Kimia Analisis Instrumentasi III-C

PENDAHULUAN

1.

Dasar Dasar Kromatografi Istilah kromatografi mula mula ditemukan oleh Michael Tswett (1908), seorang ahli

botani rusia. Ia telah memisahkan klorofil dan pigmen pigmen lain dari ekstrak tanaman dengan cara ini. Nama kromatografi diambil dari bahasa Yunani (chromato = penulisan dan grafe = warna). Kromatografi itu sendiri berarti penulisan dengan warna. Saat ini telah dikenal berbagai macam kromatografi, tetapi sebenarnya istilah kromatografi sebenarnya sudah tidak tepat lagi karena dengan kromatografi juga dapat dipisahkan senyawa senyawa yang tidak berwarna termasuk gas (Yazid, E., 2005). Penyelidikan tentang kromatografi kendor untuk beberapa tahun sampai digunakan suatu teknik dalam bentuk kromatografi padatan cair (LSC). Kemudian pada akhir tahun 1930 an dan permulaan tahun 1940 an, kromatografi mulai berkembang. Dasar kromatografi lapisan tipis (TLC) diletakkan pada tahun 1938 oleh Izmailov dan Schreiber, dan kemudian diperhalus oleh Stahl pada tahun 1958. Hasil karya yang baik sekali dari Martin dan Synge pada tahun 1941 (untuk ini mereka memenangkan Nobel) tidak hanya mengubah dengan cepat kroinatografi cair tetapi seperangkat umum langkah untuk pengembangan kromatografi gas dan kromatografi kertas. Pada tahun 1952 Martin dan James mempublikasikan makalah pertama mengenai kromatografi gas. Diantara tahun 1952 dan akhir tahun 1960 an kromatografi gas dikembangkan menjadi suatu teknik analisis yang canggih. Kromatografi cair, dalam praktek ditampilkan dalam kolom gelas berdiameter besar, pada dasamya dibawah kondisi atmosfer. Waktu analisis lama dan segala prosedur biasanya sangat membosankan. Pada akhir tahun 1960 an, semakin banyak usaha dilakukan untuk pengembangan kromatografi cair sebagai suatu teknik mengimbangi kromatografi gas. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau Kromatografi Cair Penampilan Tinggi atau High Preformance = Tekanan atau Kinerja Tinggi, High Speed = Kecepatan Tinggi dan Modern = moderen) telah berhasil dikembangkan dari usaha ini. Kemajuan dalam keduanya instrumentasi dan pengepakan kolom terjadi dengan cepatnya sehingga sulit untuk mempertahankan suatu bentuk hasil keahlian membuat instrumentasi dan pengepakan kolom dalam keadaan tertentu. Kromatografi adalah suatu nama yang diberikan untuk teknik pemisahan tertentu.
Makalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Kimia Analisis Instrumentasi III-C

2.

Prinsip Dasar Kromatografi

Kromatografi adalah cara pemisahan campuran yang didasarkan atas perbedaan distribusi dari komponen komponen campuran tersebut diantara dua fase, yaitu stationery (fase diam) dan mobile (fase bergerak). Fase diam dapat berupa zat padat atau zat cair, sedangkan fase bergerak dapat berupa zat cair atau gas. Dalam teknik kromatografi, sampel yang merupakan campuran dari berbagai macam komponen ditempatkan dalam situasi dinamis dalam system yang terdiri dari fase diam dan fase bergerak. Semua pemisahan pada kromatografi tergantung pada gerakan relatif dari masing masing komponen diantara ke dua fase tersebut. Senyawa atau komponen yang tertahan (terhambat) lebih lemah oleh fase diam akan bergerak lebih cepat daripada komponen yang tertahan lebih kuat. Perbedaan gerakan (mobilitas) antara komponen yang satu dengan lainnya disebabkan oleh perbedaan dalam adsorpsi, partisi, kelarutan atau penguapan diantara ke dua fase. Jika perbedaan perbedaan ini cukup besar, maka akan terjadi pemisahan secara sempurna. Oleh karena itu dalam kromatografi, pemilihan terhadap fase bergerak maupun fase diam perlu dilakukan sedemikian rupa sehingga semua komponen bisa bergerak dengan kecepatan yang berbeda beda agar dapat terjadi proses pemisahan. Secara umum dapat dikatakan bahwa kromatografi adalah suatu proses migrasi deferensial dinamis dalam system dalam mana komponen komponen cuplikan ditahan secara selektif oleh fase diam (Yazid, E., 2005). Dalam kromatografi gas, fase gerak berupa gas lembab seperti helium, nitrogen, argon, atau bahkan hidrogen yang digerakkan dengan tekanan melalui pipa yang berisi fase diam. Pada kromatografi gas ini fase bergerak berupa gas dan fase diam dapat berupa cairan dan padatan.
Makalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Prinsip dasar kromatografi adalah cara pemisahan senyawa senyawa atas dasar perbedaan migrasi senyawa tersebut pada fase diam atau pengaruh fase gerak. Oleh karena itu kromatografi dapat digunakan untuk tujuan isolasi (pemisahan), analisa jumlah komponen dan pengujian kemurnian (Sastrohamidjojo, H.,1985).

Kimia Analisis Instrumentasi III-C

3.

Klasifikasi Kromatografi Kromatografi dapat digolongkan berdasarkan pada jenis fase fase yang digunakan

dan berdasarkan atas prinsipnya.

Tabel Jenis Jenis Kromatografi (Yazid, E., 2005).

Fase

Fase Prinsip Teknik Kerja

Bergerak

Diam

Gas

Padat

Adsorpsi

Kromatografi Gas - Padat

Kromatografi Kolom, KLT Cair Padat Adsorpsi, Partisi dan Kromatografi Kertas

Kromatografi Kolom, KLT Cair Cair Partisi dan Kromatografi Kertas

Gas

Cair

Partisi

Kromatografi Gas - Cair

Makalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Kimia Analisis Instrumentasi III-C

Skema Pembagian Kromatografi

Makalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Kimia Analisis Instrumentasi III-C

INSTRUMENTASI Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

1.

Dasar Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Kromatografi cairan kinerja tinggi atau dalam bahasa inggrisnya dikenal dengan

sebutan HPLC (High Performance Liquid Chromatography) merupakan salah satu teknik pemisahan campuran secara modern. Teknik HPLC ini merupakan salah satu teknik kromatografi cair-cair, yang dapat digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kuantitatif dengan teknik HPLC didasarkan pada pengukuran luas/area puncak analit dalam kromatogram, dibandingkan dengan luas/area standar. Pada prakteknya, pembandingan kurang menghasilkan data yang akurat bila hanya melibatkan satu standar. Oleh karena itu, maka pembandingan dilakukan dengan menggunakan teknik kurva kalibrasi (Tim Kimia Analitik Instrumen. 2010:11) Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) merupakan sistem pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi. Hal ini karena didukung oleh kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detektor yang sangat sensitif dan beragam. KCKT mampu menganalisa berbagai cuplikan secara kualitatif maupun kuantitatif, baik dalam komponen tunggal maupun campuran. KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang antara lain; farmasi, lingkungan dan industri-industri makanan. Kegunaan umum KCKT adalah untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis, analisis ketidakmurnian (impurities) dan analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap (nonvolatil). KCKT paling sering digunakan untuk: menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat dan protein-protein dalam cairan fisiologis, menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat dan lain-lain. Beberapa senyawa organik yang mudah terurai (labil) pada pemanasan dapat dianalisis dengan cara kromatografi cairan kinerja tinggi atau HPLC karena HPLC dilakukan pada suhu kamar. Selain senyawa organic teknik HPLC juga dapat menganalisis senyawa anorganik, cuplikan yang mempunyai berat molekul tinggi atau titik didihnya tinggi seperti polimer. Keterbatasan metode KCKT adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika KCKT
Makalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Kimia Analisis Instrumentasi III-C

dihubungkan dengan spektrometer massa (MS). Keterbatasan lainnya adalah jika sampelnya sangat kompleks, maka resolusi yang baik sulit diperoleh. 2. Prinsip Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Prinsip kerja HPLC adalah sebagai berikut dengan bantuan pompa, fasa gerak cair dialirkan melalui kolom ke detektor, cuplikan dimasukkan ke dalam fasa gerak dengan penyuntikan. Didalam kolom terjadi pemisahan kompenen-komponen campuran karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom terlebih dahulu, sebaliknya solutsolut yang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih lama. Setiap komponen campuran yang keluar dideteksi oleh detector kemudian direkam dalam bentuk kromatogram. Kromatogram HPLC serupa dengan kromatogram gas. (Hendayana, Sumar.2006:69)

Gambar 1 Diagram kromatografi Cairan Kinerja Tinggi atau HPLC

Gambar 2 Skema Alat HPLC

Makalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Kimia Analisis Instrumentasi III-C

Konsentrasi Solut dalam setiap fasa dinyatakan sebagai koefisien partisi, K. Cs dan Cm adalah konsentrasi Solut dalam fasa diam dan fasa gerak.

Sebagai alternative, distribusi Solut-solut di antara dua fasa-fasa tersebut dinyatakan dengan satuan massa atau waktu keluarnya solut atau volume fasa gerak

K adalah factor kapasitas, gs dan gm adalah masssa Solut dlam fasa diam dan fasa gerak dan Tr dan t0 adalah waktu yang diperlukan untuk elusi solut yang berikatan dan solut yang tidak berikatan dengan fasa diam. Perkalian waktu-waktu ini dengan kecepatan alir fasa gerak menghasilkan volume retensi, Vr dan volume hampa Vo. Walaupun K dan K merupakan kuantitas yang berbeda, tetapi keduanya berhubungan secara linier. Ketika senyawa-senyawa dipisahkan dalam kolom maka masing-masing senyawa menyebar dan menjadi encer. Peristiwa ini dikenal dengan istilah band broadening yang terlihat dari puncak yang melebar. Diffusi Eddy merupakan salah satu penyebab pelebaran peak. Penyebab kedua berasal dari transfer massa, Solut selalu berpindahpindah di antara fasa gerak dan fasa diam.

Makalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Kimia Analisis Instrumentasi III-C

Gambar B.3 Diffusi Eddy Efisiensi kolom biasanya dinyatakan secara matematika dengan istilah plat teori. Penerapannya pada kromatografi, jumlah teori plat, N, untuk kolom ditentukan dari lebar peak dan waktu retensi. Suatu persamaan yang analog dengan persamaan Van Deemter dari kromatografi gas telah dikembangkan untuk HPLC. Persamaan ini dikenal sebagai persamaan knox, yang menyatakan pengaruh-pengaruh tiap proses band broadening terhadap efisiensi. Resolusi pada HPLC dipengaruhi oleh tiga factor yaitu efisiensi (N), selektivitas(a), dan retensi (k). adalah selektivitas, k1 dan k2 adalah masing0masing factor kapasitas senyawa 1 dan senyawa 2

3.

Jenis Retensi Solut Jenis retensi Solut merupakan dasar dalam HPLC karena pemisahan senyawa

bergantug pada jenis dan kekuatan interaksi Solut dengan fasa diam. Mekanisme retensi dapat dikelompokan menjadi lima, yaitu : a. Kromatografi adsorpsi Kromatografi ini sangat cocok untuk pemisahan senyawa-senyawa yang agak polar. Kromatografi yang menggunakan fasa gerak nonpolar dan fasa diam polar adsorben. Untuk mengontrol retensi solut, biasanya ditambahkan sedikit senyawa polar kepada fasa gerak sebagai modifier. Modifier bersaing dengan molekul-molekul solut untuk merebut tempat adsorpsi. b. Kromatografi partisi Kromatografi partisi merupakan kromatografi fasa terbalik dimana fasa gerak lebih polar daripada fasa diamnya. Fasa geraknya harus dijenuhkan dengan zat cair fasa diam untuk mengurangi erosi lapisan fasa diam. Pada kromatografi ini terdapat keterbatasan selektivitas sehingga ketidak campuran kedua fasa. Fasa gerak dan fasa
Makalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

biasanya HPLC fasa normal. Partikel-partikel silika atau alumina digunakan sebagai

Kimia Analisis Instrumentasi III-C

diam beberapa senyawa sangat kuat atau tidak tertahan sama sekali pada fasa diam. c. Kromatografi fasa terikat Kromatografi ini adalah krimatgrafi yang sering digunakan, kromatografi fasa terikat memiliki persamaan dengan kromatografi partisi. Pada kromatografi ini, adsorben fasa terikat terdiri dari partikel silika yang dimodifikasi secara kimia dengan rantai alkil. Fasa terikat merupakan fasa yang stabil. Oleh karena itu, kolom akan bertahan dan keterulangan waktu retensi yang baik. d. Kromatografi penukar ion Karakteristik fasa gerak dalam kromatografi penukaran ion seperti yang diperlukan oleh jenis kromatografi lain. Fasa gerak harus melarutkan cupllikan, mempunyai kekuatan pelarut yang memberikan waktu retansi yang cocok berinteraksi dengan solut sehingga memberikan harga selektivitas yang tepat. Fasa gerak dalam kromatografi penukaran ion adalah larutan dalam air dapat mengandung sedikit metanol atau pelarut organik lain ynag bercampur dengan air. Pelarut ini juga mengandung senyawa-senyawa ionisasi dalam bentuk buffer. Kekuatan pelarut dan selektivitas ditentukan oleh jenis dan konsentrasi bahan-bahan tambahan ini. Umunya, ion-ion dari fasa gerak bersaing dengan ion analit untuk memperebutkan tempat paking panukaran ion. Fasa diam dalam kromatografi penukaran ion dapat berupa penukaran ion asam sulfonat untuk kation atau penukar ion amin untuk anion. e. Kromatografi eksklusi ukuran Ukuran molekul merupakan criteria utama dalam pemisahan ini. pori-pori

Pemisahan terjadi karena Solut-solut berdifusi masuk dan keluar

material paking kolom.Molekul-molekul yang lebih besar dari diameter pori-pori akan melewati kolom secara cepat, dan molekul kecil menempati volume pori dan tertahan lebih lama.
Makalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

(Hendayana, Sumar.2006:71-77) 4. Komponen-komponen atau instrumentasi dari HPLC Fasa gerak Berupa zat cair yang disebut eluen (pelarut) dalam HPLC, fasa gerak selain bertugas membawa komponen-komponen campuran menuju detektor, juga dapat berinteraksi dengan solut-solut. Zat cair yang akan digunakan sebagai fasa gerak HPLC harus memenuhi beberapa persyaratan berikut :

Kimia Analisis Instrumentasi III-C

1. 2. 3.

4. 5.

Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan dianalisis. Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat mengganggu interpretasi kromatogram. Zat cair harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbata pada kolom. Biasanya pelarut disaring dengan saringan nilon berukuran diameter 0,45 m. Pompa vakum biasanya digunakan untuk menyaring partikel kotoran sekaligus menghilangkan gas dari pelarut karena gas dapat mengganggu base line Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar dan tidak beracun. Zat cair tidak kental. Umumnya keketalan tidak melebihi 0,5 cP (centi Poise). Sesuai dengan detektor. Pemilihan zat cair sebagai fasa gerak ini merupakan hal yang kritis dalam

keberhasilan pemisahan. Seyangnya, teori interaksi fasa gerak dengan sejumlah solut kurang jelas sehingga para pakar hanya dapat memilih sekelompok pelarut. Jadi, pada akhirnya, pemilihan fasa gerak didasarkan atas eksperimen trial-and error dengan berbagai jenis dan krom posisi pelarut hingga diperoleh kromatogram yang diharapkan. Pemilihan pelarut-pelarut juga bergantung pada faktor selektifitas () untuk komponen cuplikan. Gelembung udara (degassing) yang ada harus dihilangkan dari pelarut, karena udara yang terlarut keluar melewati detektor dapat menghasilkan banyak noise sehingga data tidak dapat digunakan.

(Harvey, David. 2000)

1 0

Makalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Kimia Analisis Instrumentasi III-C

1. Pompa Pompa dalam HPLC berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair malalui kolom yang berisi serbuk halus. Pompa yang dapat digunakan dalam HPLC harus memenuhi persyaratan : 1. Menghasilkan tekanan sampai 600psi. 2. Kelluara bebas pulsa 3. Kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 mL/menit. 4. Bahan tahan korosi. Dikenal tiga jenis pompa yang masing-masing memiliki keuntungan dan kerugian yaitu pompa reciprocating, displacement dan pneumatic.

1 1

Makalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Kimia Analisis Instrumentasi III-C

Gambar Pompa Pompa reciprocating Jenis pompa ini sekarang paling banyak dipakai. Popa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara gerakan piston mundur-maju yang dijalankan oleh motor. Piston berupa batang gelas dan berkontak langsung dengan pelarut. Ketika piston mundur maka bola gelas bawah terangkat dan pelarut masuk, sebaliknya ketika piston maju bola bawah menutup saluran pelarut dan pelarut yang telah berada diruang pompa didorong masuk ke dalam kolom. Gerakan piston mundur dan maju terjadi secara terus menerus sehingga memeberikan aliran eluen konstan. Pompa ini menghasilkan pulsa yang dapat mengganggu base-line kromatogram, karena itu dipasang peredam pulsa untuk menghilangkan gangguan base-line sedangkan keuntungan pompa ini adalah memiliki volume internal yang kecil. Untu mengurangi bond broadening. Selain itu, pompa ini menghasilkan tekanan tinggi, kecepatan alir konstan yang tidak brgantung pada tekanan balik kolom dan viskositas pelarut. Pompa displacement Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang dilengkapi pendorong yang digerakkan oleh motor. Pompa ini juga menghasilkan aliran yang cenderung tidakbergantung tekanan balik klom dan visikositas pelarut. Selain itu, keluaran pompa ini bebas pulsa. Akan tetapi pompa ini keterbatasan kapasitas pelarit dan tidak mudah untu mealkukan pergantian pelarut.
Makalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Pompa pneumatic Dalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi. Pompa jenis murah dan bebeas pulsa. Akan tetapi mempunyai keterbatasab kapasitas dan tekanan yang dihasilkan serta kecepatan alir bergantung pada viskositas pelarut dan tekanan balik

1 2

Kimia Analisis Instrumentasi III-C

kolom. 3. Pemasukan cuplikan Kebanyakan pemasukan cuplikan ke dalam kolom dapat menyebabkan band broadening. Oleh karena itu, cuplikan yang dimasukan harus sekecil mungkin, beberapa puluh miroliter. Teknik pemasukan cuplikan kedalam sistem HPLC melalui injeksi srynge, injeksi stop-flow, dan kran cuplikan.

Gambar 5 Syringe Injeksi syringe Alat yang paling dulu ada dan paling paling mudah untuk memasukkan cuplikan adalah syringe. Syringe disuntikkan melalui septum (seal karet) dan untuk ini dirancang syringe yang tahan tekanan sampai 1500 psi. Akan tetapi keterulangan injeksi syringe ini sedikit labih baik dari2-3% dan sering lebih jelek. Injeksi stop-flow Injeksi stop-flow adalah jenis injeksi syringe kedua tapi di sini aliran pelarut dihentikan sementara, asambungan pada ujung kolom dibuka dan cuplikan disuntikan dialirkan kembali. Kran cuplikan Jenis pemasukan cuplikan ini disebut juga loop dan paling banyak digunakan. Untuk memasukan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak perlu dua langkah : 1. Sejumlah volume cuplikan disuntikkan ke dalam loop dalam posisi load, cuplikan masih berada dalam loop. Kran diputar untuk mengubah cuplikan load menjadi posisi injeksi dan fasa gerak membawa cuplikan ke dalam kolom. Loop dapat diganti-ganti dan tersedia berbagai ukuran volume dari 5 hingga 500 L. Dengan sistem pemasukan cuplikan ini
Makalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

langsung ke dalam ujung kolom. Setelah menyambungkan kembali kolom maka pelarut

1 3

Kimia Analisis Instrumentasi III-C

memungkinkan memasukan cuplikan pada tekanan 7000 psi denga ketelitian tinggi. Juga loop mikro tersedia dengan volume 0,5 hingga 5L

4. Kolom Kolom HPLC biasanya terbuat dari stainless steel walaupun ada juga yang terbuat dari gelas berdinding tebal. Kolom utma berisi fasa diam, tepat teradinya pemisahan camppuran menjadi komonen-komponennya. Bergantung keperluannya koom utama dapat digunkan untuk analisis atau preparatif. Untuk keperluan preparatif, setiap komponen yang keluar kolom ditampung pada tabung yang berbeda dan keluaran HPLC dihubungkan dengan fraction colector. Selain kolom utama dikenal pula kolom pengaman (guard kolom). Kolom utama berisi fasa diam dan jenisnya bervariasi bergantung keperluan, misalnya dikenal kolom C-18, C-8, cyanopropyl, penularan ion. Kolom jenis C-18 dan C-8 paling banyak dipakai dalam HPLC. Fasa diam jenis terikat ini dapat dibuat dengan mereaksikan silika dengan alkilklorosilana yang dikenal dengan reaksi silanisasi. Fasa Diam Dalam kromatografi cair-cair, fasa diam adalah cairan film yang dilapiskan pada material kemasan yang terdiri dari partikel silica berpori 3-10 . fasa diam mungkin sebagian akan larut dalam fasa gerak. Untuk mencegah hilangnya fasa diam ini, maka fasa diam diikat secara kovalen pada partikel silica. Ikatan fasa diam diperoleh dengan mereaksikan partikel silica dengan organochlorosilane dengan bentukumu Si (CH3)2 RCl dimana R adalah alkil atau alkil yang tersubstitusi.
Makalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

1 4

Kimia Analisis Instrumentasi III-C

Untuk mencegah interaksi antara zat terlarut dengan gugus SiOH, silica sering direaksikan dengan Si(CH3)3Cl. Sifat dari fasa diam ditentukan oleh sifat organosilanes gugus alkil. Jika R adalah gugus fungsional polar, maka fasa diam akan polar. Contoh fasa diam polar, dimana R terdiri dari cyano (-C2H4CN), diol (-C3H6OCH2CHOHCH2OH), atau amino (-C3H6NH2). Karena fasa diam polar, fasa bergerak adalah nonpolar atau pelarut yang cukup polar. Kombinasi dari fasa diam polar dan fasa gerak non polar disebut kromatografi fasa normal. Dalam kromatografi fasa terbalik, sering ditemui dalam HPLC, fasa diam non-polar dan fasa gerak polar. Fasa diam non-polar paling umum menggunakan organochlorosilane dengan R adalah n-octyl (C8) atau n-octyldecyl (C18) rantai hidrokarbon

Kolom pengaman disebut juga pra-kolom karena diletakkan sebelum sisem pemasukan cuplikan. Kolom ini berukuran pendek, 5 cm dengan diameter 4,6 mm dan biasanya dipaking dengan partikel silika berukuran lebih besar dari ukuran partikel kolom utama. Kolom pengaman mempunyai dua fungsi yaitu untuk menyaring kotoran yang terbawa dalamfasa diam dan untuk menjenuhkan fasa diam dalam rangka menghindarkan terjadinya erosi fasa diam oleh aliran pelarut. Dengan demikian, kerusakan kolom utama yang mahal dapat dihindarkan. 5. Detektor Berbagai detektor untuk HPLC telah tersedia, walaupun demikian detektor harus memenuhi persyaratan berikut : 1. Cukup sensitif 2. Stabilitas dan ketrulangan tiggi 3. Respon linear terhadap solut 4. Waktu respon pendek sehingga tidak bergantung alir 5. Reliabilitas tinggi dan mudah digunakan 6. Tidak merusak cuplikan. Detektor HPLC dikelompokkan ke dalam tiga jenis detektor yaitu detektor umum memberi respon terhadap fasa gerak yang dimodulasi dengan adanya solut. Sebaliknya, detektor spesifik memberi respon terhadap beberapa sifat solut yang tidak dimiliki oleh fasa
Makalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

1 5

Kimia Analisis Instrumentasi III-C

gerak. Terakhir, detektor yang brsifat umum terhadap solut setelah fasa gerak dihilangkan dengan penguapan. Tabel 2 Karakteristik detector HPLC Dasar Pendeteksian Absorbsi UV Absorbsi IR Flourometri Indek bias Konduktometri Spektometri massa Elektrokimia Maksimum Jenis Sensitifitas Spesifik Spesifik Spesifik Umum Spesifik Umum Spesifik 2 x 10 10
-6 -16

Peka terhadap kecepatan alir ? Tidak Tidak Tidak Tidak Ya Tidak Ya

Sensitivitas suhu Rendah Rendah Rendah -4 + 10 C 2% C Tidak ada 1,5 % C

1 x 10 10
-8

10-11-7

10-10 10-12

Detektor UV terutama digunakan untuk pendeteksian senyawa-senyawa organik. Detektor UV dilengkapi dengan pengatur panjang gelombang sehingga panjang gelombang UV yang digunakan dapat dipilih disesuaikan dengan jenis cuplikan yang diukur. Walaupun demikian, biasanya panjang gelombang UV yang digunakan adalah pada 254 nm karena kebanyakan senyawa organik menyerap sinar UV pada sekitar panjang gelombang tersebut.

Gambar B.7 Diagram detector UV Detektor elektrokomia Detektor elektrokimia biasanya didasarkan pada daya hantar listrik dan poligrafi. Detektor jenis konduktometri biasanya digunakan untuk mendeteksi solut-solut yang dapat mengalami reaksi redoks baik senyawa organik maupun anorganik. (Hendayana, Sumar.2006:83-94) Detektor yang paling banyak digunakan dalam kromatografi cair modern kecepatan tinggi adalah detektor spektrofotometer UV 254 nm. Bermacam-macam

1 6

Makalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Kimia Analisis Instrumentasi III-C

detektor dengan variasi panjang gelombang UV-Vis sekarang menjadi populer karena mereka dapat digunakan untuk mendeteksi senyawa-senyawa dalam rentang yang luas. Detektor indeks refraksi juga secara luas digunakan, terutama dalam kromatografi eksklusi, tetapi umumnya kurang sensitif dari pada detektor spektrofotometer UV. Detektor lainnya, antara lain: detektor fluometer, detektor ionisasi nyala, detektor elektrokimia dan lain-lain juga telah digunakan. (Putra, Effendy De Lux. 2004 :6) 6. Rekorder Untuk mencetak hasil percobaan pada lembaran kertas berupa kumpulan puncak (kromatogram). Komponen yang terelusi mengalir ke detektor dan dicatat sebagai puncak-puncak yang secara keseluruhan disebut sebagai kromatogram

1 7

Makalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Kimia Analisis Instrumentasi III-C

Fungsi dari kromatogram antara lain: 1. Kualitatif Waktu retensi selalu konstan dalam setiap kondisi kromatografi yang sama dapat digunakan untuk identifikasi. 2. Kuantitatif Luas puncak proporsional dengan jumlah sampel yang diinjeksikan dan dapat digunakan untuk menghitung konsentrasi. 3. Kromatogram dapat digunakan untuk mengevaluasi efisiensi pemisahan dan kinerja kolom (kapasitas k, selektifitas , jumlah pelat teoritis N, jarak setara dengan pelat teoritis HETP dan resolusi R). Penerapan kromatografi cairan kinerja tinggi dapat dilakukan dengan dua mode oprasional, yaitu : Mode isokratik Mode isokratik serupa dengan mode isotermal dalam kromatografi gas, hanya dalam HPLC komposisi fasa geraknya yang sama selama pengukuran berlangsung. Tidak perlu mengatur komposisi campuran fasa gerak. Mode gradien Komposisi fasa geraknya divariasikan selama pengukuran berlangsung. Elusi gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fase gerak selama suatu analisis kromatografi berlangsung. Digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas. Pengaruh yang menguntungkan dari elusi gradien adalah memperpendek waktu analisis senyawaElusi Gradien menawarkan beberapa keuntungan : a. Total waktu analisis dapat direduksi b. Resolusi persatuan waktu setiap senyawa dalam campuran bertambah c. Ketajaman Peak bertambah (menghilangkan tailing) d. Efek sensitivitas bertambah karena sedikit variasi pada peak Gradien dapat dihentikan sejenak atau dilanjutkan. Optimasi Gradien dapat dipilih dengan cara trial and error. Tabel berikut ini menunjukkan kompatibilitas dari bermacam-macarn mode kromatografi cair dengan analisis gradien
Makalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

senyawa yang secara kuat ditahan di dalam kolo.

1 8

Kimia Analisis Instrumentasi III-C

3.8. Keuntungan KCKT

KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi Gas (KG). Dalam banyak hal kedua teknik ini dapat digunakan untuk memperoleh efek pemisahan yang sama membaiknya. Bila derivatisasi diperlukan pada KG, namun pada KCKT zat-zat yang tidak diderivatisasi dapat dianalisis. Untuk zat-zat yang labil pada pemanasan atau tidak menguap, KCKT adalah pilihan utama. Namun demikian bukan berarti KCKT menggantikan KG, tetapi akan memainkan peranan yang lebih besar bagi para analis laboratorium. Derivatisasi juga menjadi populer pada KCKT karena teknik ini dapat digunakan untuk menambah sensitivitas detektor UV Visibel yang umumnya digunakan.

KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan kromatografi cair klasik, antara lain:

Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat diselesaikari sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit (uncomplicated), waktu analisi kurang dari 5 menit bisa dicapai
Makalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana interaksi selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit berinteraksi dengan zat padat; pemisahan terutama dicapai hanya dengan rasa diam. Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan rasa diam dan rasa gerak pada KCKT memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang diinginkan.

Sensitivitas detektor : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam-macam zat. Detektor-

1 9

Kimia Analisis Instrumentasi III-C

detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram (10-12 gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll dapat juga digunakan dalam KCKT

Kolom yang dapat digunakan kembali : Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom KCKT dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang sma sebelum dari jenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik : zat zat yang tidak bisa dianalisis dengan KG karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi untuk menganalisis psesies ionik. KCKT dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk mengalissis zat zat tersebut.

Mudah rekoveri sampel : Umumnya setektor yang digunakan dalam KCKT tidak menyebabkan destruktif (kerusakan) pada komponen sampel yang diperiksa, oleh karena itu komponen sampel tersebut dapat dengan mudah sikumpulkan setelah melewati detector. Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk kromatografi penukar ion memerlukan prosedur khusus.

Kita harus mengasumsi bahwa kita memperoleh respons detektor yang sama untuk setiap komponen Untuk mengatasi kesulitan ini, maka kalibrasi detektor diperlukan.

5.1. Metoda Persentase Tinggi / Lebar Puncak Metoda ini disebut juga Metoda Normalisasi Internal. Untuk analisis kuantitatif diasumsikan bahwa lebar atau tinggi Puncak (Peak) sebanding (proportional) dengan kadar / konsentrasi zat yang menghasil puncak. Dalam metoda yang paling sederhana diukur lebar atau tinggi Puncak, yang kemudian dinormalisasi (ini berarti bahwa setiap lebar atau tinggi Puncak diekspresikan sebagai suatu persentase dari total). Hasil normalisasi dari lebar atau tinggi puncak memberikan komposisi dari campuran yang dianalisis, seperti contoh pada Tabel 5.1. berikut:

2 0

Makalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

V. ANALISIS KUANTITATIF

Kimia Analisis Instrumentasi III-C

Normalisasi tinggi Puncak (%w/w) 12/162 x 100 = 7, 4 27/162 x 100 = 16,7 72/162 x 100 = 44,4 51/162 x 100 = 31,5

Puncak 1 2 3 4

Tinggi Puncak (mm) 12 27 72 51

162 100 Ada dua masalah dengan pendekatan ini, yaitu: Kita harus yakin bahwa kita telah menghitung semua komponen, yang tiap-tiap komponen muncul sebagai suatu puncak yang terpisah pada kromatogram. Komponenkomponen dapat berkoelusi, atau ditahan di dalam kolom, atau ,terelusi tanpa terdeteksi.

5. 2. Metoda Baku Luar (External Standard Method) Pada metoda ini kita membuat suatu Baku/ Standard yang mengandung senyawa /senyawa-senyawa yang akan ditetapkan kadarnya, idealnya jumlah baku sama dengan jumlah bahan yang akan dianalisis, dan kita membandingkan kromatogram baku dengan kromatogram sampel. Dan kromatogram baku dapat dihitung suatu respons faktor untuk setiap Puncak yang diinginkan, respons faktor memberi intormasi tentang konsentrasi komponen yang dihasilkan oleh satuan respons detektor (unit detector respons) : KonsentrasiKomponen Responsiraktor = -------------------------------- (5a) lebaratauTinggiPuncak Kemudian untuk kromatogram sampel kita dapat menghitung konsentrasi dari setiap komponen yang diinginkan dengan cara mengalikan (multiplikasi) tinggi atau lebar puncak dengan respons faktor. Bila bekerja dengan metoda ini, respons detektor harus tinier untuk setiap senyawa pada kisaran (range) konsentrasi yang digunakan, dan juga kita harus menginjeksikan (bila secara manual) jumlah yang sama untuk setiap komponen pada kedua kromatografi, sehingga berhasilnya operasi dari metoda ini tergantung pada kemampuan menginjeksi sampel dengan presisi yang bagus . 3. Metoda Baku Dalam (Internal Standard Method) Dalam metoda ini kita menambahkan ke dalam sampel sejumlah tertentu (jumlah yang diketahui) Zat standar (Baku Dalam). Kromatogram yang diperoleh dibandingkan dengan kromatogram sampel atau campuran senyawa dalam sampel. Metoda ini mempunyai keuntungan dibanding dengan metoda baku luar karena, ia mengkompensasi variasi volume injeksi dan juga untuk perubahan yang kecil dari sensitivitas detektor atau perubahan krornatograti yang bisa terjadi. Karena kita tidak perlu menginjeksi dalam jumlah yang sarna setiap waktu, maka metoda ini biasanya mempunyai presisi yang lebih baik dari pada menggunakan baku luar. Dari kromatogram standar dapat dihitung respons faktor relatif sebagai berikut : C/A r= ------ ....................................... (5b) Cs/As r C A Cs As = = = = = respons faktor relatif Konsentrasi Kornponen Sampel Lebar atau Tinggi Puncak Komponen Sampel Konsentrasi Baku Dalam Lebar atau Tinggi Baku Dalam

2 1

Makalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Kimia Analisis Instrumentasi III-C

Di dalam campuran sampel digunakan rumus berikut : Cu Cu Au Cs As = Cs Au*r*----- ..................................(5c) As = Konsentrasi komponen sampel = Lebar atau Tinggi Puncak = Konsentrasi Baku Dalam = Lebar atau Tinggi Puncak Baku Dalam Pendekatan lain adalah mengkoreksi setiap lebar puncak pada campuran yang diketahui dengan mengalikannya dengan respons faktor relatif. Hal ini menghasilkan lebar Puncak yang diperoleh dengan respons detektor yang sama untuk setiap komponen. Komposisi dari campuran kemudian diperoleh dengan normalisasi lebar Puncak yang telah dikoreksi. Untuk bekerja dengan metoda ini sekali lagi kita harus yakin bahwa kita telah melihat semua komponen di dalam campuran sebagai i Puncakpuncak yang terpisah pada kromatogram.

2 2

Makalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Kimia Analisis Instrumentasi III-C

2 3

Makalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi