LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS HASANUDDIN

LAPORAN PRAKTIKUM
ISOLASI DAN UJI EFEKTIVITAS FUNGI ENDOFIT SEBAGAI ANTIMIKROBA

OLEH :

KELOMPOK IV
SONIA RANGGA SALU ARI KURNIAWATI EVY MUSTIQAWATI RUDIARFIANSYAH NATALIA WIJOYO HARDIYANTI HARAHAP SULTAN (N 111 10 111) (N 111 10 134) (N 111 10 253) (N 111 10 261) (N 111 10 286) (N 111 10 302) (N 111 10 303)

GOLONGAN JUMAT PAGI

ASISTEN : SHERWIN ARMANDA MAKASSAR 2011

BAB I PENDAHULUAN I.1 Latar Belakang Tanaman dan mikroorganisme mempunyai hubungan yang sangat erat satu sama lain. Mikroorganisme dapat menyerang tanaman sehingga menyebabkan penyakit pada tanaman induknya, sementara ada pula mikroorganisme yang bersimbiosis sangat baik dengan tanaman

induknya. Mikroorganisme pada tanaman terdiri dari 2 jenis yaitu mikroorganisme yang tinggal di permukaan tanaman disebut epifit (epiphyte) dan mikroorganisme yang tinggal di dalam tanaman disebut endofit (endophyte). (1:5) Studi akhir-akhir ini telah banyak dilakukan para peneliti menggunakan tanaman tropis. Data menunjukkan bahwa tanaman induk di daerah tropis kaya akan mikroba endofit yang belum diklasifikasikan dan kemungkinan mengandung generasi dan spesies baru. Hubungan antara mikroba endofit dan tanaman dalam menghasilkan metabolit sekunder sangat menarik dipelajari. (1:5) Dalam bioteknologi, mikroba endofit ini sangat potensial sebagai penghasil senyawa-senyawa baru berkhasiat obat, metabolit sekunder, pengontrol biologi dan berbagai senyawa yang bermanfaat. Dengan demikian diperlukan pengembangan atau penelitian untuk mempelajari hubungan antara tanaman dan endofitik pada kondisi tropis. (2:1)

I.2 Maksud dan Tujuan Percobaan I.2.1 Maksud Percobaan Mengetahui dan memahami cara mengisolasi mikroba endofit dari suatu sampel dan pengujian aktivitas antimikrobanya. I.2.2 Tujuan Percobaan Mengisolasi fungi endofit dari sampel tanaman Tapak Liman (Elephantopus scaber) dan menentukan kemampuannya dalam

menghambat pertumbuhan dari mikroorganisme tertentu. I.3 Prinsip Percobaan 1. Pengambilan dan pengolahan sampel Sampel tanaman Tapak Liman (Elephantopus scaber) dibersihkan, disterilkan dengan alkohol 70%, NaOCl 25%, dan air steril, dan dihancurkan sehingga sampel tanaman tersebut dapat dibuat pengencerannya, mulai dari 10-1 hingga 10-5. 2. Isolasi dan pemurnian mikroorganisme endofit Tiga tingkat pengenceran terakhir sampel, yaitu pengenceran 10 -3, 10-4, dan 10-5 diisolasi menggunakan metode pengenceran ke dalam medium PDA (Potato Dextrose Agar) dan diinkubasikan selama 2-5 hari pada suhu kamar, kemudian mikroorganisme terpilih yang tumbuh kembali diinokulasikan ke dalam medium PDA (Potato Dextrose Agar) yang baru dengan menggunakan metode gores untuk mendapatkan koloni terpisah dan diinkubasikan selama 1-3

hari pada suhu kamar, kemudian koloni yang tumbuh terpisah kembali diinokulasikan dengan metode agar miring ke dalam medium PDA (Potato Dextrose Agar) hingga diperoleh stok kultur murni setelah diinkubasikan selama 3 hari pada suhu kamar. 3. Peremajaan dan pembenihan Mikroorganisme dari stok kultur murni diinokulasikan kembali

dengan metode agar miring ke dalam medium PDA (Potato Dextrose Agar) yang baru dan diinkubasikan selama 1-3 hari pada suhu kamar, kemudian 1-2 ose koloni diinokulasikan ke dalam medium PDY (Potato Dextrose Yeast) dan diinkubasi selama 3 hari pada suhu kamar, kemudian seluruhnya diinokulasikan ke dalam medium produksi dan diinkubasi selama 7 hari pada suhu kamar sambil diaerasi pada shaker, lalu sampel diendapkan dengan alat sentrifus selama 20 menit dengan kecepatan 2500 rpm hingga diperoleh filtrat dan residunya. 4. Pengujian aktivitas mikroba Pengujian aktivitas fungi endofit terpilih dari sampel tapak liman (Elephantopus scaber)dengan menginokulasikan suspensi biakan Streptococcus mutans dan Escherichia coli ke dalam medium NA (Nutrient Agar), kemudian filtrat dan residu diuji daya hambatnya ke dalam medium tersebut dengan paper disk dan diinkubasikan selama 1 x 24 jam pada suhu 370C, kemudian diamati zona hambatnya.

BAB II TINJAUAN PUSTAKA II.1 Teori Umum Mikroba endofit (bakteri dan fungi) adalah organisme hidup yang berukuran mikroskopis yang hidup di dalam jaringan tanaman (xilem dan floem), daun, akar, buah, dan batang. Mikroba ini hidup bersimbiosis saling menguntungkan, dalam hal ini mikroba endofitik mendapatkan nutrisi dari hasil metabolisme tanaman dan memproteksi tanaman melawan herbivora, serangga atau jaringan yang patogen sedangkan tanaman mendapatkan derivat nutrisi dan senyawa aktif yang diperlukan selama hidupnya. Mikroba endofit spesifik yang diperoleh dari bagian dalam tanaman diduga mampu menghasilkan sejumlah senyawa bioaktif yang spesifik yang sama dengan senyawa bioaktif tanaman tanpa harus mengekstraksi bagian tanamannya sehingga kelangsungan hidup

tanaman tidak terganggu. (1:3) Kemampuan mikroba endofit memproduksi senyawa metabolit sekunder sesuai dengan tanaman inangnya merupakan peluang yang sangat besar dan dapat diisolasi dari tanaman inangnya tersebut. Dari sekitar 300.000 jenis tanaman yang tersebar di muka bumi ini, masingmasing tanaman mengandung satu atau lebih mikroba endofit yang terdiri dari bakteri dan jamur. (1:6) Beberapa ahli telah mengisolasi dan meneliti endofit dari berbagai tanaman diantaranya tanaman obat, tanaman, dan tanaman-tanaman

hutan. Bakteri atau fungi tersebut dapat menghasilkan senyawa metabolit yang dapat bermanfaat bagi manusia sebagai antibiotika

(antifungi/antibakteri), antivirus, antikanker, antidiabetes, antimalaria, antioksidan, antiimunosupresif, antiserangga, zat pengatur tumbuh, dan penghasil enzim-enzim hidrolitik seperti amilase, selulase, xilanase, ligninase, dan kitinase. Manfaat dari endofit lainnya juga dalam fiksasi nitrogen (N2) pada beberapa tanaman. (2:4) Fungi endofit adalah fungi yang terdapat di dalam sistem jaringan tumbuhan, seperti daun, bunga, ranting ataupun akar tumbuhan. Fungi ini menginfeksi tumbuhan sehat pada jaringan tertentu dan mampu menghasilkan mikotoksin, enzim serta antibiotika. (3:16) Asosiasi fungi endofit dengan tumbuhan inangnya, oleh Carrol (1988) digolongkan dalam dua kelompok, yaitu mutualisme konstitutif dan induktif. Mutualisme konstitutif merupakan asosiasi yang erat antara fungi dengan tumbuhan terutama rumput-rumputan. Pada kelompok ini fungi endofit menginfeksi ovula (benih) inang, dan penyebarannya melalui benih serta organ penyerbukan inang. Mutualisme induktif adalah asosiasi antara fungi dengan tumbuhan inang, yang penyebarannya terjadi secara bebas melalui air dan udara. Jenis ini hanya menginfeksi bagian vegetatif inang dan seringkali berada dalam keadaan metabolisme inaktif pada periode yang cukup lama. (3:16) Ditinjau dari sisi taksonomi dan ekologi, fungi ini merupakan organisme yang sangat heterogen. Clay (1988) melaporkan, bahwa fungi

endofit dimasukkan dalam famili Balansiae yang terdiri dari 5 genus yaitu Atkinsonella, Balansiae, Balansiopsis, Epichloe dan Myriogenospora. Genus Balansiae umumnya dapat menginfeksi tumbuhan tahunan dan hidup secara simbiosis mutualistik dengan tumbuhan inangnya. Dalam simbiosis ini, fungi dapat membantu proses penyerapan unsur hara untuk proses fotosintesis serta melindungi tumbuhan inang dari serangan penyakit, dan hasil dari fotosintesis dapat digunakan oleh fungi untuk mempertahankan kelangsungan hidupnya. (3:17) Banyak kelompok fungi endofit yang mampu memproduksi senyawa antibiotika yang aktif melawan bakteri maupun fungi patogenik terhadap manusia, hewan dan tumbuhan, terutama dari genus

Coniothirum dan Microsphaeropsis. Fungi endofit mampu menghasilkan siklosporin A, yang berpotensi sebagai antifungal dan bahan

imunosupresif. Siklosporin dihasilkan oleh strain Acremonium luzulae yang diisolasi dari buah strawberry. (3:18) Senyawa antibiotika lainnya seperti sefalosporin mulanya

dihasilkan oleh satu strain Cephalosporium. Selanjutnya juga ditemukan pada fungi Anixiopsis, Arachnomyces,Diheterospora, Paecilomyces, Scopulariopsis dan Spiroidium. (3:18) Mikroba endofit yang diisolasi dari tumbuhan obat akan memiliki aktivitas yang lebih besar, bahkan dapat memiliki aktivitas yang lebih besar dibandingkan aktivitas tumbuhan inangnya. Dilihat dari segi efisiensi, hal ini sangat menguntungkan, karena siklus hidup mikroba

endofit lebih singkat dibandingkan siklus hidup tumbuhan inangnya, sehingga dapat menghemat waktu yang dibutuhkan untuk

mendapatkan senyawa tersebut, dan jumlah senyawa yang diproduksi dapat dibuat dalam skala yang besar dengan menggunakan proses fermentasi. Di samping itu, ada keuntungan lain yang diperoleh, yaitu menjaga kelestarian tumbuhan-tumbuhan obat, terutama yang termasuk jenis tumbuhan langka, agar tidak dieksploitasi secara terus menerus yang akhirnya akan mengakibatkan kepunahan. (2:6) Metabolit sekunder merupakan senyawa yang disintesis oleh suatu mikroba, tidak untuk memenuhi kebutuhan primernya (tumbuh dan berkembang) melainkan untuk mempertahankan eksistensinya dalam berinteraksi dengan lingkungannya. Metabolit sekunder yang dihasilkan oleh mikroorganisme endofit merupakan senyawa antibiotik yang mampu melindungi tanaman dari serangan hama insekta, mikroba patogen, atau hewan pemangsanya, sehingga dapat dimanfaatkan sebagai agen biokontrol. (3:6) Senyawa ini juga dapat digunakan sebagai alat pemikat bagi serangga atau hewan lainnya guna membantu penyerbukan atau menyebarkan bijinya, dan sebagai alat pelindung terhadap kondisi lingkungan fisik yang ekstrim seperti intensitas ultraviolet yang tinggi dari sinar matahari, pencemaran lingkungan secara kimiawi, kekeringan yang berkepanjangan, tumbuhnya. (3:7) atau berkurangnya zat makanan pada tempat

Ada beberapa macam metode isolasi yang dapat digunakan untuk mengisolasi suatu mikroba endofit, yaitu: 1. Isolasi pada agar cawan Prinsip pada metode ini adalah mengencerankan mikroorganisme sehingga diperoleh individu spesies yang dapat dipisahkan dari organisme lainnya. Setiap koloni yang yang tampak pada cawan tuang tersebut setelah diinkubasi besaral dari sel tunggal. Namun,

pegenceran tetap perlu dilakukan sehingga pada cawan yang terakhir mengandung koloni-koloni yang terpisah diatas permukaan di dalam cawan. 2. Isolasi Pada Medium Cair Metode isolasi pada medium cair dilakukan bila mikroorganisme tidak dapat tumbuh pada cawan (medium padat), tetapi hanya dapat tumbuh pada kultur cair. Metode ini juga perlu dilakukan pengenceran dengan beberapa serial pengenceran. Semakin tinggi pengenceran, peluang untuk mendapatkaan satu sel semakin besar. 3. Isolasi Sel Tunggal Metode isolasi sel tunggal dilakukan untuk mengisolasi sel mikroorganisme yang tidak dapat tumbuh pada agar cawan maupun medium cair. Sel mikroorganisme dilihat bersamaaan dengan sekitar 100 kalinya kemudian sel tersebut dipisahkan dengan menggunakan pipet kapiler yang sangat halus ataupun mikro.

II.2 Uraian Bahan 1. Aquadest (4 : 96) Nama Resmi Nama Lain RM/BM Pemerian : Aqua destillata : Aquadest : H2O/18,02 : Cairan jernih, tidak berwarna, tidak berasa, dan tidak berbau Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik Kegunaan 2. Alkohol (4 : 65) Nama Resmi Nama Lain RM/BM Pemerian : Aethanolum : Alkohol : C2H6O/46,00 : Cairan tidak berwarna, jernih, mudah menguap, mudah bergerak, bau khas, rasa panas, mudah terbakar dengan memberikan nyala biru yang tidak berasap Penyimpanan : Dalam wadah tertutup rapat, terlindung dari cahaya, jauh dari nyala api Kegunaan 3. Agar (4 : 74) Nama Resmi Nama Lain : Agar : Agar-agar : Sebagai antiseptik : Sebagai pelarut

Pemerian

: Berkas potongan memanjang, tipis seperti selaput, berlekatan, berbentuk keping, serpih atau butiran, jingga lemah kekuningan, abu-abu kekuningan sampai kuning pucat, tidak berwarna, tidak berbau, berlendir jika lembap

Kelarutan

: Praktis tidak larut dalam air, larut dalam air mendidih

Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik Kegunaan : Sebagai pengeras medium

4. Dekstrosa (5 : 300) Nama Resmi Nama Lain RM/BM Pemerian : Dextrosum : Dekstrosa, glukosa : C6H12O6/180,00 : Hablur, tidak berwarna, serbuk hablur, butiran putih, tidak berbau, rasa manis Kelarutan : Larut dalam air, memberikan larutan berwarna coklat kekuningan yg bereaksi dengan asam Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik Kegunaan : Sebagai komposisi medium

5. Natrium klorida (4 : 403) Nama Resmi Nama Lain RM/BM : Natrii chloridum : Natrium klorida : NaCl/58,44

Pemerian

: Hablur heksahedral, tidak berwarna, atau serbuk hablur putih, tidak berbau, rasa asin

Kelarutan

: Larut dalam 2,8 bagian air, dalam 2,7 bagian air mendidih, dan dalam lebih kurang 10 bagian gliserol P, sukar larut dalam etanol (95%) P

Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik Kegunaan : Sebagai komposisi medium

6. Pepton (5 : 721) Nama Resmi Pemerian : Pepton : Serbuk; kuning kemerahan sampai coklat; bau khas tidak busuk Kelarutan : Larut dalam air; memberikan larutan berwarna coklat kekuningan yang bereaksi agak asam; praktis tidak larut dalam etanol (95%) P dan dalam eter P Kegunaan : Sebagai komposisi medium

7. Ekstrak Beef (5 : 1152) Kaldu daging sapi konsentrat diperoleh dengan

mengekstraksi daging sapi segar tanpa lemak, dengan cara merebus dalam air dan menguapkan kaldu pada suhu rendah dalam ruang hampa udara sampai terbentuk residu kental berbentuk pasta

Pemerian

: Massa

berbentuk

pasta,

berwarna

coklat

kekuningan sampai coklat tua, bau dan rasa seperti daging, sedikit asam Penyimpanan : Wadah tidak tembus cahaya, tertutup rapat 8. Ext. yeast (4 : 671) Nama resmi Nama lain Pemerian : Ekstrak ragi P : Sari ragi P : Serbuk, kuning kemerahan sampai coklat, bau khas tidak busuk Kelarutan : Larut dalam air, membentuk larutan kuning sampai coklat, berisi asam lemah, tidak mengandung karbohidrat Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik 9. Pati terlarut (4 : 720) Nama resmi Nama lain Pemerian Kelarutan : Pati larut P : Pati P : Serbuk hablur, putih : Larut dalam air panas, membentuk larutan agak keruh Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik II.3 Uraian Sampel 1. Tapak Liman (Elephantopus scaber) (6) Kingdom : Plantae

Divisi Kelas Subkelas Ordo Famili Genus Spesies II.4 Uraian Mikroba

: Spermatophyta : Angiospermae : Dicotyledoneae : Asteridae : Asterales : Elephantopus : Elephantopus scaber

II.4.1 Klasifikasi mikroba 1. Streptococcus mutans (7 : 168) Kingdom Filum Kelas Ordo Famili Genus Spesies : Protista : Scotobacteria : Bacteria : Eubacteriales : Lactobacillaceae : Streptococcus : Streptococcus mutans

2. Escherichia coli (7 : 174) Kingdom Filum Kelas Ordo Famili : Protista : Protophyta : Schyzomycetes : Eubacteriales : Eubacteriaceae

Genus Spesies II.4.2 Morfologi mikroba

: Escherichia : Escherichia coli

1. Streptococcus mutans (7 : 168) Sel berbentuk batang, bersifat aerobik, bergerak dengan flagel, spesies bersifat parasit, terbawa oleh partikel-partikel debu di udara, mempunyai habitat pada tanah, air, dan lingkungan akuatik. 2. Escherichia coli (7 : 174) Batang lurus, 1,1 1,5 m x 2,0 6,0 m, motil dengan flagelum peritritikus atau non motil, gram negatif. Tumbuh dengan mudah pada medium nutrien sederhana. Laktosa difermentasi oleh sebagian besar galur dengan produksi asam dan gas.

BAB III METODE KERJA III.1 Alat dan Bahan III.1.1 Alat Alat-alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah autoklaf, botol pengencer, cawan petri, enkas, erlenmeyer, handspray, jangka sorong, jarum inokulum, LAF (Laminar Air Flow), lampu spiritus, lumpang dan alu, paper disk, pinset, sendok tanduk, sentrifus, shaker, spoit, dan tabung reaksi. III.1.2 Bahan Bahan-bahan yang digunakan dalam percobaan ini adalah alcohol 70%, aluminium foil, aquadest, kapas, kertas label, kertas pembungkus, korek api, medium NA (Nutrient Agar), PDA (Potato Dextrose Agar), PDY (Potato Dextrose Yeast), medium produksi, kloramfenikol 30 ppm, dan sampel Tapak Liman (Elephantopus scaber). III.2 Cara Kerja 1. Pengambilan dan pengolahan sampel a. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan b. Sampel Tapak Liman (Elephantopus scaber) dibersihkan dan dipotong-potong kecil c. Ditimbang sebanyak 10 gram

d. Direndam dalam alkohol selama 20 menit kemudian dibilas dengan air steril e. Dihaluskan dalam lumpang dengan alu f. Dimasukkan ke dalam botol peengencer yang telah terisi 90 mL air steril hingga diperoleh pengenceran 10 -1 g. Diambil 1 mL dari pengenceran 10 -1 dan dimasukkan ke dalam botol pengencer yang telah terisi 9 mL air steril hingga diperoleh pengenceran 10-2 h. Diulangi langkah sebelumnya untuk membuat pengenceran 10 -3, 10-4, dan 10-5 2. Isolasi dan pemurnian mikroorganisme endofit a. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan b. Diambil masing-masing 1 mL dari pengenceran 10 -3, 10-4, dan 10-5 kemudian diinokulasikan ke dalam cawan petri c. Dimasukkan medium PDA (Potato Dextrose Agar) ke dalam masing-masing cawan petri kemudian dihomogenkan d. Dibungkus ketiga cawan petri tadi dan diinkubasikan selam 2-5 hari pada suhu kamar e. Diamati koloni yang tumbuh dan zona hambatnya f. Dimasukkan medium PDA (Potato Dextrose Agar) dalam cawan petri dan ditambahkan kloramfenikol 20 ppm kemudian

dihomogenkan dan dibiarkan memadat

g. Diinokulasikan 1 ose koloni terpilih yang memiliki zona hambat dengan cara digores pada medium PDA (Potato Dextrose Agar) yang telah memadat h. Dibungkus dan diinkubasikan selama 3 hari pada suhu kamar i. Diamati koloni yang tumbuh secara terpisah dari koloni lainnya j. Dibuat medium PDA (Potato Dextrose Agar) dalam tabung rekasi dengan metode agar miring k. Diinokulasikan 1 ose koloni yang terpisah ke dalam medium PDA (Potato Dextrose Agar) miring yang telah disiapkan l. Dibungkus dan diinkubasikan selama 3 hari pada suhu kamar m.Diamati pertumbuhan koloninya hingga diperoleh koloni murni 3. Peremajaan dan pembenihan a. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan b. Disiapkan 25 mL medium PDY (Potato Dextrose Yeast) c. Disuspensikan koloni murni yang diperoleh dengan 2 mL larutan NaCl fisiologis d. Dimasukkan suspensi koloni ke dalam medium PDY (Potato Dextrose Yeast) e. Dibungkus dan diinkubasikan selama 3 hari pada suhu kamar sambil diaerasi pada shaker f. Disiapkan 100 mL medium produksi g. Dimasukkan seluruh medium PDY beserta koloninya ke dalam medium produksi

h. Dibungkus dan diinkubasikan selama 7 hari pada suhu kamar sambil diaerasi pada shaker i. Diendapkan sel fungi dalam medium produksi selama 20 menit dengan kecepatan 2500 rpm j. Dipisahkan antara filtrat dengan residu k. Diukur pH filtrat yang diperoleh 4. Pengujian aktivitas mikroba a. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan b. Dimasukkan 20 L suspensi biakan Streptococcus mutans ke dalam botol coklat c. Dimasukkan medium NA (Nutrient Agar) secukupnya ke dalam botol coklat kemudian dihomogenkan d. Dituangkan ke dalam cawan petri lalu biarkan memadat e. Diresapkan 20 L filtrat, residu, dan kloramfenikol 30 ppm (sebagai control) ke dalam paper disk f. Dimasukkan masing-masing paper disk ke dalam cawan petri yang telah terisi medium NA (Nutrient Agar) yang telah memadat dan diatur posisinya sedemikian rupa g. Dibungkus dan diinkubasikan secara terbalik selama 1x24 jam pada suhu 370C h. Diulangi seluruh langkah sebelumnya untuk biakan Escherichia coli i. Diamati dan diukur zona hambat dari filtrat, residu, serta kontrol kloramfenikol

BAB IV HASIL PENGAMATAN IV.1 Data Pengamatan 1. Pengujian daya hambat No. 1 2 IV.2 Perhitungan 1. Kontrol (kloramfenikol 30 ppm) a. Streptococcus mutans 1) 13 + (3,5 x 0,05) = 13,175 mm 2) 13 + (5,5 x 0,05) = 13,275 mm 3) 14 + (9 x 0,05) = 14,045 mm 4) Rata-rata : (13,175 + 13,275 + 14,45) 3 = 13,63 mm b. Escherichia coli 1) 15 + (2 x 0,05) = 15,1 mm 2) 16 + (1 x 0,05) = 16,05 mm 3) 13 + (0 x 0,05) = 13 mm 4) Rata-rata : (15,1 + 16,05 + 13) 3 = 14,71 mm Biakan Streptococcus mutans Escherichia coli Daya hambat (mm) Kontrol Filtrat Residu 8,19 8,56 13,63 7,025 7,68 9,25 4,64 14,71 8,65 3,9

2. Filtrat

a. Streptococcus mutans 1) Filtrat I a) 7 + (5,5 x 0,05) = 7,275 mm b) 9 + (6 x 0,05) = 9,3 mm c) 8 + (0 x 0,05) = 8 mm d) Rata-rata : (7,275 + 9,3 + 8) 3 = 8,19 mm 2) Filtrat II a) 6 + (8 x 0,05) = 6,4 mm b) 7 + (9,5 x 0,05) = 7,475 mm c) 7 + (4 x 0,05) = 7,2 mm d) Rata-rata : (6,4 + 7,475 + 7,2) 3 = 7,025 mm b. Escherichia coli 1) Filtrat I a) 8 + (0 x 0,05) = 8 mm b) 9 + (5 x 0,05) = 9,25 mm c) 10 + (1 x 0,05) = 10,5 mm d) Rata-rata : (8 + 9,25 + 10,5) 3 = 9,25 mm 2) Filtrat II a) 9 + (8 x 0,05) = 9,4 mm b) 8 + (4 x 0,05) = 8,2 mm c) 8 + ( 7 x 0,05) = 8,35 mm d) Rata-rata : (9,4 + 8,2 + 8,35) 3 = 0,865 mm 3. Residu

a. Streptococcus mutans 1) Residu I a) 8 + (2,5 x 0,05) = 8,125 mm b) 10 + ( 7,5 x 0,05) = 10,375 mm c) 7 + (3,5 x 0,05) = 7,175 mm d) Rata-rata : (8,125 + 10,375 + 7,175) 3 = 8,56 mm 2) Residu II a) 8 + (7 x 0,05) = 8,35 mm b) 7 + (7,5 x 0,05) = 7,375 mm c) 7 + (6,5 x 0,05) = 7,325 mm d) Rata-rata : (8,35 + 7,375 + 7,325) 3 = 7,68 mm b. Escherichia coli 1) Residu I a) 5 + (2 x 0,05) = 5,1 mm b) 4 + (7 x 0,05) = 4,35 mm c) 4 + (9,5 x 0,05) = 4,475 mm d) Rata-rata : (5,1 + 4,35 + 4,475) 3 = 4,64 mm 2) Residu II a) 3 + (6 x 0,05) = 3,3 mm b) 4 + (3 x 0,05) = 4,15 mm c) 4 + (5 x 0,05) = 4,25 mm d) Rata-rata : (3,3 + 4,15 + 4,25) 3 = 3,9 mm IV.3 Gambar

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI UNHAS

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI UNHAS

Ket

: Isolasi sampel 10-3 (anaerob) Medium PDA

Ket

: Isolasi sampel 10-4 (anaerob) Medium PDA

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI UNHAS

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI UNHAS

Ket

: Isolasi sampel 10-5 (anaerob) Medium PDA

Ket

: Metode agar miring Medium PDA

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI UNHAS

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI UNHAS

Ket

: Peremajaan sampel Medium PDY

Ket

: Peremajaan sampel Medium produksi

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI UNHAS

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI UNHAS

Ket

: Pembenihan sampel Filtrat

Ket

: Pembenihan sampel Residu

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI UNHAS

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI UNHAS

Ket

: Uji aktivitas thd S. mutans Medium NA

Ket

: Uji aktivitas thd E. coli Medium NA

BAB V PEMBAHASAN Mikroba endofit dapat didefinisikan sebagai mikroorganisme yang hidup secara berkoloni pada jaringan internal tumbuhan tanpa

menyebabkan efek negatif bagi tumbuhan tersebut. Mikroorganisme endofit dapat berupa bakteri ataupun jamur dan dinilai menjadi sumber penting bagi zat berkhasiat. Banyak penelitian mengemukakan bahwa mikroorganisme endofit dapat menghasilkan zat metabolit sekunder yang sama dengan tumbuhan inangnya. Banyak peneliti percaya bahwa alasan mengapa mikroorganisme endofit dapat menghasilkan zat yang sama dengan tumbuhan inangnya adalah karena rekombinasi genetik yang terjadi antara mikroorganisme endofit dengan tumbuhan inangnya dalam waktu yang lama. (1:3) Keuntungan besar dari fakta tersebut tentunya berefek pada masalah ekonomi. Masalah penyediaan lahan, lamanya waktu menanam, standardisasi bahan baku dapat teratasi. Sebagaimana mikroorganisme lainnya, mikroorganisme endofit tidak memerlukan lahan yang luas untuk dapat menghasilkan zat kimia yang sama dengan tumbuhan inangnya, selain itu waktu panennya pun lebih cepat. Pertumbuhan mikroorganisme endofit yang dikontrol di dalam laboratorium memudahkan

standardisasinya. Efek selanjutnya adalah pada turunnya harga produk yang dihasilkan nantinya. Namun tentunya tidak semua mikroorganisme endofit dapat menghasilkan zat metabolit sekunder yang sama dengan

inangnya. Oleh karena itu proses penelitian lebih lanjut pun tetap diperlukan. (1:7) Mikroorganisme endofit memiliki potensi yang besar untuk digunakan sebagai sumber zat kimia bahan alam yang memiliki khasiat farmakologis maupun mengobati penyakit-penyakit infeksius. Meskipun jalan menuju pemanfaatannya secara optimal masih panjang namun secercah cahaya harapan tersebut masih ada. (2:6) Dalam percobaan yang dilakukan, dipergunakan sampel tanaman Tapak Liman (Elephantopus scaber), dan akan diisolasi fungi yang bersifat antimikroba. Dalam proses pengisolasian dan pengujian aktivitas mikroba endofitnya, dilakukan dalam empat tahap, yaitu : 1. Pengambilan dan pengolahan sampel 2. Isolasi dan pemurnian mikroorganisme endofit 3. Peremajaan dan pembenihan 4. Uji aktivitas antimikroba Pengambilan dan Pengolahan Sampel Pada tahap ini , sampel tanaman Tapak Liman( Elephantopus scaber) dibersihkan, dipotong-potong kecil, disterilkan, dan dibuat pengencerannya dari pengenceran 10 -1 sampai pengenceran 10-5.

Sampel di sterilisasi permukaan dengan Alkohol dan NaOCl dengan tujuan memperoleh mikroba yang betul-betul mikroba endofit dan tidak tercampur mikroba epifit yang berasal dari luar permukaan tumbuhan. Alasan penambahan alkohol dan natrium hipoklorit (NaOCl):

1. Penambahan alkohol pertama berguna sebagai surfaktan untuk melarutkan zat-zat yang bersifat hidrofobik pada permukaan daun 2. Penambahan permukaannya 3. Penambahan alkohol kedua berguna untuk menghilangkan sisa natrium hipoklorit dan untuk menghilangkan alkohol sisa dari untuk menghilangkan natrium hipoklorit digunakan aquadest atau air suling sehingga diperoleh biakan. Isolasi dan Pemurnian Mikroba Endofit Pada tahap ini, 1 mL dari 3 pengenceran terakhir dimasukkan kedalam cawan petri. Dan ditambahkan medium PDA dan setelah diinkubasi koloni terpilih yang memiliki zona hambat kembali natrium hipoklorit adalah sebagai sterilisasi

diinokulasikan pada medium PDA hingga diperoleh koloni yang terpisah kemudian yang diinokulasikan kembali medium PDA miring untuk diperoleh stok koloni murni. Peremajaan dan Pembenihan Pada tahap ini, koloni murni yang diperoleh diinokulasikan ke medium PDY (Potato Dextrose Yeast). Hal ini bertujuan untuk

meremajakan mikroba yang diperoleh.setelah itu, koloni yang tumbuh dalam medium PDY diinokulasikan ke dalam medium produksi kemudian diaerasi pada shaker selama tujuh hari. Hal ini bertujuan untuk

membenihkan mikroba sehingga jumlah sel meningkat atau bertambah banyak. Setelah diinkubasi, medium produksi tersebut diendapkan untuk

memisahkan antara filtrat ( hasil dari sentrifus yang berada di bagian atas karena memiliki berat jenis yang ringan dibandingkan residu yang merupakan sel mikroba dan filtrat ini merupakan hasil metabolit sekundernya ) dan endapan/residu. Tujuan diinokulasikan terlebih dahulu ke medium PDY kemudian ke medium produksi adalah untuk meningkatkan jumlah mikroorganisme yang didapat. Sementara tujuan dari medium PDY dan medium produksi diinkubasi sambil dishaker adalah untuk membantu mengeluarkan senyawa-senyawa yang kita butuhkan dari sampel dan untuk aerasi agar diperoleh O2 pada medium. Dimana medium produksi mengandung senyawa polimer rantai panjang, yang bertujuan untuk menghasilkan eksoenzim dari dalam sel mikroorganisme sehingga akan menjadi prekursor timbulya metabolit sekunder. Sedangkan pengendapan dilakukan dengan tujuan untuk

memisahkan filtrat (metabolitnya) dan sel mikroba sebagi residunya dan kemudiaan yang diambil adalah hasil filtratnya yang didalamnya terkandung meetabolit-metabolit sekunder. Pengujian Aktifitas Mikroba Pada tahap ini, digunakan biakan Streptococcus mutans dan Escherichia coli untuk pengujian aktifitas mikroba endofit yang diperoleh. Biakan ini dipilih karena merupakan bakteri yang banyak digunakan dalam pengujian daya antimikroba karena merupakan bakteri yang memiliki ketahanan lebih tinggi terhadap bahan kimia yang berupa bahan

antimikroba dibandingkan dengan bakteri lainnya. Pada Medium NA yang telah berisi biakan dimasukkan paper disk yang masing-masing telah diresapkan dengan 20 L endapan/residu. Kemudian setelah diinkubasi selama 1 x 24 jam pada suhu 370C, diamati daya hambat mikroba endofit terhadap biakan yang ditanam. Berdasarkan hasil percobaan yang dilakukan, ternyata diperoleh isolat fungi endofit dari sampel tanaman tapak liman ( Elephantopus scaber) berbentuk bulat yang berwarna putih keabu-abuan dengan permukaan yang melengkung dan hifa vegetatif yang bersepta dan tersusun teratur. Dan setelah dilakukan uji aktivitas ternyata isolat tersebut memiliki kemampuan untuk menghambat pertumbuhan dari

biakanStreptococcus mutans dan biakan Escherichia coli. Medium produksi berfungsi untuk membenihkan sel-sel mikroba yang sebelumnya telah diperbanyak pada medium PDY (Potato Dextrose Yeast). Selanjutnya, metabolit-metabolit yang ada di dalam sel

mikroorganisme dikeluarkan ke dalam medium produksi yang dibantu dengan adanya aerasi dengan pengocokan. Pemaksimalan produksi metabolit-metabolit sekunder dapat yang

dilakukan dengan pengembangan dan perbaikan faktor-faktor

mempengaruhi proses fermentasi. Pada prinsipnya kondisi lingkungan seperti pH, suhu, dan aerasi, kandungan nutrisi dalam medium juga sangat mempengaruhi pola pertumbuhan dan proses fermentasi.

Salah satu cara peningkatan produksi metabolit adalah dengan ultrasonifikasi, yaitu proses pemecahan dinding sel untuk mengeluarkan enzim di dalam sel supaya dihasilkan enzim yang lebih banyak. Proses pemecahan sel ini dilakukan dengan cara keras, yaitu menggunakan alat ultrasonikator dengan kuat getaran 16 rms selama 20 menit. Prinsip dari alat ultrasonikator adalah menggunakan getaran ultrasonifikasi untuk memecah sel. Selama proses ini, fungi hasil inkubasi harus diletakkan di dalam beker gelas yang berisi air dingin, hal ini dilakukan untuk menstabilkan suhu karena proses pemecahan sel dengan metode ini dapat menghasilkan panas (kalor) sehingga dikhawatirkan akan merusak enzim ekstraseluler yang dihasilkan. Senyawa dari sampel daun tanaman Tapak Liman ( Elephantopus scaber) yang berkhasiat sebagai antibakteri dan antiradang adalah sesquiterpenoid lactone, utamanya terhadap bakteri Staphylococcus aureus.

BAB VI PENUTUP VI.1 Kesimpulan Berdasarkan percobaan yang dilakukan dapat disimpulkan bahwa terdapat satu isolat fungi endofit dari tanaman Tapak Liman

(Elephantopus scaber) yang berbentuk bulat yang berwarna putih keabuabuan dengan permukaan yang melengkung dan hifa vegetatif yang bersepta. Isolat fungi tersebut mampu menghambat pertumbuhan bakteri Streptococcus mutans dan Escherichia coli. VI.2 Saran Diharapkan kepada asisten agar senantiasa mengawasi praktikan saat melakukan percobaan.

DAFTAR PUSTAKA 1. Khairani, G. 2010. Isolasi dan Uji Kemampuan Bakteri Endofit Penghasil Hormon IAA (Indole Acetic Acid) dari Akar Tanaman Jagung (Zea mays). Medan: Universitas Sumatera Utara. 2. Prihatiningtias, W. dan Mae Sri Hartati W. 2010. Prospek Mikroba Endofit sebagai Sumber Senyawa Bioaktif. Yogyakarta:

Universitas Gadjah Mada. 3. Haniah, M. 2008. Isolasi Jamur Endofit Dari Daun Sirih (Piper betle L.) Sebagai Antimikroba Terhadap Escherichia coli, Staphylococcus aureus, dan Candida albicans. Malang:

Universitas Islam Negeri Malang. 4. Dirjen POM. 1979. Farmakope Indonesia Edisi III. Jakarta:

Departemen Kesehatan RI. 5. Dirjen POM. 1995. Farmakope Indonesia Edisi IV. Jakarta:

Departemen Kesehatan RI. 6. http://www.plantamor.com 7. Irianto, Koes. 2007. Mikrobiologi, Menguak Dunia Mikroorganisme . Bandung: Yrama Widya.

LAMPIRAN I. Komposisi Medium 1. PDA (Potato Dextrose Agar) Kentang Dekstrosa Agar Aquadest 200 gram 10 20 gram gram 4. Medium produksi Glukosa Dekstrosa Pati terlarut 20 1 10 gram gram gram gram gram gram

ad 1000 mL

Tepung kedelai 25 NaCl Extract yeast Aquadest 2 1

2. PDY (Potato Dextrose Yeast) Kentang Dekstrosa Extract yeast Aquadest 200 gram 10 4 gram gram

ad 1000 mL

ad 1000 mL

3. NA (Nutrient Agar) Extract beef Pepton Agar Aquadest 3 5 15 gram gram gram

ad 1000 mL

II. Skema Kerja 1. Pengambilan dan pengolahan sampel

Dibersihkan, dipotong-potong kecil Disterilkan Dicelup dlm alkohol 70% selama 1 Disterilkan Dicelup dlm NaOCl selama 5 Ditimbang 10 gram Dilarutkan dlm 90 mL air steril

Disterilkan Dicelup dlm alkohol 70% selama 30 Disterilkan Dicelup dlm alkohol 70% selama 30 Dihaluskan

Dibuat pengenceran 10-1-105

2. Isolasi dan pemurnian mikroorganisme endofit

10-1 10-2 10-3 10-4 10-1

Diambil 1 mL dari masingmasing pengenceran 10 mL PDA

Diinkubasi selama 2-5 hari pada suhu kamar

Amati koloni dan zona hambat Diambil 1 ose koloni 10 mL PDA

Diinkubasi selama 3 hari pada suhu kamar Diambil 1 ose koloni terpisah

Agar miring PDA Diinkubasi selama 3 hari pada suhu kamar

Stock koloni murni

3. Peremajaan dan pembenihan

1 ose

Stock koloni murni

PDA

Diinkubasi selama 3 hari pada suhu kamar 1-2 ose 25 mL PDY Diinkubasi selama 3 hari pada suhu kamar (shaker) Pipet 1 mL 100 mL med. produksi Diinkubasi selama 7 hari pada suhu kamar (shaker) Sentrifuge Filtrat Residu

4. Pengujian aktivitas mikroba

Pipet 20 L Suspensi m.o uji 5 mL NA

Pencadang/paper disk + fermentat (filtrat/residu) 20 L

Diinkubasi selama 1 hari pada suhu 370C Amati dan Ukur zona hambatnya