

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En el caso de la determinacin cuantitativa de impurezas, se deben comparar los resultados obtenidos por ambos mtodos. En el caso de pruebas de impurezas cromatogrficas, se deben comparar los perfiles de impurezas. 6.3 Verificacin Deben prepararse: 1. 2. 3. 4. Muestras que contengan el analito a identificar Muestras que no contengan el analito (matriz) Muestras sin analito pero contaminadas con una sustancia de estructura similar Solucin de patrn de la sustancia a identificar, preparado a una concentracin equivalente a las anteriores. Anlisis tipo IV: Pruebas de identificacin

Las tres primeras soluciones se comparan con la cuarta solucin.

Criterio de aceptacin Deben obtenerse los siguientes resultados para cada solucin 1. La solucin 1 Identificacin positiva 2. La solucin 2 Identificacin negativa 3. La solucin 3 Identificacin negativa.

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