UNIVERSIDAD DE SUCRE

Prueba de ELISA
INMUNOLOGIA

2012

MEDICINA IV

Prueba de ELISA

PRUEBA DE ELISA
KAREN CUELLO HERAZO1- ELYZABETH MONTERROZA CARRIAZO1 - WHITNEY SIERRA CHAVEZ 1- JUAN TUIRAN PALENCIA
1. Estudiante de medicina cuarto semestre de la universidad de sucre.

Martes 24 de Enero del 2012

ABSTRAT Immunoassay tests are based on an antigen-antibody reaction that takes place on a solid support (usually a plastic microplate) to which an antigen is adsorbed oranticuerpo.La test may develop in different ways but in all the final reaction is revealed by an enzyme that modifies a substrate that acquires color. It is very sensitive and specific tests. The ELISA is based on the use of antigens or antibodies labeled with an enzyme, so that the resulting conjugates are both immunological and enzymatic activity. Being one of the components (antigen or antibody) labeled with an enzyme and insolubilized on a support (immunosorbent) antigen-antibody reactionwill be immobilized and, therefore, be easily revealed by adding a specific substratethat the enzyme acting produce a color visible to the naked eye or quantified using a spectrophotometer or colorimeter. RESUMEN Las pruebas inmunoenzimticas se basan en una reaccin antgeno anticuerpo que tiene lugar sobre un soporte slido (normalmente una microplaca de plstico) a la que se ha adsorbido un antgeno o un anticuerpo.La prueba puede desarrollarse en diferentes modalidades pero en todas ellas la reaccin final se revela mediante un enzima que modifica un substrato que adquiere color. Se trata de pruebas muy sensibles y especfica. El ELISA se basa en el uso de antgenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunolgica como enzimtica. Al estar uno de los componentes (antgeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccin antgeno-anticuerpo quedar inmovilizada y, por tanto, ser fcilmente revelada mediante la adicin de un substrato especifico que al actuar la enzima producir un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotmetro o un colormetro. Palabras claves: anticuerpos, antgenos, ELISA, enzimas,espectrofotmetro, sustrato.

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INTRODUCCIN

El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) utiliza como sus siglas lo indican una enzima como marcador para mediar la formacin de complejos antgenoanticuerpo. Existen diversas variaciones al mtodo de ELISA para detectar y cuantificar ligandos de alto peso molecular (>30 000 daltons), el marcador enzimtico que se emplea en estos anlisis se conjuga con un ligando, que puede ser un antgeno, un anticuerpos especfico para el antgeno de inters o un anticuerpo para el anticuerpo primario. Casi todas las pruebas ELISA son ensayos en fase slida en los cuales se adsorbe un antgeno o un anticuerpo sobre un soporte slido. Algunos de los protocolos se basan en reacciones de enlace competitivo y otras en reacciones de enlace no competitivo, pero en todas las pruebas ELISA se requiere de un paso de separacin para eliminar el conjugado enzimtico libre antes de proceder a determinar la cantidad de conjugado enzimtico enlazado. Para lo cual se aade sustrato enzimtico y se mide la reaccin cataltica entre la enzima y el sustrato. Por sus caractersticas catalticas las enzimas son marcadores muy sensibles y verstiles. Una sola protena enzimtica puede transformar en algunos minutos gran nmero de molculas de sustrato en una cantidad igualmente abundante de producto final, produciendo un cambio de color amplificado y que se detecta con facilidad.En el mtodo ELISA de inhibicin el cambio de color se reduce, porque la actividad enzimtica se inhibe cuando el anticuerpo se enlaza al conjugado enzimtico. La prueba ELISA se basa en varias teorias: 1)El antgeno y anticuerpo pueden enlazarse a una superficie portadora insoluble y retener su reactividad inmunolgica; 2)las enzimas tienen actividad especfica alta y convierten una cantidad relativamente grande de sustrato en producto detectable, lo que permite detectar concentraciones muy bajas del ligando; 3) la actividad enzimtica o reactividad inmunolgica de los conjugados se preserva y permanece estable durante el anlisis y el almacenamiento; y 4) las enzimas no estn presentes en el lquido biolgico que se va a analizar. Los anticuerpos utilizados en el mtodo ELISA son de origen monoclonal o policlonal que se suministran como antisuero no fraccionado o fracciones de inmunoglobulina purificada, pueden ser solubles o estar inmviles en un soporte slido, son empleados como conjugados no marcados o enzimticos y por ultimo reaccionan con determinante antignico especfico de un antgeno o de un anticuerpo ligando-especfico (anticuerpo primario) segn el protocolo de anlisis. Los antgenos se purifican o se producen con tecnologa recombinante, y al igual que los anticuerpos se utilizan como conjugados marcados o enzimticos y son inmviles o

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solubles, dependiendo del protocolo de anlisis. Como se puede deducir los conjugados enzimticos son antgenos o anticuerpos unidos en forma covalente a la enzima de eleccin . As pues, el reactivo que se forma de la unin covalente entre enzima y antgeno o anticuerpo es el conjugado. Se conoce que es posible, tambin, marcar de forma no covalente anticuerpos o enzimas con biotina y agregar avidina. La avidina posee cuatro sitios de enlace para la biotina y no todos ellos participan en la interaccin con el anticuerpo marcado con biotina. Los sitios de enlace libres funcionan como aceptores para la enzima marcada con biotina. Este procedimiento se acorta utilizando anticuerpo marcado con biotina y avidina marcada con enzima. Las combinaciones de enzima y sustrato que se emplean en los diversos mtodos ELISA incluyen: 1) peroxidasa de rbano y su sustrato, perxido de hidrgeno que en presencia de cromgeno o-fenilendiamina produce un producto color amarillo-naranja medible; 2)galactosidasa beta y su sustrato o-nitrofenil-beta-Dgalactopiransido que se transforma en un producto nitrofenolado amarillento medible; o 3)fosfatas alcalina y su sustrato p-nitrofenilfosfato que tambin se transforma en nitrofenolato. Se utiliza cido sulfrico para inhibir la actividad enzimtica y estabilizar el producto final de reaccin que tiene color. Ensayos de enlace competitivo Los ELISA en fase slida, no competitivos se utilizan para determinar antgenos, haptenos o anticuerpos. Aqu el ligando no marcado compite con un ligando conjugado con enzima por un nmero limitado de sitios de enlace con el anticuerpo inmovilizado, y siguiendo el protocolo se retira el ligando no reactante, para as poder relacionar inversamente la cantidad de producto que se forma con la concentracin del ligando no marcado en la muestra problema. Ensayos de enlace no competitivo Son denominados tambin, tcnicas del emparedado y son los mtodos ms utilizados para determinar antgenos que por lo menos tienen dos determinantes antignicos, como fase slida pueden ser utilizadas perlas de poliestireno en donde se absorbe un exceso de anticuerpos generalmente monoclonales, y se sigue el protocolo de trabajo retirando tambin como en los casos anteriores el exceso de antgeno presente no unido. Tcnicas de ensayo inmunolgico por multiplicacin enzimtica

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La tcnicas de ensayo inmunolgico por multiplicacin enzimtica (EMIT) es un anlisis sin separacin en el cual se emplea una enzima conjugada al hapteno de inters como marcador en una reaccin enzima-sustrato como sistema de deteccin. Este tipo de anlisis lo describieron Rubenstein y colaboradores en 1972. Su principio es que se pueden determinar la cantidad de interaccin entre el hapteno y el anticuerpo utilizando un marcador enzimtico. Se basa en una reaccin de enlace competitivo entre el hapteno de la muestra y el hapteno conjugado con la enzima en un nmero limitado de sitios de enlace con el anticuerpo. El enlace del anticuerpo al hapteno conjugado con la enzima produce inhibicin de la actividad enzimtica. Esta inhibicin se debe a que el anticuerpo interfiere estricamente con el enlace del sustrato al sitio cataltico de la enzima o el enlace del anticuerpo transforma la configuracin de la enzima. La cantidad de hapteno en la muestra determina el nmero de sitios para anticuerpos disponibles para enlazar e inactivar el hapteno conjugado con la enzima. A medida que hay ms hapteno hay menos anticuerpos disponibles para inhibir la actividada enzimtica,por lo que el cambio de color se observa directamente proporcional a la cantidad de hapteno presente en la muestra.

Figura 1. (a) ELISA indirecto. (b). ELISA de competicin.

De acuerdo a lo anterior, este trabajo se realiz con el fin de obtener a partir de una muestra problema, el tipo de Ig G presente en sta, determinando a qu especie pertenece. Asi mismo se determin la dilucin en la cual se present el complejo de unin antgeno-anticuerpo en proporciones adecuadas, y finalmente se permiti conocer el fundamento y las fases en larealizacin de la tcnica de ELISA, y culesson las variantes de este mtodo.

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MATERIALES Y MTODOS

Figura 2. Materiales y equipo para la realizacin de ELISA.

La realizacin de la Prueba ELISA se inici con la utilizacin de una microplaca constituida por 96 pocillos, la cual se encontraba enumerada de forma horizontal (del 1 al 12) y de forma vertical, con letras del abecedario (desde la A hasta la H). Luego se procedi a adicionar 100 L del blanco reactivo a la columna 1 en los pozos de las filas A, C, E y G. Posteriormente se adicion en la columna 2 y 3, precisamente en los pozos de las filas A, C, E y G de cada columna, 200 L de la muestra problema, en los pozos de las filas B ,D ,F y H, de esas mismas columnas en vez de agregar esa cantidad de muestra problema, lo que se adicion fue 100 L de buffer carbonado; en el resto de las columnas desde la columna 4 hasta la 12, se agreg 100 L de diluyente (Buffer carbonado) en todas las filas, desde la A hasta la H. Se hicieron diluciones dobles a partir de la fila B. Se incub durante una hora a 37C. Se desech el sobrenadante y se lav 5 veces la placa con PBS-T (buffer fosfato salino 1X- Tween 20 al 0.1%). Luego se aadi 100 L de la solucin bloqueadora Albmina Srica bovina

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(BSA 0.5%) en cada pozo. Se incub 1 hora a temperatura ambiente. Se lav tres veces la placa con PBS-T de la misma forma que en el paso anterior y se almacen la placa a 4 C hasta su uso. Ms adelante se le adicion a los pozos de la fila A y B 100 L del conjugado anti- Dog Ig G a una dilucin 1/5000; a la fila C y D, un conjugado anti-Mouse Ig G a la misma dilucin de la anterior; a la fila E y F, se le agreg conjugado anti-Human Ig G y finalmente a la fila G y H, se le adicion conjugado antiChicken Ig G, para posteriormente incubarlo por 1 hora a temperatura ambiente. Nuevamente se descart y se lav la placa con PBS-T, para proceder a continuacin con la adicin de los sustratos ABTS y PNPP a los pozos. A los pozos de las filas A, B, G y H se les agreg fosfatasa alcalina (PNPP) y a los pozos restantes, de las filas C,D,E y F se les adicion peroxidasa (ATBS). Se incub en oscuridad durante 10 minutos la placa, para posteriormente adicionarle los 50 L de SDS 1% a cada pozo y asi detener la reaccin. Finalmente se realiz la lectura de la microplaca en el lector de ELISA a 410 nm.

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RESULTADOS Y ANALISS DE RESULTADOS

Figura 3. Placa de ELISA.

En la imagen se observa que los pozos donde se deposit conjugado anti IgG de humano se mostr una coloracin azul verdosa, debido a que se dio la unin del complejo antigeno anticuerpo de forma satisfactoria indicando que la muestra del suero problema efectivamente era de un humano. Conjugado anti IgG Dog
1/200 1,3885 1/400 0,69445 1/800 0,8365 1/1600 0,53265 1/3200 0,55 1/6400 0,481 1/12800 1,12825 1/25600 0,4513 1/51200 0,4198 1/102400 0,3336 1/204800 0,414 1/409600 0,5994

Conjugado de anti IgG de Dog

Densidad ptica 1.5 1 0.5 0

Concentracin del suero Figura 4. Conjugado de anti IgG de Dog.

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Conjugado anti IgG Mouse
1/200 0,3732 1/400 0,42815 1/800 0,38425 1/1600 0,2775 1/3200 0,3827 1/6400 0,5504 1/12800 0,2188 1/25600 0,1789 1/51200 0,20425 1/102400 0,1815 1/204800 0,2084 1/409600 0,1721

Conjugado anti IgG de Mouse

0.6 Densidad ptica 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 1/6400 1/12800 1/25600 1/51200 1/102400 1/204800 1/409600 Dilucin del suero Figura 5. Conjugado anti IgG de Mouse.

Conjugado anti IgG Human

1/200 1,494 1/400 0,9557 1/800 1,5695 1/1600 1,7063 1/3200 1,9861 1/6400 2,1803 1/12800 1,444 1/25600 2,1431 1/51200 1,5853 1/102400 2,286 1/204800 2,513 1/409600 2,8947

Conjugado del anti IgG Human

3.5 Densidad ptica 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0

Figura 6. Conjugado anti IgG Human.

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Conjugado anti IgG Chicken
1/200 0,1747 1/400 0,1387 1/800 0,1765 1/1600 0,2018 1/3200 0,2184 1/6400 0,1483 1/12800 0,1712 1/25600 0,1664 1/51200 0,1984 1/102400 0,1831 1/204800 0,1482 1/409600 0,1441

Conjugado anti IgG de Chicken

0.25 0.2 Densida ptica 0.15 0.1 0.05 0

Figura 6. Conjugado anti IgG Human.

Se observ que tras los estudios de fotocolorimetra, la absorbancia fue mayor en filas donde estaban los pozos de E y F (conjugado anti IgG-humano) y el mayor pico de absorbancia se observ en la dilucin 1/409600 con una absorbancia 2,8947 y la menor absorbancia se observ en la dilucin 1/400 con una absorbancia de 0,9557 (ver figura 6). En general, la mayor absorbancia se obtuvo en los pozos a los que se les adicion conjugado anti IgG Humano, y menores en los pozos donde se adicion conjugado anti IgG Dog, conjugado anti IgG Mouse y conjugado anti IgG Chicken. Los puntos donde se observ mayor absorbancia fue donde se present una mayor reaccin antgeno-anticuerpo, esto debido a que los anticuerpos adicionados a la muestra en esa dilucin encontraron antgenos suficientes a los cuales unirse, mientras que en los que se present una menor absorbancia fue debido a que los antcuerpos agregados no encontraron antgenos suficientes a los cuales unirse. De acuerdo a las grficas densidad ptica Vs. dilucin, se observa que en la de humano la curva se dirige en forma ascendente a medida que va disminuyendo la concentracin del suero problema en los pozos, contrario ocurre con la de pollo, perro y ratn, cuyas curvas decrecen, a medida que las diluciones aumentan. Lo que permite determinar una relacin inversamente proporcional.

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La fase slida debe ser de un tipo que permita un fcil manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unin de antgenos o anticuerpos sobre su superficie. Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350L son especialmente ventajosas para procesar un elevado nmero de muestras y una vez tapizadas, el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja temperatura. Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse estriles y con o sin tapa. Las tcnicas de ELISA se realizan mediante la adicin secuencial de todos los reactivos necesarios separados por etapas de lavado. Cada una de las operaciones puede realizarse manualmente con micropipetas o con equipamiento para la automatizacin de todas y cada una de las etapas. Esta completa automatizacin se justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran nmero de muestras y por necesitar una elevada repetibilidad de resultados. Elisa es una tcnica simple que se basa en la unin antgeno-anticuerpo. Para la bsqueda de autoanticuerpos se incuba el suero del paciente en un pocillo en cuyas paredes se encuentra adherido el antgeno especfico, luego se lava quedando en el pocillo slo los anticuerpos que se han unido al antgeno. Se usa luego un segundo anticuerpo dirigido contra la porcin Fc de la Ig (anti IgG, M, A o polivalentes) que se unira al primer anticuerpo (el del paciente). Finalmente, mediante un sustrato colorimtrico (se activa mediante enzimas que se encuentran en el segundo anticuerpo) se determina la cantidad de anticuerpo presente (a mayor intensidad del color, mayor concentracin srica del autoanticuerpo). Son los factores que afectan la medida de la actividad enzimtica (temperatura, pH, fuerza inica,composicin del tampn, reduccin del substrato,desnaturalizacin de la enzima y algunos casos,exposicin a la luz), tambin el desarrollo de las diluciones que son los que ms afectan al ensayo adems de la experiencia del analista, hoy en da, son el tiempo de reaccin, la temperatura y la exposicin a la luz, los cuales al realizar de manera manual aumentan el error. En sntesis, la prueba de ELISA se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular est presente en la muestra de sangre de un paciente. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un gran nmero de variables, tales como selecin de reactivo, temperatura, medicin de volumen y tiempo, que si no se ajustan correctamente puede afectar a los pasos sucesivos y al resultado de la prueba.

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BIBLIOGRAFIA

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