Analisis Clinicos

CURSO DE ANLISIS CLNICOS
Federacin de Sanidad de las CC.OO.CC. Pgina 1 de 299
CONTENIDO
TEMA 1. Gases sanguneos TEMA 2. Ionograma. Estudio analtico TEMA 3. Bioqumica cardiaca TEMA 4. Principales marcadores tumorales e implicacin prctica. TEMA 5. Lquidos biolgicos: citologa y bioqumica. TEMA 6. Anlisis cualitativo del sedimento urinario TEMA 7. Estudio de heces: digestin, sangre oculta y cuerpos reductores. TEMA 8. Hemograma. Recuento celular y frmula leucocitaria. TEMA 9. Coagulacin: realizacin tcnica y medicin del tiempo de protrombina, tiempo de tromboplastina parcial activada y fibringeno TEMA 10. Grupos sanguneos: ABO y RhO. Realizacin, tcnica e interpretacin. Tcnica de la antiglobulina humana (coombs directo): principio, realizacin tcnica e interpretacin. Estudio de la compatibilidad sangunea: prueba cruzada mayor, fases de lectura e interpretacin TEMA 11. Diagnstico serolgico. Principios, tcnicas y utilidad. TEMA 12. Estudios de paternidad por ADN. TEMA 13. Mtodos pticos para el diagnstico de las enfermedades infecciosas TEMA 14. Tcnicas de cultivo y aislamiento de patgenos TEMA 15. Mtodos de identificacin bacteriana TEMA 16. Antibiogramas. Tipos. TEMA 17. Controles de calidad internos y evaluacin externa de la calidad. TEMA 18. Recogida de la muestra. mtodos de identificacin. TEMA 19. Transporte de muestras. efectos del tiempo y temperatura durante el transporte. TEMA 20. El almacenamiento de muestras en el laboratorio. Sistemas de conservacin. TEMA 21. Preparacin de las muestras. Procesado y centrifugacin. TEMA 22. Aspectos de seguridad en el manejo de muestras biolgicas. TEMA 23. Gestin de residuos sanitarios. Clasificacin, transporte, eliminacin y tratamiento.
TEMA 1.- GASES SANGUNEOS
BASES FISIOLGICAS BSICAS

La funcin bsica del pulmn es la de intercambiar gases. La medicin de ellos en sangre arterial, es por lo tanto una buena gua para conocer el estado del funcionamiento pulmonar. En cada inspiracin, el oxgeno atmosfrico llega a los alvolos pulmonares, desde all, por difusin, llega a la sangre. Para transportar el oxgeno, se utiliza la hemoglobina, presente de forma abundante en los eritrocitos. Su existencia permite transportar de 30 a 100 veces ms oxgeno del que se pudiera transportar disuelto en sangre. Como la presin parcial del oxgeno en los alvolos, es mayor que en el resto del pulmn, por gradiente de presin, el oxgeno pasa desde los alvolos a los capilares sanguneos. Las arterias, transportan el oxgeno hasta las clulas donde la pO2 es menor que en la sangre arterial, producindose difusin en sentido a favor de las clulas. Con el dixido de carbono, ocurre justamente el proceso contrario, los gradientes de presin, lo van llevando desde las clulas hasta el alvolo, donde es expulsado en cada espiracin. Los procesos metablicos, por su parte producen grandes cantidades de cidos y de dixido de carbono; los voltiles son eliminados por el pulmn, pero los no voltiles son transportados por la sangre hasta el lugar de su eliminacin, y dada su naturaleza, son capaces de alterar el equilibrio cido-base y el pH sanguneo. La gasometra arterial permite medir el intercambio de O2 y de CO2 entre el pulmn y la sangre, y tambin el estado del equilibrio cido-base del organismo. La medicin del pH, pO2, y pCO2 en sangre arterial es imprescindible en el diagnstico y control de la insuficiencia respiratoria.
TRANSPORTE DE GASES POR LA SANGRE.

TRANSPORTE DE OXGENO
El 97% del oxgeno presente en sangre se transporta en combinacin con la hemoglobina, solo el 3% del oxgeno sanguneo se transporta en el plasma y en el citoplasma del eritrocito
La curva de disociacin de la oxihemoglobina en sangre presenta forma sigmoidal. Si la curva es modificada hacia la derecha, la hemoglobina pierde afinidad por el oxgeno y necesita una mayor pO2 para llegar a saturarse. Son factores que modifican la curva hacia la derecha: El aumento de la temperatura. El aumento de la pCO2. La disminucin del pH. La altura.
Si la curva se modifica hacia la izquierda, la afinidad de la hemoglobina por el oxgeno est aumentada y se llega a la saturacin con una menor pO2. La cantidad de oxgeno unido a la Hb, no solo depende de la pO2, sino de otros muchos factores entre los que destacan, la pCO2, el pH, los fosfatos, y la altura.
TRANSPORTE DE CO2
La sangre transporta dixido de carbono en las siguientes formas: 70 % en forma de anin bicarbonato. 7 % disuelto en plasma. 23 % en forma de carbamilo-hemoglobina unido a protenas plasmticas.
RECOGIDA DEL ESPCIMEN

Existen varios tipos de recipientes recomendados para la recogida de sangre arterial. Uno de los preferidos es la jeringa de vidrio, que debe ajustar perfectamente con su mbolo. Se introduce en la jeringa aproximadamente 1 ml de heparina, con la que se lubrifica el recipiente y posteriormente es expulsada. De esta forma queda el espacio muerto lleno de heparina. La aguja a utilizar puede ser del calibre 23 o superior, la jeringa de vidrio presenta los inconvenientes de su alto coste inicial, la facilidad de rotura y la necesidad de esterilizacin. Otros recipientes de recogida, cada vez ms utilizados son las jeringas de plstico desechables, y los tubos de vaco. Las jeringas de plstico desechable presentan sobre las de cristal las ventajas, de no ser frgiles, no necesitar esterilizacin, son baratas y presentan perfecto ajuste mbolo-cuerpo de la jeringa. En cuanto a los tubos de vaco existen distintas opiniones, para muchos autores (la mayora) pueden producir alteraciones en la presin parcial de los gases como consecuencia de la succin que ejercen. Otros autores los definen como recipientes satisfactorios.
La sangre venosa, ms fcil de obtener, puede dar valores correctos de pH aunque los dar incorrectos para la pCO2 alveolar y la saturacin de oxgeno arterial. La sangre capilar arterializada, como la obtenida del dedo se puede emplear para determinar pH y pCO2, pero no para la pO2 .
MANIPULACIN
Una vez, extrada la sangre, la jeringa es el recipiente definitivo. Para cerrarla hermticamente, se suele pinchar en un corcho. No se debe doblar la aguja, ya que presenta un riesgo innecesario y no se asegura el cierre hermtico, (se le deben eliminar las burbujas de aire, previamente). Debe ser colocada rpidamente en un recipiente con hielo o en agua helada, para evitar el consumo de oxgeno y la liberacin de dixido de carbono. No debe nunca transportarse a temperatura ambiente. La muestra de sangre arterial no necesita ninguna manipulacin, el estudio de gases se realiza en sangre completa, solo hay que realizar el anlisis en los primeros 15 minutos, pues una mayor conservacin podra modificar los gases disueltos. La determinacin es muy delicada y puede ser influida por: El nmero de leucocitos. La temperatura. El manejo inadecuado. El tiempo.
VALORES CRTICOS
OXGENO La cantidad de oxgeno presente en sangre, al igual que la de CO2, suele expresarse en unidades de presin parcial. La pO2 mide la cantidad de oxgeno que pasa del pulmn a la sangre y hay varios factores que pueden afectarla como: La correcta circulacin sangunea. La capacidad pulmonar. El estado del aparato respiratorio.
Los valores de referencia de pO2, estn influenciados, por lo tanto por todos estos factores, pero en general: Para jvenes adultos 80 mm Hg. es el lmite inferior.
Para individuos de edad avanzada 70 mm de Hg. es el lmite inferior.
Anoxia es el trmino general para la oxigenacin insuficiente, hipoxemia es la oxigenacin deficiente de la sangre y anoxemia u anoxihemia es la disminucin del oxgeno en sangre. Cualquier grado de hipoxemia puede ser compensado temporalmente por el organismo, pero la privacin total de oxgeno lleva a la muerte en pocos minutos al no poseer el organismo reserva alguna. Se han descrito casos de supervivencia con pO2 de solo 7.5 mm de Hg. DIXIDO DE CARBONO El CO2 es transportado desde los tejidos hasta los pulmones, donde es expulsado a travs de la respiracin. Con la pCO2 se refleja la eficacia de la excrecin pulmonar y la cantidad de CO2 generado por el metabolismo. Los valores normales de pCO2 en sangre arterial son de 32 a 45 mm de Hg. HIPOCAPNIA Es la disminucin de CO2 en sangre por debajo de los valores normales, puede ser consecuencia de: Fallo en el hgado. Shock sptico y hemorrgico. Lesin craneal. Septicemia.
HIPERCAPNIA Es el aumento de CO2 en sangre por encima de los valores normales, puede ser consecuencia de: Asma. Enfisema. Bronquitis crnica.
La relacin entre los gases presentes en el pulmn por ventilacin y los que existen en sangre se representa por V/Q y recibe el nombre de cociente de ventilacin-perfusin. La pO2 arterial disminuye, a la vez que la pCO2 aumenta, en los siguientes casos: Hipoventilacin. Desigualdad V/Q. Defectos de difusin.
ESTUDIO ANALTICO
Para medir la pCO2 se emplea el electrodo de Severinghaus. Se trata de un electrodo de pH rodeado de una solucin electroltica que est separada de la sangre por una membrana permeable al CO2. El material que compone la membrana suele ser caucho, tefln o silicona. El pH de la solucin depende de la pCO2 en equilibrio con la sangre. Para determinar la pO2 se emplea el mtodo del electrodo polarigrfico de Clark para el oxgeno. Consiste en una solucin electroltica de CLK que sumerge nodo y ctodo, separada de la sangre por una membrana. En este sistema se aplica un voltaje de polarizacin constante al nodo de platacloruro de plata, y al ctodo, de alambre de platino. El oxgeno se reduce en el electrodo y su reduccin, modifica el potencial elctrico, en forma proporcional a la velocidad de reduccin. Esta ltima, claro est, vara en funcin de la tensin de oxgeno presente en la sangre. Los electrodos del pO2 y del pCO2, deben ser calibrados previamente con un gas o un lquido de presin parcial de oxgeno conocida.
INTERPRETACIN
La gasometra arterial puede indicar ciertas anomalas, pero no su grado de anormalidad, ni tampoco son suficientes para un diagnstico etiolgico especfico. Por ejemplo, puede presentar los mismos valores de gases en sangre una persona con obstruccin crnica de las vas respiratorias que un cardiaco con edema pulmonar, un asmtico que un paciente con neumona.
EQUILIBRIO CIDO-BASE
Los cidos son productos que pueden ser ingeridos directamente en la dieta, o producidos endgenamente por el metabolismo (oxidacin de lpidos, oxidacin de aminocidos, etc.). Los cidos voltiles como el H2CO3, pueden ser eliminados por el pulmn en forma de CO2, pero los cidos no voltiles, no pueden ser eliminados por el pulmn, y deben excretarse a travs de la orina. El organismo, necesita por lo tanto, de mecanismos capaces de mantener constante el pH de los lquidos intra y extra celulares (de 7.35 a 7.45), sin que se altere por la presencia de esos cidos. Esto se consigue con la presencia de tampones (cidos dbiles en solucin con su base conjugada, capaces de mantener el pH en pequeos mrgenes de variacin).
El principal tampn extracelular es el bicarbonato, seguido de la hemoglobina, las protenas plasmticas y el fosfato, todos ellos actan de forma instantnea en la reduccin del pH pero el equilibrio cido - base final, lo realizan las clulas tubulares renales.
ACIDOSIS
Se produce cuando existe disminucin del pH sanguneo. Puede estar originado por: Acmulo de CO2 en el organismo acidosis respiratoria. Como consecuencia de una hipoventilacin. Los riones intentan compensarlo. Acmulo de cidos fijos, como el CO2 total y tampn, es una acidosis metablica. En este caso, la frecuencia respiratoria se aumenta para intentar compensarlo. Aparece en casos de shock, uremia, ingestin de txicos, etc.
ALCALOSIS
Ocurre cuando el pH sanguneo es superior a 7.45. Alcalosis respiratoria. Ocurre secundariamente a una hiperventilacin, como consecuencia del aumento de la concentracin de la pCO2 en sangre. Los riones intentan compensarla, disminuyendo la secrecin de cidos fijos, o la reabsorcin del CO3HAlcalosis metablica. Aparece cuando existen perdidas de cidos fijos o ganancia de bases. Se puede deber a vmitos prolongados, aspiracin nasogstrica, o ingestin excesiva de anticidos, aunque tambin aparece asociado al sndrome de Cushing, o el hiperaldosteronismo. Se intenta compensar disminuyendo la frecuencia respiratoria.
pH SANGUNEO
Podemos definir el pH como el logaritmo negativo de la concentracin de protones. Sus valores normales se ven afectados por la presencia de sustancias cidas o bsicas en sangre y es de suma importancia mantenerlo dentro de unos mrgenes concretos para evitar importantes modificaciones de todos los procesos metablicos, de ah la importancia de los tampones.
MTODOS ANALTICOS DE MEDIDA DEL pH

Para determinar el pH se utiliza sangre total o plasma, siendo adecuada para ello tanto la sangre arterial, como la venosa, o la capilar. Normalmente el pH venoso es 0.0003 unidades menor que el arterial. Cuando intentamos medir el pH en el laboratorio, es muy importante tener en cuenta: Almacenar las muestras en fro, pues a temperatura ambiente se agilizan los procesos metablicos como la gluclisis que producen cidos y disminuyen los valores del pH. Aadir a las muestras fluoruro sdico para evitar la actividad glucoltica de los leucocitos. Es preferible aadir plasma, pues la actividad anhidrasa carbnica de los eritrocitos, tambin modifica el pH. No utilizar oxalatos como anticoagulantes, pues aumentan el pH, ni tampoco citrato o EDTA, pues lo disminuyen, es preferible heparina.
MTODOS ELECTROMTRICOS
Para medir el pH se usa un sistema de electrodo de vidrio, el cual presenta dos partes: El electrodo de referencia o de calomelanos. El electrodo de vidrio.
El electrodo de referencia, mantiene un potencial constante, y el de vidrio desarrolla un potencial proporcional a la concentracin del in hidrgeno en la solucin problema. La sangre total o el plasma problema, se colocan a un lado de la membrana de cristal, y al otro se coloca una solucin estndar son concentracin de hidrogeniones conocida. La tcnica se basa en medir el potencial creado a travs de la membrana que separa ambas concentraciones con concentracin de hidrogeniones desigual.
MTODOS DE TITULACIN
Son poco utilizados. Para evaluar el equilibrio cido-base, hay que cuantificar no solo el pH, sino: La pCO2. La pCO2 total. El exceso de base.
Todo esto nos dar informacin para evaluar el equilibrio cido-base e identificar las causas de las posibles alteraciones.
TEMA 2. IONOGRAMA. ESTUDIO ANALTICO
CONCEPTO.
Los electrolitos son iones que existen normalmente en los lquidos corporales. Un ionograma es la determinacin y el registro de la concentracin de los diversos aniones y cationes de un lquido corporal. PRINCIPALES ELECTROLITOS. A nivel extracelular, los principales cationes son Na+ y K+, y los principales aniones Cl- y HCO3. Las concentraciones de estos electrolitos afectan al metabolismo, al estado de hidratacin, al pH intra y extra celular. Adems, la diferente concentracin de estos electrolitos en los lquidos intra y extra celulares, regula el funcionamiento del sistema nervioso y del tejido muscular. Las concentraciones de electrolitos se pueden expresar de varias formas : -miliequivalentes por litro = mEq/l. -milimoles por litro = mmol/l. *Recordar que 1 mEq equivale a 1mmol, solo en el caso de iones monovalentes. SODIO, POTASIO Y AGUA. El agua constituye aproximadamente el 60% del peso corporal de un adulto, repartida como sigue: Lquido o extracelular 20% (LEC). o vascular 5%. o intersticial 15%. Lquido intracelular 40% (LIC). Lquido transcelular 1-3%.
Lo que distingue a unos lquidos de otros, es simplemente la composicin de electrolitos.
% Na Cationes
Lquido extracelular 95-98% Na (142 mEq /l) >Ca
Lquido intracelular 2-5% K (161 mEq /l )>Mg>Ca
Aniones pH
Lquido extracelular HCO3 (27 mEq /l) Cl (101 mEq /l) 7.4
Lquido intracelular Aniones orgnicos (protenas) * 4 veces ms protenas. 7.0
El LIC y el LEC, a pesar de su diferente composicin electroltica, se muestran siempre en equilibrio osmtico, regulado con la bomba Na-K-ATPasa, que extrae 3Na+ del interior celular e introduce 2K+. Los dos constituyentes el LEC (plasma y lquido intersticial), presentan una composicin muy similar de electrolitos, son la presin hidrosttica y la onctica las que inducen al intercambio de Na+ y agua entre ambos espacios, que se lleva a cabo a nivel capilar. Entre LEC y el transcelular, tambin se intercambia agua y Na+. A nivel de tubo digestivo se intercambian de 6-8 l/da de agua cuando la [Na+] es menor que la del espacio transcelular. BIOQUMICA DEL SODIO Y DEL POTASIO. Los valores normales de sodio y potasio en sangre son: -Na+: 135 a 148 mmol/l. -K+: 3.8 a 5.5 mmol/l. El sodio se excreta en orina cuando sus valores en sangre superan los 110 mmol/l. Se excreta de 30 a 280 mmol/da. El potasio excretado en orina es de unos 25 -120 mmol/da. La funcin biolgica ms importante del sodio y el potasio, es la de regular la presin osmtica, y asegurar la integridad celular (Son cargas positivas que retienen aniones). Otra de las funciones del sodio y el potasio es la de mantener el balance de agua en el organismo. El sodio, por su parte, interviene en el equilibrio cido-base, y el potasio, por la suya, en la propagacin del impulso nervioso y por lo tanto, tambin en la actividad muscular.
TCNICAS UTILIZADAS PARA LA DETERMINACIN DE SODIO Y POTASIO, ESTUDIO ANALTICO. FOTOMETRA DE LLAMA. Existen diversas tcnicas para determinar el sodio y el potasio en sangre. La ms rpida y simple de ellas es la fotometra de llama. La fotometra de llama se basa en que al pulverizar una solucin de una susta ncia sobre una llama, los electrones de los tomos de dicha sustancia se excitan y pasan a niveles de energa superiores. Este exceso de energa es cedido al ambiente en forma de color en la llama. Tras colorear la llama, los tomos pasan a un estado menor de energa. La coloracin aparecida, corresponde a la emisin de rayos de una determinada longitud de onda, caracterstica de cada elemento. La intensidad del color depende directamente de la concentracin de la sustancia. En la llama se producen los siguientes colores caractersticos de determinados elementos: Litio........................color rojo. Sodio......................color amarillo. Potasio....................color violeta. Magnesio ...............color azul. En un fotmetro de llama se distinguen las siguientes partes: Atomizador: Es la parte encargada de disgregar la solucin problema en gotas pequeitas. Una vez disgregada, sus tomos pueden, ms fcilmente absorber la energa trmica de la llama, y excitarse. Llama: Se encarga de excitar los electrones de los tomos de la sustancia pulverizada. Monocromador: Es la parte encargada de seleccionar la longitud de onda. Detector; es el medidor de la energa radiante emitida. Normalmente se comparan soluciones de concentracin conocida del elemento (Na + o K+) con la muestra problema (suero). Se preparan una serie de soluciones patrn de sodio (2.5; 5.0; 7.5 y 10 microgramos /ml). Se preparan otra serie de soluciones patrn de potasio (5; 10;15 y 20 microgramos /ml). A esta serie hay que aadir Na+ en concentracin similar a la normal en el suero.
Con las soluciones patrn se obtienen resultados que hay que trasladar a una curva de calibracin (una para el sodio y otra para el potasio), colocando en abscisas las concentraciones en microgramos/ml y en ordenadas las intensidades de emisin ledas por el galvanmetro. Para la determinacin del Na+ se diluye el suero, normalmente 1:500, y para la del K+ 1:20. Se leen las intensidades de emisin, y se traslada a la curva respectiva obtenida anteriormente, para de esta forma determinar la concentracin en el suero problema. Los valores normales suelen ser: -Na+ en suero ------------------------------135-155 mEq /l. -K+ en suero-----------------------------------3.6-5.5 mEq /l. POTENCIOMETRA CON ELECTRODO ION -SELECTIVO. Otra tcnica utilizada para detectar Na+ y K + es la de la potenciometra con electrodo in selectivo : -Na+..............electrodo = membrana de i.inico de vidrio. -K+................electrodo = membrana transportadora neutra de valinomicina. Las interferencias que se presentan en la aplicacin de esta tcnica son; la hemlisis, el heparinato, y los anticoagulantes sdicos. IONES CLORURO. El principal anin extra celular es el cloruro. El exceso de Cl- es excretado con la orina. Su concentracin normal en suero es de 101 mEq /l, excretndose en orina, en condiciones normales, de 110 a 250 mmol /da. Los iones cloruro tienen una importante funcin en el mantenimiento del equilibrio cido - base. Los iones cloruro son ingeridos normalmente en la dieta y se reabsorben en el intestino. ESTUDIO ANALTICO. Se puede medir a travs de los siguientes mtodos: Titulacin mercurimtrica. Titulacin culombimtrica - amperomtrica. Colorimetra mediante Hg (SCN)2.
Uso de electrodos especficos de este in.
A) Titulacin mercurimtrica: En ella el cloruro y el Hg++ se unen formando HgCl2. El Hg++ en exceso se combina con la difenilcarbazona dando un complejo coloreado de color azulvioleta. Un ejemplo de tcnica mercurimtrica es la de Shales-Shales. 2CL+ (NO3)2Hg.........................(indicador).............Cl2Hg + 2NO3-
B) Titulacin columbimtrica: Requiere pequeos volmenes y es un mtodo muy preciso . Se utiliza en pediatra y tambin para determinar los niveles de cloruro en el sudor. C) Mtodo del tiocianato: Muestra (Cl-) + Hg (SNC)2........................cloruro mercrico + SNC- Libre. El tiocianato libre, reacciona con Fe 3+, formando complejos, cuya intensidad de color determina fotomtricamente, es proporcional a las cantidades de cloro existentes en la muestra.
TEMA 3.- BIOQUMICA CARDIACA
INTRODUCCIN.
Aproximadamente en el 20% de los casos de cardiopata isqumica, la primera manifestacin de la enfermedad es la muerte sbita. La experiencia obtenida en pases como EE.UU., Australia y Finlandia nos muestra que la Cardiopata I squmica es prevenible al menos en parte. En Espaa, la mortalidad por Cardiopata Isqumica es baja, pero en el perodo 1968-1977 prcticamente se duplic, pasando de la tasa bruta de 43 a la de 80 por cien mil, existiendo una tendencia al aumento de la tasa de mortalidad estandarizada en relacin con otros pases europeos. Estos datos nos hacen ver la importancia de la prevencin de la enfermedad as como del diagnstico temprano, para evitar desenlaces fatales. Entre las mltiples tcnicas diagnsticas con que contamos, destacaremos en este tema la valoracin bioqumica-enzimtica en la fase aguda de la isquemia miocrdica y en la evolucin de la enfermedad en los primeros das. Las enzimas catalizadoras orgnicas responsables de la mayora de las reacciones qumicas que suceden en el organismo, se encuentran en todos los tejidos. Algunas se han identificado en el plasma, al que llegan desde las clulas daadas o quizs incluso desde las clulas intactas. En la actualidad se han identificado en el suero ms de 50 enzimas. Los niveles de muchas enzimas han sido estudiados con extensin en una gran variedad de procesos. Se han aplicado algunas pruebas de enzimas sricas con tanta amplitud en algunos problemas clnicos, que se consideran procedimientos habituales en el laboratorio. Otras, aunque muestran claramente ser un reflejo de diversas enfermedades, se llevan a cabo en relativamente pocos laboratorios clnicos, porque la prueba en s es tcnicamente diferente o porque la informacin facilitada se considera que ayuda muy poco. Otras pruebas tienen un inters de investigacin ms que clnico. El empleo de las enzimas sricas como ayuda diagnstica ha sido muy emprico, pero los valores observados en circunstancias clnicas y experimentales permiten un anlisis especulativo de los factores que controlan los niveles de las enzimas sricas en sujetos normales y enfermos. Los niveles sricos de una enzima particular crecen en las enfermedades que conducen a un aumento de su liberacin por el tejido, por un aumento de la cantidad disponible para su liberacin o por una disminucin de esta cantidad. Un aumento de la cantidad liberada es sin duda responsable de los elevados niveles sricos de las enzimas que producen necrosis en las enfermedades hepticas, pancreticas y miocrdicas. El
tipo de anormalidad de los valores de las enzimas sricas resultantes depende del contenido enzimtico normal del tejido afectado y de la extensin y tipo de la necrosis. La seleccin de las pruebas enzimticas para su uso clnico ha dependido de circunstancias histricas, de la experiencia ganada en la correlacin de los valores con otras determinaciones patolgicas y la facilidad tcnica de realizar cada procedimiento respectivo. MARCADORES BIOQUMICOS: VALOR DIAGNSTICO Y EVOLUTIVO EN EL PROCESO ISQUMICO. En el infarto del miocardio hay unos cambios hemticos inespecficos que traducen la inflamacin y necrosis, como son una discreta leucocitosis con desviacin izquierda, que aparece en las primeras horas y dura una semana, y un aumento de la VSG, que tiene lugar a partir del cuarto o quinto da y dura varias semanas. Pero el mximo valor diagnstico lo representan las elevaciones de ciertas enzimas (contenido fundamental de nuestro tema), liberadas en grandes cantidades a partir del tejido cardiaco necrosado. Difiere la rapidez con la cual es liberada cada enzima y su esquema temporal de liberacin tiene cierta importancia diagnstica. Transaminasa glutmico oxalactica (GOT): comienza a elevarse precozmente, a las doce horas, alcanza su mximo al segundo da y se normaliza al cuarto o quinto da. Puede elevarse hasta 10 veces su valor normal (8-20 U/L). La lista de afecciones distintas al infarto del miocardio que pueden elevar la GOT comprende: Insuficiencia ventricular derecha con congestin heptica La administracin de salicilatos, opiceos o anticoagulantes Enfermedad muscular primaria, incluyendo distrofia muscular y traumatismo quirrgico Operaciones quirrgicas Pancreatitis aguda Dao extenso del sistema nervioso central Toxemia del embarazo Crisis hemoltica Machacamiento o quemaduras Infarto del rin, bazo o intestino Hipotiroidismo.
Est presente, adems, en otros tejidos: hgado, msculo, rin, cerebro, por lo que enfermedades de estos rganos pueden producir aumentos sricos de la enzima.
La experiencia confirma que las determinaciones de CPK y sus isoenzimas y de LDH y sus isoenzimas son indicadores ms fiables para el diagnstico de laboratorio de necrosis miocrdica. En pacientes con criterios clnicos de insuficiencia coronaria ms que de infarto de miocardio pueden darse cifras elevadas de GOT en suero. No est claro si esto representa una necrosis miocrdica que no ha podido reconocerse mediante otros mtodos (bastante improbable) o una liberacin de la enzima al suero, incluso sin una necrosis clara del miocardio. Lactodehidrogenasa (LDH): esta enzima cataliza la oxidacin reversible de lactato a piruvato. Est ampliamente distribuida en tejidos de mamferos y es ms abundante en el miocardio, rin, hgado y msculo. Se han aplicado para su anlisis mtodos espectrofotomtricos y colorimtricos. Los niveles sricos elevados de LDH se observan en muchas circunstancias. Los valores ms altos (2 a 40 veces la normalidad) se ven en casos de anemia megaloblstica, en carcinomatosis extensa, en el shock grave y en la anoxia. Subidas moderadas (2 a 4 veces la normalidad) ocurren en enfermos de infarto de miocardio, infarto pulmonar, leucemia granuloctica, anemia hemoltica, mononucleosis infecciosa y en pacientes con distrofia muscular. Se ven ligeras elevaciones en casos de hepatitis, ictericias obstructivas o cirrosis. Son bastantes caractersticos los patrones de niveles sricos elevados de LDH en los casos de infarto de miocardio. En general, aumenta ms tarde, a las veinticuatro horas; alcanza el pico a los tres o cuatro das y persiste elevada cuando el resto de las enzimas se han normalizado; vuelve el nivel basal a los siete o diez das, y la elevacin mxima puede ser dos o tres veces los valores normales (45-90 U/L). Es menos especfica, pues se encuentra prcticamente en todos los tejidos del organismo. Por ello tiene ms valor determinar sus cinco isoenzimas, que aunque presentes en toda las economa, lo estn a concentraciones diferentes en los diversos tejidos. Mediante electroforesis se pueden separar cinco isoenzimas comunes a la LDH. Cada una de estas isoenzimas se distingue de las otras mediante procedimientos serolgicos, electroforticos y otros varios de orden qumico. Las isoenzimas de la LDH se designan en la prctica de acuerdo con su movilidad electrofortica. Cada isoenzima es un tetrmero constituido por cuatro subunidades, cada una con un peso molecular de 34.000. Existen dos tipos de estas subunidades, designados respectivamente H y M, H para la cadena de pptidos del corazn y M para la cadena del msculo estriado. Los diversos tejidos difieren en cuanto a sus esquemas especficos de isoenzimas, la isoenzima que se desplaza con mayor rapidez y que es ms abundante
en el corazn, ha sido designada LDH1, en cambio, en el hgado y en el msculo estriado predominan isoenzimas de desplazamiento ms lento. La LDH1 es relativamente especfica del corazn, por lo que su elevacin y, sobre todo, la relacin LDH1/LDH2 cuando es superior a uno (LDH invertida) es muy sugerente de infarto de miocardio, an cuando la LDH total no haya aumentado. En casos de infarto de miocardio, la LDH1 aumenta antes que la LDH total, y puede incluso aumentar sin que se note todava ningn cambio de LDH total. Por tanto, una elevacin de la LDH1 constituye un ndice del infarto de miocardio ms sensible que la LDH total. Cabe mencionar una sensibilidad superior a 95%. Es difcil la cuantificacin de las isoenzimas, y las tcnicas son demasiado incmodas para su empleo en el estudio de numerosos sueros. Sin embargo, la determinacin de LDH1, la isoenzima miocrdica, puede realizarse mediante tcnicas sencillas como el anlisis de la actividad total de LDH. Creatinfosfoquinasa (CPK): es la enzima que ms precozmente se eleva en el infarto de miocardio, ya que hay niveles altos a las cuatro o seis horas, alcanza el pico mximo a las veinticuatro-treinta horas y se normaliza al tercer o cuarto da. Puede elevarse hasta cuarenta veces su valor normal (varn 12-70 U/L; hembra 10-55 U/L). Es la ms especfica, pero se encuentra tambin en el tejido muscular y en el cerebro y adems se eleva por inyecciones intramusculares, cardioversin, ciruga, etc. Reviste una importancia especial, en la clnica, el hecho de que una inyeccin intramuscular puede ir seguida de una elevacin al doble o al triple de la cifra sangunea de CK. Esta particularidad puede significar diagnsticos errneos de infarto del miocardio en pacientes que recibieron inyecciones intramusculares de algn analgsico para combatir un dolor torcico que no era de origen cardiaco. Otras posibles causas de aumento de la CK pueden ser: la miopata que acompaa al alcoholismo crnico. el tratamiento con clofibrato. el cateterismo cardiaco. el hipotiroidismo. las embolias cerebrales. el ejercicio fsico.
La CPK tiene tres isoenzimas, cada una constituida por dos subunidades: M (msculo) o B (cerebro); el cerebro contiene BB; el msculo esqueltico MM, y el miocardio MM y MB. Pues bien, la isoenzima MB (CPK-MB) resulta especfica del msculo cardiaco; su curva de elevacin es similar a la de la CPK total, pero algo ms precoz.
La presencia de CPK-MB en los sueros indica una lesin de miocardio y se observa en todos los pacientes durante el perodo de 48 horas despus de un infarto agudo de miocardio. Sin embargo, tambin se detecta en menor grado en individuos con angina e insuficiencia coronaria graves, pero sin indicaciones de infarto. En vista de que la elevacin de la cifra srica de CPK dura poco tiempo, quiz pase inadvertida si las primeras muestras de sangre se recogen despus de transcurridas 72 horas. La actividad de la CPK-MB nunca supera el 40% de la actividad srica total de la CPK y el resto es CPK-MM. Las determinaciones de la isoenzima de la CPK realizadas despus del da 4 slo revelarn actividad de la CPK-MM, y no podr establecerse su origen en el corazn o msculo. Con las tcnicas actuales de reperfusin precoz, utilizando la administracin intravenosa de sustancias fibrinolticas, para romper la porcin fresca del trombo arterial, los niveles de CPK suben espectacularmente, alcanzando hasta mil veces su valor normal. Esto ltimo no es indicativo de gran necrosis miocrdica, sino consecuencia de la destruccin, al menos parcial del trombo intraarterial. Se sabe desde hace mucho que el tamao del infarto tiene cierta relacin con la cantidad de enzimas liberadas. Se ha demostrado que puede conocerse la masa de msculo cardiaco infartado a partir del anlisis de la curva de concentracintiempo de la enzima en cuestin, siempre y cuando se conociera la cintica de liberacin, desdoblamiento, eliminacin, etc. de dicha enzima. Si se analiza una curva de tiempo de la fraccin MB de la CK puede calcularse el tamao del infarto en trminos de gramos.
En ms del 95% de pacientes con un infarto del miocardio comprobado existen elevaciones caractersticas en la concentracin srica de las enzimas. Existen otros indicadores bioqumicos de infarto, como el incremento de mioglobina en suero, disminucin del Zinc plasmtico, etc., no tienen en la actualidad utilizacin en la clnica.
TEMA 4. PRINCIPALES MARCADORES TUMORALES E IMPLICACIN PRCTICA.
INTRODUCCIN
Con la deteccin y tratamiento precoces del cncer, responsable actualmente de una gran mortalidad en la poblacin mundial, se espera se produzca una marcada disminucin en la morbilidad y mortalidad de esta enfermedad. La deteccin precoz mediante tcnicas citolgicas han dado resultados muy positivos en la deteccin de ciertos tumores (Ej.: cncer cervical) aunque no detectan por s mismas gran cantidad de tumores. Es por ello que la investigacin se ha centrado en la investigacin de productos tumorales en sangre, orina y otros lquidos corporales. As, reciben el nombre de MARCADORES TUMORALES a aquellas sustancias presentes en sangre, orina u otros lquidos corporales (fundamentalmente se investiga en sangre) procedentes de la clula neoplsica, ya que por sus especiales caractersticas sta sintetiza compuestos que se distinguen de los aportados por una clula normal, bien en su estructura, bien en su concentracin en los lquidos biolgicos. TUMOR, CNCER Y CLULAS TUMORALES Llamamos tumor a la neoformacin o nuevo crecimiento de tejidos en que la multiplicacin de las clulas no est totalmente controlada por los sistemas reguladores del organismo. Denominamos cncer a un tumor maligno en general. Las caractersticas bsicas de la malignidad es una anormalidad de las clulas trasmitidas a las clulas hijas, que se manifiesta por la reduccin del control del crecimiento y la funcin celular, conduciendo a una serie de fenmenos adversos en el husped a travs de un crecimiento masivo, invasin de tejidos vecinos y metstasis. La caracterstica principal de la clula tumoral con respecto a las clulas normales es fundamentalmente la prdida de control en los procesos de crecimiento y divisin. Al llevarse estos de forma desorganizada, conduce a la formacin de una masa tumoral que invade los tejidos circundantes rompiendo las membranas lmites de las distintas estructuras. La diseminacin y colonizacin de algunas de estas clulas tumorales puede dar lugar a la aparicin de metstasis o ms focos morbosos secundarios en regiones no contiguas del punto de evolucin del foco primitivo.
ALTERACIONES DE LAS CLULAS TUMORALES En las clulas tumorales o neoplsicas se conocen anomalas tanto estructurales como genticas. DE LA MEMBRANA En las membranas celulares se detectan modificaciones en las glicoprotenas transmembrana y en los enlaces entre los distintos componentes moleculares que ocasionan un crecimiento desordenado del tejido, con la formacin de la masa tumoral. Igualmente aparecen modificaciones en los receptores de membrana que conducen en algunos casos a facilitar el anclaje de clulas tumorales en otros teji dos. Aparecen adems protenas anmalas que dotan a las clulas neoplsicas de una gran respuesta a factores que determinan su crecimiento y multiplicacin. Cabe resaltar la deteccin de la llamada protena P que dota a las clulas de gran resistencia a las drogas neoplsicas utilizadas en quimioterapia. DEL NCLEO Respecto a las anomalas que afectan al ncleo, las ms fcilmente detectables afectan al tamao nuclear, lo que determina un ndice mittico mayor que el correspondiente a una clula normal. GENTICAS Las alteraciones ms importantes afectan al material gentico. Existen una serie de genes normales llamados prooncogenes que por accin de determinados agentes se transforman en oncogenes, lo que se traduce en la mayora de los casos en la alteracin en la composicin de las protenas que codifican o alteraciones en la cantidad induciendo a la mitosis acelerada de las clulas. Por este mismo mecanismo puede adems desaparecer genes protectores, malignizndose igualmente la clula afectada. DEL CICLO CELULAR En un ciclo celular normal la mayor parte del tiempo lo dedican las clulas, una vez diferenciadas, a sintetizar productos especficos de cada tipo celular. Una vez dividida la clula puede madurar y diferenciarse para continuar de nuevo el ciclo celular. Dicho ciclo celular est regulado por una serie de protenas sintetizadas por la propia clula.
Cuando este ciclo se altera, las clulas no maduran, no se diferencian, por lo que no tienen capacidad de sntesis y se dividen a gran velocidad constituyendo rpidamente la masa tumoral. TIPOS DE MARCADORES TUMORALES ESPECFICOS E INESPECFICOS Las sustancias marcadores se pueden clasificar como especficos de un tumor o asociados a este. Los antgenos especficos del tumor se piensan que son resultado directo de la oncognesis; pueden considerarse como neoantgenos especficos de las clulas tumorales. Los antgenos inespecficos estn asociados al tumor, y comprenden diversas enzimas y protenas que aparecen en sangre y son mediadas por el propio tumor o su influencia en tejidos no afectados. EN FUNCIN DE SU UTILIDAD CLNICA Podemos clasificar los marcadores tumorales en funcin de su utilidad clnica en: marcadores diagnsticos, teraputicos, de evolucin y genmicos. La determinacin de marcadores tumorales en sangre nos proporciona una gran informacin, aunque el conocimiento de la tasa de marcadores tumorales en la propia masa tumoral nos va a proporcionar tambin una valiosa informacin. Si estos son negativos, nos indica que nos encontramos frente a un tumor de clulas no diferenciadas incapaz de sintetizar estos marcadores, y por lo tanto de gran agresividad. Por el contrario, si los marcadores son positivos, nos indica que las clulas tienen la diferenciacin suficiente para sintetizar, y por lo tanto de menor agresividad que en el caso anterior. As, este tipo de determinacin nos ayuda a diagnosticar y cuantificar la mayor o menor agresividad de las clulas tumorales, se denominan por tanto marcadores diagnsticos. La determinacin basal y la cuantificacin peridica de los marcadores tumorales es indicativa de la sensibilidad de la clula a una determinada terapia (marcadores teraputicos) e indicativa igualmente de la evolucin de la enfermedad y de la utilidad de la terapia elegida (marcadores de evolucin ). Existen adems marcadores genmicos que permiten conocer la incidencia de las alteraciones de los prooncogenes al inicio de la enfermedad. Habitualmente se trata de protenas codificadas por los genes alterados.
CARACTERSTICAS DE LOS MARCADORES TUMORALES Para que un marcador tumoral sea considerado como tal debe reunir una serie de caractersticas como son: 1. Deben ser producidas por las clulas tumorales o bien modificar los valores normales de un individuo sano. En el primer caso, entre los marcadores producidos por una clula neoplsica tenemos por ejemplo los antgenos oncofetales, o la gonadotropina corinica en varones o mujeres no embarazadas. En el segundo caso, hay que fijar previamente los llamados valores de corte o valores a partir de los cuales supondremos probable la existencia de una patologa. 2. Deben detectarse y cuantificarse fcilmente. 3. Deben ser de alta sensibilidad y su tasa ser reflejo del tamao tumoral. 4. Deben ser especficos. 5. Sus niveles en individuos sanos deben ser muy inferiores a los que se encuentran en individuos enfermos. CUALIDADES DE LOS MARCADORES TUMORALES. Como comentamos anteriormente, un marcador debe ser sensible y especfico. Podemos definir los conceptos de sensibilidad y especificidad de la siguiente forma: Sensibilidad: Es la probabilidad de encontrar un valor positivo en una poblacin de enfermos. Especificidad: Es la probabilidad de hallar un valor negativo en una poblacin de sanos.
Si suponemos dos muestras de poblacin, una de individuos sanos y otra de individuos enfermos, consideraremos un valor verdaderamente positivo (VP) a aquel superior al lmite de normalidad en un individuo enfermo; un valor verdaderamente negativo (VN) al valor inferior al lmite normal en un individuo sano; un valor falsamente positivo (FP) a un valor superior al lmite de normalidad en un individuo sano y un valor falsamente negativo (FN) a un valor inferior al lmite de normalidad en un individuo enfermo. En base a esto: Sensibilidad = (VP/(FP+FN)) x 100 Especificidad = (VN/(FP+VN)) x 100 Es por ello que se deben asociar marcadores de gran sensibilidad con otros de gran especificidad. As, si tenemos inters en conocer que no se padece una determinada enfermedad, buscaremos una especificidad alta, donde los falsos positivos tiendan a ceFederacin de Sanidad de las CC.OO.CC. Pgina 24 de 299
ro; mientras que si queremos tratar una patologa de gran agresividad debemos buscar tcnicas de gran sensibilidad, donde los falsos negativos tiendan a cero, Podemos definir tambin respecto a los marcadores tumorales el Valor Predictivo, que es la probabilidad de que un sujeto investigado padezca o no la enfermedad. As, el valor predictivo positivo es la probabilidad de que el sujeto padezca la enfermedad. VPP = (VP/(VP+FP)) x 100 El valor predictivo negativo, por tanto, ser la probabilidad de que el individuo no padezca la enfermedad. VPN = (VN/)VN+FN)) x 100 Un marcador se puede emplear como prueba de screening en una poblacin para detectar un determinado cncer cuando el VPP sea alto. DETERMINACIN DE MARCADORES NIVELES DE MARCADORES Los factores que determinan los niveles de marcadores en sangre son: 1. ndice tumoral de sntesis: Es la relacin entre el nmero de clulas productoras del marcador utilizado en el seguimiento y el nmero total de clulas constitutivas de la masa tumoral. 2. Localizacin de la masa tumoral y mecanismo de liberacin que permite el paso del marcador a la circulacin general. 3. Vida media del marcador en la propia masa tumoral y en sangre perifrica. 4. Factores analticos relacionados con la tcnica elegida para su determinacin. TOMA DE MUESTRAS La obtencin de la muestra es de gran importancia ya que los niveles de marcadores se pueden ver afectados por: 1. La exploracin del paciente previa a la obtencin de la muestra puede provocar un aumento en la tasa de marcadores, especialmente en el caso de enfermedades prostticas. 2. Los agentes quimioteraputicos pueden interferir en la determinacin del marcador, por lo que debe esperarse un periodo determinado que va a depender de la vida media de la droga utilizada.
3. La necrosis celular que sigue a un tratamiento radiolgico o a la quimioterapia ocasiona la liberacin de todos los componentes celulares, con la consecuente elevacin de los niveles en sangre. DETERMINACIN DE MARCADORES Es importante antes de iniciar cualquier tratamiento o manipulacin determinar los valores basales, para poder seguir la evolucin y eficacia del tratamiento elegido. Por otro lado, los marcadores inespecficos no tienen unas tasas o valores establecidos en general, por lo que el propio paciente es su propio control, y el conocimiento de los valores basales ayudar en la interpretacin de las oscilaciones que tengan dichos valores. La historia y patologa de cada paciente, as como la medicacin que se prescriba marcar el nmero y frecuencia de las determinaciones posteriores para el seguimiento del tratamiento y evolucin de la enfermedad. La interpretacin de las cifras de los marcadores ha de hacerse con cautela, pues estn sujetos a muchas variables. La presencia de un valor elevado inesperado y no explicable por una posible manipulacin, medicacin, infeccin, etc., deber ser cuidadosamente comprobado repitiendo la determinacin e incluso la extraccin. Esto es importante ya que este valor elevado nos puede indicar recidivas mucho antes que estas puedan ser detectadas por otros medios. MTODOS DE DETERMINACIN Los marcadores tumorales pueden ser detectados tanto en tejidos tumorales como en lquidos biolgicos. La deteccin en tejidos tumorales se realiza mediante tcnicas inmunocitoqumicas. La determinacin de marcadores tumorales en lquidos biolgicos se lleva a cabo mediante tcnicas inmunoqumicas, que incluyen entre otras el radioinmunoanlisis (RIA) y tcnicas de enzimoinmunoanlisis (ELISA). Son tcnicas basadas en reacciones antgeno-anticuerpo, por lo que son de gran sensibilidad, aunque van a influir en la tcnica la afinidad y especificidad del anticuerpo utilizado.
ASOCIACIN DE MARCADORES Los marcadores tumorales se suelen asociar en el estudio de una determinada enfermedad, ya que utilizados asociados aumenta la sensibilidad. Se recomienda asociar al menos dos marcadores, un marcador de celularidad, habitualmente de poca especificidad (CEA), de alteracin de la respuesta inm unitaria (Neopterina) o de proliferacin celular (TPS) con otro de mayor especificidad dentro de la patologa estudiada, habitualmente de menor sensibilidad que los anteriores. En distintas neoplasias se emplean asociaciones de varios marcadores para el diagnstico, seguimiento y deteccin precoz de recidivas. Ponemos varios ejemplos: 1. Cncer de mama: es la primera causa de mortalidad por cncer en las mjeres. Se emplea como marcadores tumorales para el diagnstico y seguimiento el CEA y el Antgeno Ca 153, como marcadores de pronstico y teraputicos se utilizan los receptores de estrgeno y progesterona. 2. Cncer de prstata: Es la segunda causa de mortalidad por cncer en el varn de edad comprendida entre los 50 y 60 aos. En el diagnstico y seguimiento se utilizan el PSA y la fosfatasa cida prosttica (PAP). 3. Cncer de hgado: Como marcador se emplea la alfafetoprotena, de utilidad en el diagnstico y en el control, e incluso con valor pronstico para enfermos con hepatocarcinoma. En el estudio de las metstasis se emplea el antgeno carcinoembrionario, sobre todo en el seguimiento del enfermo tratado. ESTRUCTURA DE LOS MARCADORES Los marcadores pertenecen a grupos con estructuras qumicas muy variadas. Los antgenos oncofecales se detectan en sangre fetal y prcticamente despus del parto se reducen a niveles no detectables. A medida que un individuo sano crece es posible que aparezcan en suero en concentraciones bajas. Dos de los antgenos oncofecales ms conocidos son la alfafetoprotena (AFP) y el antgeno carcinoembrionario (CEA). Entre las protenas que tienen utilidad de diagnstico para la evaluacin de pacientes con cncer se encuentran aquellas asociadas al embarazo, tales como la gonadotropina corinica humana. Las enzimas son marcadores tiles de procesos malignos.
Muchas hormonas son producidas por los tumores: cuando el tejido no endocrino es responsable de la produccin de hormonas se habla de produccin hormonal ectpica. Los marcadores celulares, tales como los antgenos de las clulas T o B son tiles, as como los receptores de estrgenos y progesterona. En la tabla 1 aparecen los marcadores tumorales asociados a las patologas en que aparecen. MARCADORES TUMORALES MS UTILIZADOS
ANTGENO CARCINOEMBRIONARIO (CEA)
Se trata de una glicoprotena sintetizada en el tejido fetal, formada por varios componentes que han de tenerse en cuenta, ya que dependiendo del anticuerpo empleado en la tcnica de determinacin, se reconocer uno o varios componentes, lo que se reflejar en la tasa obtenida. En pacientes adultos con diversos tipos de cncer pueden detectar niveles elevados en las clulas y en plasma, aunque no es especfico de ningn proceso maligno ni de tipo tumoral. El CEA puede aparecer aumentado es especial en procesos malignos del aparato digestivo, pncreas, pulmn y mama. Su mayor aplicacin es el diagnstico y seguimiento postoperatorio del cncer colo-rectal y el estudio de las metstasis del cncer de hgado.
ALFAFETOPROTEINA (AFP)
Es una glicoprotena presente en el suero de individuos sanos a bajas concentraciones. Valores aumentados se observan en hepatomas y en tumores germinales. Pequeos incrementos de AFP pueden detectarse en relacin con tumores del aparato digestivo o del pulmn.
Tabla 1: Marcadores tumorales y tumores asociados
TIPO MARCADOR Antgenos on- CEA cofetales AFP
TUMOR ASOCIADO Mama, colon Hgado, tumores germinales
TIPO MARCADOR Glicoprotenas Ca 153 Ca 549 Ca 125 Protenas Casena Ferritina Osteocalcina Enzimas Creatincinasa (BB) Fosfatasa cida prosttica(PAP) Fosfatasa alcalina Antg. Especif. Prosttico(PSA) De estrgeno De progesterona Marcadores de las clulas T, B Espermina, espermidina, putresceina Calcitonina (CT) Gonadotropina corinica(HCG) Adrenocorticotropica (ACTH) Paratiroidea (PTH) Antidiurtica (ADH) Del crecimiento (GH) Eritropoyetina Lactgeno placentario humano Estimulante del tiroides (TSH)
Receptores hormonales Marcadores celulares Poliaminas Hormonas
TUMOR ASOCIADO Mama Mama Ovario Mama, pulmn, gastrointestinal Leucemia Metstasis sea Prstata Prstata Pulmn Prstata Mama Mama Linfoma Leucemia, linfoma, cncer colorrectal Metstasis seas Tumores germinales Pulmn Rin, pulmn, pncreas, ovario Pulmn Pulmn, estmago Cerebro, hgado Pulmn Pulmn, mama
ANTGENO Ca 153 Pertenece al grupo de las protenas transmembranas, cuya estructura an no est establecida. Existe una gran dispersin entre los valores encontrados en una poblacin normal, en una poblacin afectada de una patologa mamaria benigna y una poblacin que presenta una enfermedad maligna. Es por ello, que lo interesante es disponer de los valores de evolucin de un mismo paciente con el fin de detectar precozmente recidivas. Sus valores estn aumentados en los cnceres que afecten a tejido epitelial, fundamentalmente mamarios. ANTGENO Ca 125 Pertenece al grupo de las glicoprotenas no identificadas.
Es especialmente til su empleo en carcinomas ginecolgicos (fundamentalmente de ovario) aunque tambin se ve aumentada sus tasas en carcinomas gastrointestinales, de mama y de pulmn. Aumenta tambin en el embarazo y en patologas como la diabetes y cirrosis. GONADOTROPINA CORIONICA HUMANA (HCG) Es una hormona glucoproteica generalmente detectada en suero y orina durante la gestacin. La hormona est compuesta de una unidad alfa y de una unidad beta. Se ha puesto de manifiesto que una subunidad aislada puede ser producida por un determinado tumor Se detecta en tumores de clulas embrionarias y es muy til en el seguimiento de la evolucin de las molas tras su evacuacin. ANTGENO PROSTTICO ESPECFICO Es una glicoprotena secretada exclusivamente por la prstata. Es por tanto un marcador especfico de prstata, por lo que tiene inters en el diagnstico, pronstico, determinacin del estadio y seguimiento del cncer de prstata. Puede encontrarse elevado en afecciones como prostatitis aguda o adenomas. ANTGENO POLIPEPTDICO TISULAR (TPA) Es una protena aislada de muestras tumorales y metstasis. Es considerado como un marcador de proliferacin tumoral, por lo que no es especfico de la patologa tumoral. Tiene inters en el seguimiento teraputico del cncer de vejiga y en la identificacin de sujetos de riesgo, siendo de gran importancia disponer de los valores basales del enfermo en particular. RECEPTORES HORMONALES Son estructuras proteicas encargadas del reconocimiento de las hormonas por sus clulas diana. Se emplean como marcadores tumorales dos tipos de receptores: los receptores de estrgeno y los receptores de progesterona. Se utilizan para valorar la sensibilidad de los tumores malignos de mama a la respuesta hormonal. Su determinacin tambin permite la correcta aplicacin y seleccin de la terapia en funcin de la hormonodependencia o no del tumor.
HORMONAS COMO MARCADORES TUMORALES La determinacin de la produccin hormonal ectpica puede emplearse como un marcador bioqumico para la monitorizacin de pacientes con tumores confirmados o con sospecha. En aproximadamente dos tercios de los pacientes, la produccin ectpica de la hormona adrenocorticotrpica (ACTH) se asocia con carcinoma pulmonar mientras que otros tumores, como los carcinoides bronquiales y los tumores pancreticos y tmicos, son responsables del resto de los casos. El carcinoma de clulas renales y el carcinoma epidermoide de pulmn son responsables de aproximadamente dos tercios de los tumores productores de hormona paratiroidea (PTH) ectpica, mientras que el resto de los tumores se originan en distintas localizaciones. Los tumores responsables de la produccin de hormona antidiurtica (ADH) son los pulmonares y pancreticos. La produccin de hormona del crecimiento (GH) ha sido descrita solamente en asociacin con unos pocos tumores, los ms frecuentes de los cuales son el carcinoma broncognico y el gstrico. En pacientes con carcinoma broncognico se ha observado el lactgeno placentario humano (LPH) como marcador tumoral. La eritropoyetina se ha detectado en relacin a la patologa neoplsica renal, pero, dado que el rin es normalmente responsable de su produccin, estos tumores no pueden detectarse como sndromes ectpicos. Sin embargo, dicha sustancia ha sido secretada por hepatomas y tumores cerebelosos; los tumores pulmonares son caractersticos por no secretar esta hormona. La tirocalcitonina srica (TCT) aparece aumentada en ciertos pacientes con carcinoma pulmonar, colnico, mamario, pancretico y gstrico.
MARCADORES TUMORALES ANATOMOPATOLGICOS La cuantificacin de marcadores tumorales en sangre es sencilla y prctica. Sin embargo, el conocimiento de la propia masa tumoral tambin nos proporciona valiosa informacin. Para precisar el tipo de neoplasia y su posible histognesis: epitelial (carcinoma), mesenquimatoso (sarcoma), linfoide (linfoma) etc. e intentar determinar la localizacin primaria ante una neoplasia metastsica, el anatomopatlogo cuenta con una serie de marcadores que resumimos a continuacin: A) Marcadores tumorales histoqumicos: En general los marcadores histoqumicos pueden ser muy tiles en el diagnstico anatomopatolgico
de procesos metastticos en los que no se conoce la localizacin del tumor primitivo. a) Glucgeno: Tiene valor en el diagnstico general de las neoplasias. b) Sustancia mucoides c) Lpidos d) Pigmentos melnicos: Es un marcador diagnstico de melanoma maligno. B) Marcadores tumorales inmunohistoqumicos de carcter general: Las tcnicas inmunohistoqumicas aplicadas a la patologa tumoral pueden contribuir a realizar el diagnstico diferencial de los tumores, identificar probables agentes etiolgicos y subclasificarlos diversos tipos de tumores. a) Filamentos intermedios: son un componente importante del citoesqueleto celular cuya funcin primordial es mantener la forma calular y la organizacin espacial de los orgnulos citoplasmticos. a.1) Citoqueratinas a.2) Vimentina a.3) Desmina a.4) Proteina cida glial fibrilar a.5) Neurofilamentos b) Protena S-100: Se emplea en el diagnstico de tumores indiferenciados. En ausencia de citoqueratinas y antgeno epitelial de membrana (EMA), la positividad de esta protena es diagnstica de melanoma maligno. c) Antgeno epitelial de membrana (EMA): Se emplea simultneamente con las citoqueratinas para precisar el origen epitelial de un tumor indiferenciado. d) Antgeno leucocitario comn (ALC): Este antgeno es positivo en linfomas. C) Otros marcadores inmunohistoqumicos a) Antgenos vasculares: Antgenos tiles en el diagnstico de tumores vasculares. a.1) Antgeno asociado al factor VIII a.2) Ulex europeus b) Antgenos de diferenciacin neuroendocrina: Antgenos demostrados en tumores neuroendocrinos y neuroectodrmicos. b.1) Enolasa especfica neuronal b.2) Sinaptofisina b.3) Cromograninas c) Antgenos de naturaleza enzimtica: Son antgenos poco tiles debido a su baja sensibilidad que han quedado limitados a determinados tumores. c.1) Lisozima c.2) Alfa-1-antitripsina c.3) Alfa-1-antiquimotripsina
d) Antgenos oncofetales d.1) AFP d.2) CEA e) Antgenos especficos e.1) Prostticos ( PSA y FAP): Ambos se expresan en procesos benignos y malignos de la glndula prosttica. e.2) HMB 45: detectado en melanomas y en los nevus pigmentocelulares. e.3) Alfa-lactoalbmina: Tiene importancia en el diagnstico de carcinoma metastsico axilar en ausencia de clnica tumoral en mama. e.4) B 72.3: Marcador de glndulas apocrinas que se demuestra en la mayor parte de los carcinomas de mama. e.5) Ca 125: Glucoproteina de superficie observada en los tumores mucinosos de ovario, aunque tambin se ha evidenciado en otros adenocarcinomas: endometrio, gastrointestinal y mama. D) Marcadores ultraestructurales: la mayor parte del diagnstico anatomopatolgico de los tumores se realiza con microscopio ptico y tcnicas de inmunohistoqumica, pero en ocasiones, la microscopa electrnica de transmisin contribuye notablemente a identificar algunos aspectos celulares de importancia.
TEMA 5. LQUIDOS BIOLGICOS: CITOLOGA Y BIOQUMICA.

Bajo el trmino de lquidos biolgicos podemos definir a todos aquellos lquidos o fluidos corporales procedentes del organismo, tales como: Lquido cefalorraqudeo. Lquido pleural. Lquido sinovial. Lquido pericrdico. Lquido amnitico.
A lo largo de este tema nos vamos a centrar en los que se consideran de mayor importancia, lquido cefalorraqudeo (LCR), y lquido sinovial.
LQUIDO CEFALORRAQUDEO
El LCR, es el lquido seroso contenido en los ventrculos cerebrales, espacio subaracnoideo y conducto medular. Se forma principalmente en los plexos coroideos y espacio subaracnoideo. Su volumen en adulto es de unos 150 ml y en recin nacido de 10 a 60 ml. Se renueva cada 2-4 horas y la velocidad a la que se forma es de unos 21 ml /h. Su aspecto es incoloro, claro y de baja viscosidad. No contiene apenas fibringeno, contiene pocas protenas, principalmente albmina y globulina, y su pH oscila entre 7.28 y 7.34. Se suelen obtener 2 tubos: Tubo 1: Para Microbiologa. Centrifugar con rapidez. Teir el sedimento con Gram. A la vez sembrar en medio especial. Separar 3 ml en tubo estril con tapn de rosca y heparina. No conservar en frigorfico, pues algunos grmenes se daan.
Tubo 2: Para Citologa, Bioqumica y Serologa. Hacer estudio sin fijar y antes de que transcurran 2 horas desde la extraccin. Centrifugar y usar el sobrenadante.
Se investiga glucosa y protenas. No conservar durante ms de dos horas, pues los leucocitos consumen la glucosa.
EXAMEN FSICO
VOLUMEN Se mide aadiendo agua a otro tubo de ensayo de las mismas caractersticas, hasta enrasar para no contaminarlo durante la manipulacin. ASPECTO Normalmente limpio, claro y sin sedimento. Si se presenta turbio, puede deberse a la presencia de leucocitos. COLOR Normalmente incoloro. Si el color oscila entre rosa plido, anaranjado o amarillento se denomina xa ntocroma y puede deberse a: Oxihemoglobina. Metahemoglobina. Bilirrubina. Elevada concentracin de protenas (niveles superiores a 150 mg/dl).
Tras una hemorragia subaracnoidea (2-4 horas despus) es normal la xantocroma, que desaparece tras 4 a 8 das. COGULOS Y SEDIMENTOS No deben aparecer cogulos al dejarlo en reposo, pero si lo hacen pueden indicar: Cogulos sedimentados, en caso de meningitis purulenta. Cogulos floculantes, en caso de sfilis. Cogulos a modo de tela de araa con pelculas suspendidas de la superficie del lquido en meningitis tuberculosa.
EXAMEN BIOQUMICO
PROTENAS El LCR contiene muy pocas protenas en relacin al plasma (14 -45 mg/100 ml), siendo las principales: Protenas Prealbmina Albmina Transferrina Ig G Ig A Fibringeno Beta-lipoprotena Plasma (mg/l) 238 36600 2040 9870 1750 2960 3726 LCR (mg /l) 17.3 236 142 802 1346 4940 6213
Albminas -> prealbminas -> globulinas. Un aumento en la concentracin de protenas del LCR puede estar causada por: Aumento en la permeabilidad de la barrera hematoenceflica por inflamacin. Meningitis purulenta. Meningitis graves. Caso de esclerosis mltiple u otras enfermedades degenerativas del SNC. Alteraciones endocrinas, metablicas, etc. Aumento de la sntesis de protenas en el SNC.
A) Protenas totales: Los mtodos utilizados para medir las protenas totales en LCR se clasifican en: a) Procedimientos turbidimtricos. cido sulfosaliclico ms sulfato sdico (SAS). cido tricloroactico (TCA).
b) Espectrofotometra ultravioleta a 210 nm despus de: Cromatografa en columna. Ultra centrifugacin.
c) Mtodo de Lowry utilizando el reactivo de Folin-ciocalteau. Con blanco. Sin blanco.
d) Procedimientos modificados del Biuret con medicin a 330 nm.
e) Fijacin de colorante. Ponceau. Otros colorantes.
f) Mtodos inmunolgicos. a) Procedimientos turbidimtricos: Son muy utilizados, en ellos hay que controlar concienzudamente la temperatura, pues existe relacin lineal entre temperatura y turbidez, y la alteracin de la primera dara resultados poco fiables. Son sencillos, pero se necesitan 500 microlitros de LCR, frente a los 25 - 200 microlitros necesarios para otros mtodos. Presentan interferencias en la xantocroma. b) La espectrofotometra ultravioleta a 210 nm se basa en que las protenas presentan absorbancia intensa entre 210 y 220 nm. Su precisin es mayor que la de los mtodos turbidimtricos. c) El mtodo de Lowry con el reactivo de Folin, se utiliza mucho y tiene dos fases: 1. Reaccin entre las protenas y el cobre. 2. Reduccin de los cidos fonsfotnsgico y fosfomolbdico, con el complejo protenas-cobre. Es un mtodo ms largo de realizar que los mtodos turbidimtricos y presenta interferencias derivadas de los fenoles. d) Procedimientos modificados del Biuret. Son ms largos y difciles que los turbidimtricos y presentan interferencias derivadas de polipptidos de cadena corta.
f) Mtodos inmunolgicos. Son mtodos simples y rpidos. Un aumento sensible en la concentracin de protenas totales indica hiperreactividad capilar (inflamacin, neoplasia, diabetes..., etc.). Un aumento en la concentracin de las globulinas puede indicar plasmocitoma del SNC o esclerosis mltiple. B) Glucosa Los valores normales de glucosa en LCR son de 40 - 80 mg/dl (50% - 80% de la concentracin en sangre, con pacientes en ayunas). Una disminucin de los niveles de glucosa puede indicar meningitis purulenta, abscesos cerebrales, tumores, etc. La determinacin de la glucosa en LCR se puede hacer por los mtodos espectrofotomtricos de: Folin Wu. Glucosa-oxidasa. Ortotoluidina.
C) Enzimas En LCR estn presentes muchas enzimas (GOT, GPT, etc.), pero solo la LDH (lactato deshidrogenasa) parece clnicamente til. La LDH aumenta en los siguientes casos: Leucemia. Hemorragia subaracnoidea. Meningitis bacteriana. Tumores del SNC.
CITOLOGA
EXAMEN MICROSCPICO El LCR apenas presenta clulas, suele ser normal: En adulto, de 0 a 0.5 clulas mononucleadas (linfo y monocitos) por mm3. En nio de 0 a 30. La presencia de hemates suele ser anormal.
RECUENTO CELULAR Debe efectuarse antes de 1 hora tras la extraccin. Se deben rechazar las muestras con sangre a simple vista.
Para el recuento se utiliza una cmara cuentaglbulos como la de Neubauer. Un aumento anormal de clulas se llama pleocitosis y es causada por tumores cerebrales, meningitis tuberculosa, etc. CITODIAGNSTICO Recuento diferencial: El primer paso de un recuento diferencial de LCR es concentrar los leucocitos a travs de distintas tcnicas como: Centrifugacin, con tincin de Wright del sedimento resuspendido (tambin con May-Grumwald-Giemsa). Filtracin con Millipore o Nucleopore, etc. El paso siguiente consiste en observar al microscopio (100X), contar las clulas y clasificarlas en; linfocitos neutrfilos, segmentados, clulas endoteliales, etc., expresando su concentracin en porcentaje. Los valores normales suelen ser: Tipo celular Linfocitos Clulas mesoteliales y monocitos Neutrfilos Histocitos Eosinfilos Adulto 62% 36% 2% raros raros Recin nacido 20% 72% 3% raros raros
En las meningitis purulentas aumenta el nmero de neutrfilos segmentados. En las pielonefritis agudas, primero aumento el nmero de neutrfilos y despus el de linfocitos pequeos.
LIQUIDO SINOVIAL
FUNCIN, RECOGIDA DE MUESTRAS Y MANIPULACIN Es un ultrafiltrado del plasma al que se une el cido hialurnico, elaborado por las clulas de la membrana sinovial. Proporciona lubricacin y nutrientes a las clulas cartilaginosas de la articulacin. Normalmente la cantidad es de 3-4 ml a no ser que exista derrame, enfermedad, etc.
La tcnica de extraccin se denomina artrocentesis y consiste en aspirar percutneamente todo el lquido de la cavidad sinovial, mediante jeringa de plstico estril. El paciente preferentemente estar en ayunas 6-2 horas antes (importante para los niveles de glucosa). Puede dar informacin sobre: Sospecha de infeccin (artritis supurativa). Artritis por cido rico (gota). Artritis por pirofosfato clcico (pseudogota, etc).
Tubo 1, para serologa: De 5-10 ml sin anticoagulante. Centrifugar y usar sobrenadante.
Tubo 2, para bacteriologa: Sin anticoagulante. Si se sospecha infeccin por gonococos, sembrar directamente en Tayer-Martin.
Tubo 3, para citologa/ bioqumica: Usar heparina como anticoagulante (25 U/ml). No deben formarse cogulos, si los hay indica tardanza o mala ejecucin del mezclado.
Puede conservarse a -4 C, para analizar inmediatamente y a -70 C para serologa. El examen habitual del lquido sinovial incluye: Determinacin de su aspecto. Resultados de la prueba del cogulo de mucina. Estudio microscpico con luz polarizada compensada. Tincin de Gram. Cultivo. Nivel de glucosa.
Ninguna de estas pruebas, excepto la tincin de Gram y la identificacin de cristales, puede considerarse altamente especfica para determinar el tipo de artritis.
EXAMEN MACROSCPICO El aspecto normal del lquido sinovial es transparente y de color amarillo plido. La turbidez sugiere inflamacin, aunque no necesariamente. PRUEBA DEL COGULO DE MUCINA Sirve para calcular la viscosidad, consiste en colocar una gota del lquido sobre el dedo pulgar y tocar con otro dedo de la mano. Al separar los dedos, el lquido debe formar un hilo de 4-6 cm. de longitud. Si el hilo se rompe antes de 3 cm.., debe considerarse viscosidad menor de la normal. CITOLOGA RECUENTO CELULAR DE LEUCOCITOS Puede hacerse con hemocitmetro, o en cmara de Fuchs -Rosenthal. Para microscopio ptico normal utilizar diluyente con 0.1% de azul de metileno (facilita el reconocimiento de leucocitos). Para microscopio de contraste de fase no es necesario colorante. Si el lquido aparece muy manchado de sangre, es necesario lisar los eritrocitos previamente.
Son valores normales: 100.000 leucocitos /microlitro. Valores normales indican infeccin bacteriana normalmente.
RECUENTO DIFERENCIAL Para calcular el porcentaje de neutrfilos puede utilizarse: Tincin de Wright (sin concentrar). Tincin de Wright del sedimento centrifugado. Tincin de Wright del lquido concentrado por citocentrifugacin (previa tincin de Papanicolau)
La tcnica microscpica elegida casi siempre es la de contraste de fase. Cuando se dan los resultados de un recuento diferencial, habitualmente solo se hace mencin al porcentaje de neutrfilos. El valor normal de estos suele ser del 25%. Un porcentaje muy alto (90% o ms) es indicativo de artritis bacteriana.
Morfologa celular: Clulas AR; son neutrfilos en cuyo citoplasma aparecen, tanto en microscopia ptica, como de fase, pequeos grnulos (de 10 a 20) citoplasmticos oscuros con dimetro entre 0.5 y 2 micras. Los grnulos pueden identificarse claramente con contraste de fase o inmersin en aceite, y puede ser demostrada su presencia con tcnicas de inmunofluorescencia. Aparecen en artritis reumatoide, gota y artritis sptica. Clulas LE ; en el Lupus Eritematoso, aparecen en lquido sinovial unas clulas de caractersticas particulares denominadas clulas LE.
Grandes clulas histiocticas con inclusiones citoplasmticas, aparecen al teir con Giemsa y con Papanicolau en el sndrome de Reiter. Clulas cartilaginosas multinucleares; se presentan en la osteoartritis, para identificarlas se tie con Papanicolau.
Cristales; se han descrito 4 tipos asociados a las siguientes enfermedades: Artritis Gota cristales de apatita cristales de urato monosdico dentro de los neutrfilos y macrfagos durante el ataque de gota, y fuera de ellos en poca de no ataque Pseudogota cristales de dehidrato de pirofosfato clcico Artritis cr- cristales de dehidrato de talco (introducidos en una interve nnica cin quirrgica) EXAMEN BIOQUMICO. INTERVALOS DE REFERENCIA DEL LQUIDO SINOVIAL. Lquido Sinovial 1-3gr/dl 55-70% 5-7% 8-10% 10-14% 70-110 mg/dl 7.3-7.4 Plasma 6-8 gr/dl 50-65% 3-5% 8-14% 12-22% 70-110 mg/dl 7.38-7.44 arterial 7.36-7.42 venoso
Protenas Albmina Alfa-globulina Beta-globulina Gamma-globulina Glucosa PH
Las protenas presentes en lquido sinovial dependen de las presentes en plasma. Si aumenta el nivel de protenas en plasma, tambin lo hace en el lquido sinovial.
La concentracin de una protena especfica se expresa normalmente como cociente lquido sinovial/plasma. La glucosa en plasma y en lquido sinovial presenta valores muy similares. Es importante obtener la muestra en ayuno de 6 a 12 horas. Tambin se presentan enzimas como la fosfatasa cida, LDH y transaminasas, pero su determinacin parece tener escaso valor clnico. La determinacin de pH y de lactato proporciona un ndice til de la inflamacin, pero es inespecfico de la etiologa.
TEMA 6. ANLISIS CUALITATIVO DEL SEDIMENTO URINARIO
INTRODUCCIN
El examen del sedimento urinario comprende la investigacin e interpretacin de una serie de estructuras de distinto origen y composicin que pasaremos a ver detenidamente en este tema. Realizado en las debidas condiciones el examen microscpico del sedimento urinario proporciona una ayuda indiscutible en el estudio del diagnstico y evolucin de las enfermedades renales.
PREPARACIN DE LA MUESTRA
El examen del sedimento urinario es ms seguro cuando la orina est concentrada. Si la muestra est demasiado diluida y los elementos celulares lisados, la cantidad del sedimento obtenida incluso despus de centrifugacin puede no ser representativa. El examen microscpico se hace generalmente con el sedimento obtenido por centrifugacin de la orina. Un sedimento puede prepararse de la siguiente forma (la tcnica, en la actuali dad, no se encuentra totalmente estandarizada): 1. Mezclar bien la muestra de orina y transferir un volumen aproximadamente de 10 ml a un tubo de centrfuga cnico. 2. Centrifugar a 1500 rpm durante 5 minutos. 3. Decantar la muestra. Volver a suspender el sedimento en unas gotas de orina. 4. Colocar la gota de sedimento sobre un porta y taparla con un cubre. La gota no ha de ser demasiado grande, debiendo evitarse la formacin de burbujas. 5. Examinar la preparacin antes de que se produzca evaporacin. 6. Examinar en primer lugar un rea grande con poco aumento. Luego reducir la intensidad de luz al mnimo y examinar varios campos en busca de cilindros. Finalmente, enfocar con mayor aumento (40x). Examinar varios campos para evaluar clulas y otros. El sedimento obtenido mediante centrifugacin de la orina contiene todos aquellos materiales insolubles (denominados tambin elementos formes) que se han
acumulado en la orina durante el proceso de formacin (clulas, microorganismos, cilindros, etc.) contiene tambin cristales de distintas formas y tamaos dependiendo del pH de la orina, y generalmente (salvo excepciones) de poca importancia clnica. Muchos laboratorios utilizan la microscopa de contraste de fases para la interpretacin del sedimento urinario, en especial la observacin de cilindros.
IDENTIFICACIN DE ELEMENTOS ESPECFICOS EN EL SEDIMENTO

Clasificacin: Sedimento organizado
Hemates Leucocitos Clulas epiteliales o Clulas escamosas o Clulas de transicin o Clulas renales Microorganismos o Bacterias o Levaduras o Protozoos o Parsitos Espermatozoides Cilindros o Hialinos o Epiteliales o Granulosos o Eritrocitarios o Leucocitarios o Creos o Cilindroides
Sedimento no organizado
Cristales o pH cido Uratos cido rico o pH alcalino Fosfatos triples Fosfatos amorfos Carbonato clcico
o pH variable Oxalato clcico Cistina Colesterol Tirosina Leucina
GLBULOS ROJOS
Aparecen en el sedimento como formas circulares, carecen de ncleo y refractan un poco la luz. Presenta aspecto de disco transparente. Son de menor tamao que los leucocitos y las clulas epiteliales.
No debe considerarse patolgica la aparicin de 2/3 hemates por campo, en el estudio del sedimento. Cuando la orina contiene un nmero elevado de hemates y aparezcan adems cilindros hemticos hay que considerar que la hematuria es de origen renal. El aumento de glbulos rojos en orina se conoce como hematuria.
GLBULOS BLANCOS
Son ms grandes que los rojos. Contienen uno o ms ncleos. Su presencia en orina indica generalmente inflamacin. Son valores normales en el hombre menos de 3/campo y en la mujer m enos de 5/campo. En la mayora de los trastornos renales o del tracto urinario se produce un incremento de la cifra de leucocitos en
orina, que afecta principalmente a los neutrfilos. Tambin puede observarse un aumento temporal en caso de fiebre y despus de un ejercicio intenso. Si su presencia va acompaada de cilindros leucocitarios o que contengan leucocitos y clulas epiteliales, la elevacin de la cifra de leucocitos presentes en la orina se considera de origen renal. Su aumento en orina se conoce como Leucocituria o piuria.
CLULAS EPITELIALES
Son varias veces ms grandes que los glbulos rojos o blancos. Segn su origen tienen diferentes formas, pero la identificacin del origen de estas clulas puede ser en ocasiones dificultoso. Cuando la distincin es posible, podemos encontrar: Clulas epiteliales escamosas. Proceden de la porcin distal del tracto urinario inferior y del tracto genital femenino. Son las de mayor tamao. Se trata de clulas planas con un gran citoplasma y ncleo simple. Son poco significativas, a menos que su presencia sea muy abundante. Clulas de transicin (pelvis renal). Su forma es redondeada u oval. En ocasiones parecen tener una proyeccin en forma de cola (clulas en raqueta) La orina normal puede contener cierto numero de estas clulas como resultado del proceso normal de descamacin. Cuando aparecen en gran nmero indica la existencia de un proceso patolgico causante de exfoliacin anormal.
Clulas renales (pelvis y tbulos renales). Son clulas pequeas y redondeadas. La presencia de ms de dos clulas epiteliales del tbulo renal por campo de gran aumento indica un dao activo o una lesin tubular renal.
MICROORGANISMOS
Bacterias. La orina normal fresca no contiene microorganismos. Debemos tener en cuenta que si la orina no ha sido recogida en condiciones adecuadas puede tener contaminacin. Adems si la orina permanece a temperatura ambiente durante algn tiempo, las bacterias pueden proliferar rpidamente y se ven en gran nmero. Una orina muy alcalina con muchas bacterias y muy pocos glbulos blancos es caracterstica de muestras contaminadas. La bacteriuria puede informarse como escasa, moderada o intensa. Generalmente en caso de que aparezca debe realizarse un estudio microbiolgico de la orina. Levaduras. La ms comn en el sedimento es la Cndida Albicans. Frecuentemente su presencia en mujeres es consecuencia de una contaminacin de la orina. Las levaduras se diferencian de los hemates en que no se pueden teir con eosina. Parsitos. La presencia de parsitos en la orina suele indicar contaminacin genital o fecal. El flagelado Trichomonas Vaginalis es el parsito ms comn hallado en la orina. La incidencia de este tipo de parasitismo es muy elevada en las mujeres y puede ser causa de vaginitis intensa.
ESPERMATOZOIDES
La presencia de espermatozoides en la orina es un hecho bastante frecuente y carece de significacin patolgica. Estn formados por una cabeza ovoide y por una larga cola.
CILINDROS
Son conglomerados alargados de material proteico formados en los tbulos renales o en los conductos colectores. La formacin de cilindros es mayor cuando el pH es bajo y existe obstruccin de la nefrona provocada por restos celulares o clulas. Normalmente el sedimento urinario no contiene cilindros, aunque su deteccin no indica forzosamente la existencia de una patologa renal. Sin embargo, generalizando, podramos decir que la presencia numerosa de cilindros en un sedimento urinario es indicativa de enfermedad renal. El tamao y la forma de los cilindros dependen del lugar en que se forman. Los ms grandes proceden de los tbulos dilatados, los ms finos de los tbulos comprimidos o se deben a una desintegracin. A veces son contorneados y ocasionalmente muestran ramificaciones. Hialinos. Se trata de cilindros compuestos fundamentalmente de protenas sin inclusiones. Son plidos y transparentes. Difciles de visualizar. Su aparicin en grandes cantidades puede indicar una alteracin importante del parnquima renal.
Epiteliales. Son ms cortos que los hialinos y ms fciles de ver. Indican inflamacin aguda del rin. Contiene dentro clulas epiteliales. En las unidades de trasplante, estos cilindros son uno de los criterios ms fiables para el diagnstico de rechazo agudo a partir del tercer da despus de la intervencin.
Granulosos. Pueden ser debidos a una evolucin de los cilindros de clulas epiteliales en los que ha existido una degeneracin celular. Presentan un aspecto granular con granulaciones ms o menos finas (cilindros granulosos finos o gruesos). Su presencia implica un trastorno crnico del rin.
Eritrocitarios. Contienen glbulos rojos en su interior. Tienen un aspecto muy variable. Suelen ser indicativo de glomerulonefritis por causa diversa.
Leucocitarios. Se caracterizan por la aparicin de leucocitos identificables en el interior de la matriz proteica. Acompaa a las infecciones del tracto urinario. Su presencia exige una investigacin bacteriolgica de la orina.
Creos . Se caracterizan por un alto ndice de refraccin y una coloracin amarillenta. Su composicin no es bien conocida. Se ven asociados a procesos crnicos.
Cilindroides, fibrina, clulas epiteliales, leucocitos, eritrocitos o bacterias pueden agruparse dando formas semejantes a los cilindros. Generalmente se distinguen de los cilindros verdaderos por sus contornos variables e irregulares. No se conoce con exactitud su lugar de procedencia ni la causa de su formacin.
CRISTALES
Cristales de muy diferentes formas y tamaos se ven habitualmente en la orina, aunque solo ocasionalmente su presencia tiene algn significado. La cristaluria puede ser asintomtica o ir asociada a la formacin de clculos, dando lugar a las manifestaciones clnicas que acompaan a una obstruccin completa o parcial del flujo urinario. El pH de la orina tiene importancia en la aparicin de los distintos tipos de cristales.
pH cido: Uratos cido rico
pH alcalino: Fosfatos triples Fosfatos amorfos Carbonato clcico
pH variable: Oxalato clcico Cistina Colesterol Tiroxina Leucina
Uratos. Los uratos amorfos aparecen como granulaciones oscuras, dando al sedimento una coloracin rosada, amarillenta o anaranjada. Pueden proceder de la alimentacin aunque tambien aumentan en estados febriles.
Cristales de Urato am-
cido rico. Toma formas diferentes como pesa, prisma, roseta, placas irregulares. No poseen significacin clnica a menos que se presenten en gran cantidad en orinas recin emitidas. Los clculos de cido rico o de uratos se encuentran aproximadamente en el 16% de los pacientes con gota.
Fosfatos. Los cristales de fosfato triple (amnico, magnsico y clcico) son incoloros y presentan forma tpica de atad. Se encuentran en orinas alcalinas. Los cristales de fosfato clcico son amorfos o tienen forma de prisma, roseta, aguja etc.
Cristales
de
Fosfato
Cristales de Fosfato amnico-magnsico
Los fosfatos amorfos aparecen como granulaciones que confieren al sedimento una coloracin blanquecina. Pueden aparecer tras la ingestin de determinados alimentos como la fruta.
Carbonato clcico. Su forma caracterstica es la de pesa, ocho, esfera. No tienen inters clnico.
Oxalato clcico. Suelen aparecer en forma de octaedro y presentan un caracterstico cuadrado cruzado diagonalmente (se dice que tienen forma de sobre). Pueden producirse en caso de dietas ricas en oxalato (tomates, repollo esprragos, naranjas...) El oxalato clcico, muchas veces mezclado con sales de fosfato, est presente en una gran parte de los clculos urinarios.
Cistina. Son placas hexagonales. Su presencia es poco habitual y son indicativos de cistinuria (error metablico congnito poco frecuente).
Colesterol. Aparecen como placas transparentes de forma irregular. Su presencia es rara. Pueden aparecer en nefritis e infecciones graves del tracto urinario. Leucina y tirosina . Los cristales de estos dos aminocidos suelen aparecer juntos en la orina como consecuencia generalmente de una grave enfermedad heptica. Suelen ser de color amarillento debido a la presencia de bilirrubina (ictericia). Un conjunto de material no significativo puede formar parte del sedimento urinario. Son los desechos o artefactos. A veces se debe a material de vejiga o uretra, pero otras se debe a contaminacin. Es frecuente encontrar hilos mucosos, pelos, fibras diversas, etc. Su presencia puede sugerir una recogida defectuosa.
SEDIMENTO NORMAL
El sedimento normal no est libre de clulas o cilindros, pero contiene un nmero limitado de elementos formes. Una definicin precisa de la normalidad es difcil de obtener, pero la presencia de uno o ms glbulos rojos por campo de alto poder, uno o dos leucocitos y algunas clulas epiteliales no se considerarn necesariamente anormales. La orina de mujeres maduras puede tambien contener un gran nmero de clulas epiteliales escamosas procedentes de las paredes vaginales.
TEMA 7. ESTUDIO DE HECES: DIGESTIN, SANGRE OCULTA Y CUERPOS REDUCTORES.
INTRODUCCIN
Las materias fecales estn constituidas en unas tres cuartas partes por agua. Las sustancias slidas del cuarto restante comprenden: 30% de bacterias muertas. 10 - 20% de grasa. 2 - 3% de protenas. 10 - 20% de sustancias inorgnicas. 30% de restos no digeribles, componentes slidos del jugo digestivo como pigmentos biliares y detritus celulares.
El estudio de laboratorio de muestras fecales de origen humano, permite obtener datos que nos sirve para determinar: 1.- La situacin del funcionalismo digestivo. 2.- Infecciones intestinales causadas por virus, bacterias y hongos. 3.- Infecciones causadas por parsitos intestinales. Este estudio tiene su mxima indicacin en las diarreas crnicas, y comprende la observacin macroscpica y microscpica de las heces, as como su anlisis qumico, bacteriolgico y parasitolgico.
ESTUDIO DEL FUNCIONALISMO DIGESTIVO

Con este estudio procuramos saber la digestin de los principios inmediatos. La digestin es el conjunto de fenmenos mecnicos y bioqumicos que transforman los constituyentes orgnicos ms o menos complejos de los alimentos en sustancias simples directamente asimilables. Los alimentos son triturados en la boca sufriendo una divisin fsica. Luego comienza una disgregacin qumica mediante fermentos digestivos y elementos bacterianos, siendo absorbidas, las sustancias transformadas, por la mucosa intestinal y por ltimo los residuos no aprovechables de la digestin son expulsados fuera del organismo.
ALIMENTACIN PREVIA AL ANLISIS

Se debe seguir con el rgimen habitual de comidas, pero hay que aadir aquellos elementos que nos pueden suministrar una base para el diagnstico, como son: Carne: Se investiga el tejido conjuntivo y fibras musculares. Debe comerse lo ms cruda posible. Patatas: Se investiga la digestin de almidn. Grasa: Se tomar en forma de leche, mantequilla o carne.
Este plan se sigue durante 3 das y luego se recoge la muestra de heces.
TOMA DE MUESTRA
Se recogern las heces en un frasco limpio con cierre hermtico, no es necesaria la esterilidad. El anlisis se har en las 12 horas siguientes a la deposicin, guardando la muestra en el frigorfico a 4-10 C. Si el anlisis se pospone ms de 24 horas se aadir un volumen igual al de las heces de una solucin acuosa al 5% de formol comercial. CARACTERES ORGANOLPTICOS A) OLOR: a) Segn la ingesta: o o o o Inodoro: Meconio. Aumentado: Comidas ricas en carne y pescado. Dbil: Dieta vegetariana y lctea. Ligeramente agrio: Nios de pecho.
b) Fecaloide normal. c) Ptrido (olor a amoniaco) Debido a la flora proteoltica aumentada. Provoca diarreas de putrefaccin (heces alcalinas y gases). d) Agrio penetrante o rancio Debido a la flora sacaroltica aumentada. Provoca diarreas de fermentacin (heces cidas y gases). e) Nauseabundo Debido a la descomposicin de tejidos, ocasionada por carcinoma, lceras...
B) COLOR: a) Marrn: Es el color habitual. b) Verde: Puede ser debido a la ingesta (verduras, medicamentos...) o a la presencia de biliverdina (rapidez del trnsito intestinal, diarreas infantiles). c) Rojo: Debido a la ingesta (remolacha) o a la existencia de hemorragias prximas al ano. d) Negro: Debido a la ingesta (sangre, morcilla, espinacas), a los medicamentos (carbn, hierro, bismuto) o a hemorragias internas (heces pastosas, melenas). e) Blanco: Debido a la ingesta (leche, bario, caoln...) o a la ausencia de bilis fundamentalmente. f) Amarillo: Debido a la ingesta (rgimen lcteo) o a diarreas de fermentacin hidrocarbonada. C) CONSISTENCIA: Puede ser dura, normal, pastosa, lquida... D) FORMA: Vara con la consistencia a) b) c) d) e) Cilndrica: Es la normal. Laminada o en cinta: Debido a papilomas. Bolitas secas y duras: Estreimiento. Bolitas en masas: Se presenta en la Salmonelosis. Bola maleable del tamao de un puo: Se presenta en la atona del recto (personas ancianas).
E) VISCOSIDAD: Se determina tocando las diferentes partes de las heces con un agitador de vidrio. a) Viscosas (pastosas): Se adhieren al agitador. b) Poco viscosas: No se adhieren al agitador. c) Grasas: Tienen gran maleabilidad moldendose en ellas el agitador, como tierra amasada.
EXAMEN MACROSCPICO Para este examen se tritura ligeramente en un mortero con agua una cantidad de heces del tamao de una nuez. Luego se pasa a una placa de Petri y colocamos esta sobre una cartulina blanca y negra. Los fragmentos de carne aparecen de color gris o marrn. El tejido conectivo tiene forma de membranas o paquetes filamentosos. Se puede confundir con moco. Para diferenciarlo se aadir cido actico al 30% y si desaparece es tejido conectivo. El moco se puede presentar de varias formas: amorfo, transparente, opaco (con restos celulares) y membranoso (en forma de paquetes o moldes de la mucosa). La presencia de moco es importante, salvo en los recin nacidos, y siempre deber resaltarse en el informe. SI OBSERVAMOS FRAGMENTOS DE CARNE FRAGMENTOS DE FCULAS (PATATAS, REMOLACHA) TEJIDO CONJUNTIVO MOCO MOCO AMORFO, SANGRE, PUS MOCO MEMBRANOSO FALSAS MEMBRANAS PUEDE SER INDICATIVO INSUFICIENCIA GSTRICA: - Falta de secrecin. - Trnsito acelerado. INDIVIDUO GASTRECTOMIZADO INSUFICIENCIA GSTRICA Y PANCRETICA ESCASA PERMANENCIA EN EL COLON INSUFICIENCIA GSTRICA INFLAMACIN DE LA MUCOSA INTESTINAL COLITIS ULCEROSA DISENTERA BACILAR ENTEROCOLITIS PSEUDOMEMBRANOSA MIXORREAS NERVIOSAS ARTEFACTOS: Piel de embutidos, chicle...
ANLISIS MICROSCPICO Nos aporta datos ms fidedignos acerca de los trastornos de la digestin. Para ello habr que instaurar la alimentacin explicada anteriormente, si no se hace as la significacin del estudio es muy limitada. Para este estudio se hace una suspensin de heces en agua destilada o suero fisiolgico. 1. Se coge una cantidad de heces, del tamao de una castaa, y se coloca en un mortero, copa, vaso de precipitado o tubo de ensayo. 2. Se aade agua o suero fisiolgico y mezclar con una varilla hasta formar una papilla homognea y fina, ni muy fluida ni muy espesa. 3. Se coloca una gota de esta suspensin en un portaobjetos y se pone un cubreobjetos encima, cuidando que se extienda formando una capa delgada, homognea, sin burbujas de aire. No se debe aplastar el cubre. Se observar con el objetivo de x10 aumentos, obteniendo una visin de conjunto, y luego se enfoca con el de x40 aumentos. Cuando se trata de heces lquidas, se debe hacer una mezcla homognea y se coloca una gota directamente al portaobjeto. Podremos observar: A) CLULAS : Normalmente epiteliales de las ltimas porciones del intestino. No son patolgicas. B) LEUCOCITOS : Se observarn deformados. Si se encuentran en poca cantidad no es patolgico. Se observan mejor mezclando la gota de la suspensin fecal con otra de azul de metileno de Loefler. C) HEMATES: Es muy raro observarlos ya que se digieren. Si aparecen ser a causa de evacuacin muy rpida o hemorragias en tramos intestinales bajos. D) CRISTALES: Presentan el mismo aspecto que en el sedimento urinario. Hay unos, caractersticos del parasitismo intestinal, llamados cristales de Charcot-Leyden, presentando una forma tpica de agujas de brjula.
E) FIBRAS MUSCULARES : Se pueden observar de diferentes formas dependiendo del grado de digestin: a) Mal digeridas: Fragmentos rectangulares estriados, dbilmente amarillos. Las estra s son transversales y longitudinales. Los bordes del rectngulo son rectos.
b) Parcialmente digeridas: Trozos ms pequeos con los bordes redondeados y las estras longitudinales.
c) Bien digeridas: Trozos muy pequeos con los bordes redondeados y sin estras.
La presencia de fibras musculares mal digeridas se llama CREATORREA. Se puede deber a una insuficiencia gstrica o pancretica. F) TEJIDO CONJUNTIVO. Se observa como fibras o filamentos que se renen en fascculos y se entremezclan entre si. Son incoloros y no poseen estriacin. Se podra confundir con el moco, pero se distinguen porque se transparentan al aadirle cido actico al 30 %.
G) ALMIDN . Para su investigacin se aade a la gota de emulsin fecal una gota de lugol. Los grnulos de almidn tomarn un u otro dependiendo del grado de digestin. Tambin podrn estar dentro de clulas o aislados: a) No digeridos: Azul oscuro, casi negro.
b) Parcialmente digeridos: Rojo o rosa.
c) Digeridos : Amarillos o color arenilla.
El tejido muscular, al aadir almidn a la preparacin toma un color rojo-caoba. La presencia de almidn no digerido en las heces se llama AMILORREA. H) LPIDOS . Para observarlas mejor usaremos el reactivo Sudam III. Una gota de este colorante se mezclar con una gota de la suspensin fecal. Los lpidos o grasas se encuentran en las heces en forma de: a) cidos grasos: Tienen aspecto cristalino, en forma de escamas o agujas finas rectas o curvadas. Difcilmente se tien.
b) Grasa neutra: Aparece como gotitas de color rojo o naranja Si la temperatura es fra (< 20 C) las gotas se transforman en masas o placas algo amarillentas o rojas. c) Jabones: Difciles de reconocer al microscopio. No se tien. Se presentan como masas amorfas o cristales en forma de agujas cortas. En la observacin lo mas importante son las grasa neutras. Se informa positivamente a partir de 15-20 gotas/campo (objetivo x40). El aumento patolgico de grasas en heces se llama ESTEATORREA. Si en el microscopio se observa mas de 60 gotas /campo es seguro esteatorrea . Algunas veces, para observar las grasas se calienta el portaobjetos suavemente a la llama. De esta forma todas las grasas (cidos grasos, neutros y jabones) se transforman en gotitas de color rojo-anaranjado (con Sudam III). En el estudio de las grasas en heces puede inducirnos a error, los supositorios, los enemas oleosos y los portaobjetos y cubreobjetos mal desengrasados. ANLISIS MICROSCPICO
SI OBSERVAMOS
INDICA DIGESTIN NORMAL DE Bien digeridas. PRTIDOS FIBRAS Medianamente dige- ALTERACIN INTESTINAL MUSCULARES ridas MEDIANA Poco o nada digeriALTERACIN INTENSA das TEJIDO Unido o no a INSUFICIENCIA GSTRICA CONJUNTIVO fibras musculares Clulas desgastadas DIGESTIN NORMAL DE sin granos de almiGLCIDOS dn. CLULAS TRANSITO INTESTINAL AMILCEAS Clulas sin digerir ACELERADO llenas de almidn. O INSUFICIENCIA PANCRETICA Neutras. INSUFICIENCIA PANCRETICA INSUFICIENCIA BILIAR O MALA cidos grasos. GRASAS ABSORCIN PRESENCIA de Ca y Mg en EL Jabones. INTESTINO MOCO, LEUCOCITOS, ALTERACIONES DE LA HEMATES, EPITELIO MUCOSA
ESTUDIO FSICO-QUMICO
pH Vara entre 6,8 y 7,2 dependiendo del rgimen alimenticio. Los valores normales se van a modificar segn el proceso digestivo. La medicin se hace impregnando un papel indicador con una varilla de vidrio que contenga heces. La lectura se efecta por el reverso del papel. SANGRE Tambin se llama este anlisis investigacin de hemorragias ocultas. Se puede observar sangre en heces, de color rojo, proveniente de fisuras anales o hemorroides. Esto no se considera importante. Cuando proviene de hemorragias gstricas, duodenales, cncer de colon, etc., la sangre se digiere, tomando las heces un color oscuro, casi negro. Esta sangre si es importante. Para este anlisis es importantsimo que el paciente durante los 2-3 das anteriores a la toma de muestras se someta a un rgimen riguroso (blanco), sin carne, pescados, embutidos, lentejas, espinacas, pltanos etc., es decir alimentos ricos en peroxidasas. Tampoco deber tomar medicamentos que contengan hierro o hemoglobina, o que puedan provocar prdidas sanguneas como salicilatos o esteroides. La alimentacin permitida consiste en: Huevos, patatas, cebolla, arroz, garbanzos, pan y leche. La mayora de las pruebas para detectar hemorragias ocultas en heces se basan en la determinacin de peroxidasas como indicativo del contenido de hemoglobina. Las ms importantes son: A) REACCIN DE LA BENCIDINA: Sobre un papel de filtro manchado de heces, se ponen unas gotas de bencidina y agua oxigenada de 10 volmenes. Si el resultado es (+), como resultado de la presencia de peroxidasa, se formar un halo de color verde-azulado en torno a la mancha. B) REACCIN DE WEBER O DEL GUAYACO: La prueba es igual que la anterior pero en lugar de poner bencidina se pone guayaco. La reaccin es la siguiente: HEMOGLOBINA + H 2O2 H2O + O2 BENCIDINA O2 + o Color Azul-verdoso
GUAYACO Estas pruebas son muy inespecficas y dan habitualmente falsos positivos. La reaccin de la bencidina es ms sensible que la del guayaco. Actualmente existe una tcnica que no se basa en la peroxidasa: C) PRUEBA DEL CROMO RADIOACTIVO: Tiene ms sensibilidad y especificidad que las anteriores. Se basa en la capacidad del Cr radioactivo (Cr51) para ser fijado por los hemates y por el hecho de no ser reabsorbido en el tracto gastrointestinal. As pues, es excretado por las heces en las que puede ser medido por espectrofotometra de rayos ?. PIGMENTOS BILIARES Investigaremos en las heces la presencia de bilirrubina y estercobilingeno mediante 2 mtodos: A) PRUEBA DEL SUBLIMADO: Ms sensible para Estercobilina. Se hace poniendo en un tubo de ensayo: Dilucin de heces.................................... 5 ml. Sublimado (ClHg).................................... 5 ml.
Se agita y se incuba a 37 C durante 1-2 horas y se observan los resultados:

ROJO.............................. ESTERCOBILINA o ESTERCOBILINGENO VERDE ............................ BILIRRUBINA . BLANCO......................... Ausencia de Pigmentos.
B) PRUEBA DE GRIGAUT: Ms sensible para bilirrubina. Se hace poniendo en un tubo de ensayo: ClH concentrado...................................... 5 ml. Cl3Fe (10%)............................................. 2 gotas. Dilucin de heces.................................... 5 ml.
Se agita y se calienta ligeramente observando los resultados: VERDE..................................... BILIRRUBINA. ROJO........................................ ESTERCOBILINGENO.
Las 2 pruebas se hacen simultneamente, debido a su diferente sensibilidad, y los resultados se interpretan as:
SUBLIMADO GRIGAUT ESTERCOBILINOGENO + BILIRRUBINA + ESTERCOBILINGENO + BILIRRUBINA -
+ + + -
Heces normales Trnsito intestinal acelerado Trnsito intestinal medianamente acelerado Obstruccin biliar
ENZIMAS PROTEOLTICAS: Se intenta comprobar la presencia de Tripsina, Quimiotripsina, etc. Las heces normales (hasta una dilucin 1/100) licuan la gelatina. La prueba se realiza aplicando una gota de diferentes diluciones (1/5, 1/10, 1/50, 1/100) de la heces a estudiar de heces sobre una pelcula de gelatina. Se considera un resultado positivo si la gelatina queda disuelta en hora. Positivo hasta una dilucin 1/100........................... Digestin normal. Positivo hasta una dilucin 1/50............................. Digestin media. Positivo hasta una dilucin 1/10..............................Digestin deficiente.
DETERMINACIN CUANTITATIVA DE GRASA EN HECES Una persona normal digiere y reabsorbe casi toda la grasa de su dieta. Para valorar cuantitativamente esta grasa tendremos que pesar las heces del paciente durante varios das. El paciente debe llevar una dieta estricta durante seis das. Hay varios mtodos. A) REACCIN DE AZUL DE NILO PARA GRASA FECAL: Tcnica: 1. Diluir en un tubo de ensayo una porcin de muestra con 9 volmenes de agua. 2. Aadir: 1 ml. de esta suspensin fecal. 1 ml. de agua. 3 gotas de ClH al 10 %. 3 gotas de Oxalato amnico saturado. 3. Calentar a ebullicin durante unos segundos. Enfriar. 4. Echar el lquido en un vaso de precipitado. 5. Lavar el tubo de ensayo con 2,5 ml. de solucin de CO3Na2 al 20 % y aadirlos al contenido del vasito.
6. Agregar 15 ml. de agua y 1 ml. de solucin de Azul de Nilo (0,05 % en agua) dejando resbalar por las paredes. 7. Leer los resultados inmediatamente: NEGATIVO: Rosado que vira a gris (aproximadamente < 7 g./da) DUDOSO: Gris azulado. POSITIVO: Azul (aproximadamente > 7 g./da) Cuando la reaccin de azul de Nilo es negativa, la grasa fecal no excede nunca de 5% en peso. Una reaccin claramente positiva corresponde a ms del 5 % de grasa. B) MTODO DE VAN DE KAMER: Se separan los lpidos de las heces mediante tratamiento de estas con una solucin de hidrxido potsico alcohlico y que contenga pequeas cantidades de alcohol amlico. De sta manera se produce la formacin de jabones. Posteriormente se hidrolizan los jabones con ClH y se convierten en cidos grasos, extrayndose estos a continuacin con ter de petrleo. Por ltimo se titulan los cidos grasos con NaOH 0,1 N Peso total de heces x Vol. cc. NaOH g. de grasa = Peso de la muestra
CUERPOS REDUCTORES O AZCARES REDUCTORES EN HECES Las heces deben de ser recientes, no debe dejarse pasar ms de una hora desde que son emitidas hasta que se realiza el examen. Hay que diluir una parte de heces en dos partes de agua destilada, mezclar bien y centrifugar a un nmero bajo de revoluciones (1.500 rpm.). Se toman 15 gotas del sobrenadante, se colocan en un tubo de vidrio y se le aaden dos gotas de ClH 1 N. Luego calentamos para desdoblar la sacarosa. Una vez que ha enfriado el lquido anterior, se aade una tableta de CLINITEST (Ames) para azcares reductores y se deja disolver. A continuacin comparamos con la escala de colores que lleva el reactivo. El resultado se da en g./litro. El resultado ser negativo si es inferior a 2,5 g./l. Entre 2,5 y 5 es dudoso y ser positivo si es mayor de 5 g./l.
TEMA 8.- HEMOGRAMA. RECUENTO CELULAR Y FRMULA LEUCOCITARIA.
RECUENTOS CELULARES Y VALORES HEMATOLGICOS NORMALES.

Glbulos rojos: Neonatos.................4.0-5.6x1012/l. Hombres.................4.5-6.5x1012/ l. Mujeres...................3.8-5.6x1012/l. Plaquetas: 150-400 x109 / l. Leucocitos: Nios de un ao.........6-18x109/l. Adultos....................4-10x109/l. Recuento leucocitario diferencial: Relativo Absoluto por 7000 leucocitos
Adultos: Neutrfilos..................40-75%..................................2800-5250. Linfocitos...................20-45%...................................1400-3150. Monocitos..................2-10%.....................................1400-3150. Eosinfilos..................1-6%.......................................70-420. Basfilos.....................<1%.........................................0-70. DEFINICIONES. En caso de aparicin de citopenia en el hemograma, el autoanalizador utilizado nos lo indica. La citopenia puede ser general, pancitopenia , o de algn tipo celular concreto: Leucopenia ; recibe este nombre la disminucin del nmero de leucocitos en sangre por debajo de los valores normales, es decir, por debajo de 5000/mm3. Considerando cada tipo de leucocito:
Neutropenia. Eosinopenia. Basopenia. Monocitopenia. Puede aparecer leucopenia en los siguientes casos: infeccin vrica (rubola, varicela, gripe). infeccin bacteriana (brucelosis). intoxicacin por metales pesados (bismuto). intoxicacin medicamentosa por benzol, sulfamidas, terapia citosttica. comienzo de una mononucleosis. consecuencia de exposicin a material radiactivo....etc.
Oligocitemia ; recibe este nombre la disminucin del nmero de glbulos rojos sobre las cifras normales. En hombre valores menores de 4.5x1012/l. En mujeres valores menores de 3.8x1012/l. La disminucin del nmero normal de glbulos rojos es frecuente en anemias carenciales posthemorrgicas, hemolticas, etc. Trombopenia ; recibe este nombre la disminucin del nmero de plaquetas por debajo de los valores normales, es decir, valores inferiores a 150000/ mm3. Es frecuente la aparicin de trombopenia asociada a: la accin txica de medicamentos. radiacin. infecciones vricas (paperas, varicela, rubola) infecciones bacterianas (meningitis meningoccica). alcoholismo agudo.
REVISIN DE LAS TCNICAS. Ante la aparicin de algn tipo de citopenia en el recuento hematolgico, hay que comprobar, en primer lugar el utillaje y las tcnicas utilizadas, prestando especial atencin en contadores electrnicos a: comprobar que no ha habido bloqueo parcial del orificio de contaje (100 micras). comprobar que se ha realizado el recuento de leucocitos despus de completarse la hemlisis, pero en un periodo inferior a 30 minutos.
la recogida y manipulacin de sangre ha sido la adecuada (no hay cogulos). el electrodo exterior estar completamente inmerso en lquido. se lava correctamente el tubo entre sucesivas mediciones. no hay pequeas burbujas de aire en el propio tubo. el manmetro estar limpio interiormente.
Si en la tcnica manual, el recuento de leucocitos nos da valores inferiores a 3000/mm3, hay que volver a repetir el contaje, pero en vez de diluir 1:20, como es habitual, la dilucin se har 1:10. En pacientes anmicos, para el recuento de hemates en cmara, la dilucin en vez de hacerse al 1:200, se har al 1:100. Igualmente si en el contaje de plaquetas, por ejemplo por el mtodo de ReesEcker, se sospecha una cifra muy reducida, la dilucin, en vez de 1:200 se har al 1:100 y se repetir el recuento. PREPARACIN DE UN FROTIS. Tras comprobar lo anterior, y ante la persistencia de citopenia en el hemograma, el siguiente paso a realizar, es la preparacin de un frotis. El frotis se puede realizar por una de las siguientes tcnicas: TINCIN. Para la tincin del frotis, en los estudios de sangre, suelen utilizarse colorantes de anilina de dos tipos: -bsicos como las tiacinas (azul de metileno). -cidos como la eosina. El mtodo de Romanowsky se basa en combinar colorantes cidos y bsicos que tien diferencialmente las estructuras sanguneas. En general utilizan eosinatos de tiacinas. Entre los mtodos de este tipo ms conocidos destacamos: La tincin de Wright. La tincin de Giemsa (ideal para teir parsitos y protozoos del paludismo). La tincin de May-Grmwald. tcnica del portaobjetos. tcnica del cubreobjetos.
PATOLOGAS DE LAS CLULAS SANGUNEAS. En el estudio de la extensin sangunea se buscan anormalidades que ayuden a indicar la naturaleza de la citopenia, sea del tipo que sea. Toda clula sangunea que no coincida con los modelos de normalidad, debe considerarse atpica. La mayor variabilidad en la morfologa de las clulas hemticas tiene lugar en las degeneraciones neoplsicas. ALTERACIONES EN LA SERIE ROJA. VARIACIONES DE TAMAO. En general se conocen bajo el trmino de anisocitosis. Macrocitosis; hemates con tamao de 8 a 11 micras (dficit de vitamina B12 y de cido flico). Microcitosis; hemates con tamao <6 micras (anemia perniciosa). Megalocitosis; hemates con tamao > 11 micras (fisiolgico en recin nacidos y tambin en anemia perniciosa).
ALTERACIONES DE COLOR. Anisocroma; desigual distribucin de a hemoglobina (trasfusiones). Hipocroma; mucha zona plida central por disminucin de la concentracin de hemoglobina (anemia ferropnica). Hipercroma; aumento de la intensidad del color por aumento de la concentracin de hemoglobina. Policromasa; anormal coloracin (azul, gris, rosa) indica inmadurez por produccin acelerada.
ALTERACIONES DE FORMA. Acantocitos; hemates esfricos con prominencias que les dan aspecto de erizo (Uremia, acantocitosis ) Dacriocitos; forma de lgrima (alteraciones eritropoyticas) Dianocitos; aspecto de diana por acmulo de hemoglobina en el centro (talasemia). Drepanocitos o clulas falciformes; forma de hoz o de media luna (anemia falciforme). Eliptocitos; forma oval o en elipse. Esquizocitos; restos de hemates tras su ruptura.
Estomatocitos; presentan hendidura en parte central. Hemates crenados; forma de sierra o rueda dentada. PRESENCIA DE INCLUSIONES
ALTERACIONES ESTRUCTURALES, INTRAERITROCITARIAS.
Punteado basfilo; son acmulos de ARN que se tien de azul con Giemsa (saturnismo). Corpsculos de Heinz; son zonas de hemoglobina desnaturalizada, de ms de 3 micras que se tien de: azul oscuro con sulfato de Nilo. azul claro con azul cresil brillante. prpura oscura con cristal violeta.
Se presentan en alfa-talasemia y tambin en anemias txicas. Anillos de cabot; son restos de membrana nuclear que toman forma de anillo. Se observan en anemia perniciosa e intoxicaciones con plomo. Granulacin azurfila; pueden ser restos del ncleo tras su destruccin, o eritroblastos. Se tien violeta prpura. Corpsculos de Howell-Jolly; son restos de cromatina que se tien con Giemsa de rojo brillante. Indican anemia megaloblstica u otra forma anormal de eritropoyesis. SERIE BLANCA. POLIMORFONUCLEARES NEUTRFILOS. Los neutrfilos sufren alteraciones morfolgicas cualitativas, algunas de las cuales son adquiridas y desaparecen despus que el estmulo que las provoca lo ha hecho. Aumento de los lbulos nucleares; (anemia). Ncleo en anteojo (Pelger-Huet); ncleo con dos segmentos. Es una alteracin autosmica dominante. Corpsculos de Dhle; son restos de ribosomas libres, o del R.E.R. que se tien de color azul plido en el citoplasma.
Granulaciones txicas; son grnulos citoplasmticos de mayor volumen y con coloracin ms intensa de lo normal, que aparecen asociados a procesos infecciosos severos. Grnulos violeta; son grnulos citoplasmticos azurfilos que estn presentes en la anomala de Alder-Reilly. LINFOCITOS. Linfocito activado, presenta mayor tamao y basoflia clara, sin grnulos (estimulacin linfocitaria). Clula Turk; linfocito hiperbasfilo (infeccin vrica). MONOCITOS. A veces aparecen con ncleo grande escotado y presentan vacuolas donde est lo que han fagocitado, otras veces se presentan degenerados. Puede deberse a los anticoagulantes. A veces se observan otras clulas como: Clulas de Reider. Clulas de Turk. Clulas en cesto, etc. SERIE TROMBOCTICA. A. Alteraciones de tamao, podemos encontrar: microtrombocitos. macrotrombocitos. megacariocitos.
B. Alteraciones de forma o dismorfias plaquetarias, aparecen en las trombopatas. C. Alteraciones de distribucin: satelitismo plaquetario; fenmeno en el que se presentan varias plaquetas rodeando a los segmentados. Se da a veces al utilizar EDTA como anticoagulante. agregados plaquetarios; son el comienzo de un trombo.
OTROS TIPOS ANORMALES DE CLULAS. CLULAS LE , O DE HARGRAVES. Son leucocitos polimorfonucleares neutrfilos que presentan un gran cuerpo de inclusin, que desplaza su propio ncleo. Este cuerpo de inclusin es otro ncleo leucocitario destruido por una Ig G o factor LE. Aparecen entre otras enfermedades en el Lupus Eritematoso. SIDEROCITOS. Son hemates que contienen grnulos de hemosiderina. Estos hemates son normales en las clulas precursoras de los hemates de mdula sea, pero no deben aparecer en sangre perifrica. Su presencia en un frotis de sangre indica proceso patolgico.
FRMULA LEUCOCITARIA CELULAR Y RECUENTOS

INTRODUCCIN
SANGUNEA:
DIFERENCIACIN
Nos podemos encontrar diferentes tipos de leucocitos o glbulos blancos en sangre segn sus caractersticas morfolgicas: A) Polimorfonucleares o granulocitos a) Neutrfilos b) Eosinfilos c) Basfilos B) Mononucleares o agranulocitos a) Linfocitos b) Monocitos El estudio del porcentaje de cada uno de ellos es lo que se denomina frmula leucocitaria . A partir de ella y conociendo el nmero total de leucocitos por milmetro cbico de sangre se puede calcular el numero de cada tipo de leucocitos por volumen de sangre.
Figura 1. Tipos de clulas en un frotis de sangre perifrica.
La frmula leucocitaria o recuento diferencial leucocitario se puede hacer de forma manual o de forma automtica. MORFOLOGA DE LOS LEUCOCITOS Vamos a estudiar la morfologa de los leucocitos sobre una extensin sangunea teida. La figura 1 es una representacin arbitraria de un frotis de sangre perifrica, siendo el nmero de leucocitos con relacin a los eritrocitos y trombocitos mayor de lo que suele observarse en un campo microscpico real. En la figura aparecen las siguientes clulas: A: Eritrocitos B: Linfocito grande C y E: Neutrfilos segmentados D: Eosinfilo F: Monocito
G: Trombocitos H: Linfocito I: Neutrfilo en banda J: Basfilo. NEUTRFILOS, POLIMORFONUCLEADOS NEUTRFILOS (PMN), GRANULOCITOS NEUTRFILOS. Son clulas redondeadas de aproximadamente 12 micras de dimetro, ms pequeos que los monocitos y eosinfilos y ligeramente mayores que los basfilos. El citoplasma es abundante y se tie de color rosado. En l hay numerosas granulaciones neutrfilas que se tien de color rosa-azulado y son de pequeo tamao. El ncleo se tie intensamente de azul, es irregular y polilobulado, variando el nmero de lbulos de 2 a 5. Con frecuencia parece que hay varios ncleos separados, pero un anlisis detallado permite observar los finos hilos de cromatina que los une. Esta sera la morfologa de un neutrfilo segmentado. El estado anterior es el neutrfilo en banda o cayado, en los que el ncleo no est todava lobulado y presenta aspecto de S o C. Puede aparecer en sangre, aunque no con frecuencia, algn metamielocito, que es el estado anterior al cayado. Es de mayor tamao y el ncleo presenta forma arrionada. Lo normal es que en la frmula aparezca un 0%. Se puede hacer un recuento de las lobulaciones, de forma que las proporciones normales son: Clulas con 1 lbulo: 6% Clulas con 2 lbulos: 34% Clulas con 3 lbulos: 41% Clulas con 4 lbulos: 17% Clulas con 5 lbulos: 2% Cuando aumenta el nmero de clulas con ncleos polilobulados se habla de una desviacin a la derecha, mientras que cuando aumentan las formas en cayado, metamielocitos o incluso estadios anteriores, se habla de una desviacin a la izquierda. El neutrfilo se origina en la mdula sea y despus de diferentes estadios de maduracin pasa al torrente circulatorio, donde permanecen unas pocas horas (aproximadamente siete) antes de pasar a los tejidos donde realizan su funcin y mueren.
La funcin principal de los neutrfilos es la defensa del organismo contra las infecciones mediante el fenmeno de fagocitosis (motivo por el cual la membrana del neutrfilo emite pseudpodos) La neutrofilia o leucocitosis neutroflica constituye un aumento del resultado absoluto, mientras que la neutropenia representa una disminucin. EOSINFILOS, POLIMORFONUCLERES EOSINFILOS (PME), GRANULOCITOS EOSINFILOS. Los eosinfilos tienen un dimetro medio de 13 micras. La estructura de estas clulas se parece a la de los neutrfilos segmentados, pero con algunas diferencias. El ncleo se tie algo menos y tiene 2 3 lbulos, normalmente 2 dispuestos de forma caracterstica. Las granulaciones citoplasmticas son de mayor tamao, redondas u ovaladas, y con gran afinidad por los colorantes cidos, tindose por tanto de color rojoanaranjado con un colorante que contenga eosina. Los grnulos poseen numerosas enzimas, entre las que destaca la mieloperoxidasa. Los eosinfilos se forman en la mdula sea y despus de diferentes estadios de maduracin pasan a sangre perifrica donde slo permanecen algunas horas (aproximadamente ocho), ya que la mayor parte de la poblacin corporal de eosinfilos se encuentra bajo la capa epitelial en los tejidos expuestos al ambiente externo, como son los conductos nasales, piel y vas urinarias. El papel biolgico de estas clulas es el de modular las reacciones anafilcticas y las reacciones antgeno-anticuerpo en el proceso alrgico. Tambin intervienen en el control de la infestacin por ciertos parsitos, cuyo ataque no se hace por fagocitosis, sino por adherencia y subsiguiente citotoxicidad al segregar diversas sustancias nocivas. La disminucin de los eosinfilos o eosinopenia slo puede detectarse por recuento de gran nmero de clulas. Un aumento en los valores de eosinfilos representa una eosinofilia. BASFILOS, POLIMORFONUCLEARES BASFILOS (PMB), GRANULOCITOS BASFILOS. En general, los granulocitos basfilos son semejantes en tamao a los anteriores. El ncleo es menos irregular y ligeramente lobulado. Las granulaciones del citoplasma son grandes y muy abundantes. Tienen gran afinidad por los colorantes bsicos, apareciendo de color azul oscuro o prcticamente negro. Recubren normalmente toda la clula, por lo que el ncleo resulta difcil de distinguir. Los basfilos son los menos numerosos de los leucocitos en la sangre normal.
Los basfilos se originan en la mdula sea y, despus de diferentes procesos de maduracin, pasan a la sangre perifrica donde realizan su funcin. Los basfilos que se encuentran en los tejidos se denominan clulas cebadas o mastocitos y presentan ciertas diferencias en la composicin de sus grnulos con respecto a los basfilos sanguneos. La funcin de los basfilos es actuar como mediadores en las respuestas inflamatorias, en especial las de hipersensibilidad. El aumento del nmero absoluto de basfilos lo constituye una basofilia o leococitosis basoflica, mientras que el menor recuento absoluto de basfilos lo constituye una basopenia. LINFOCITOS Los linfocitos son clulas mononucleadas pequeas, de aproximadamente 10 micras de dimetro, que carecen de grnulos citoplasmticos especficos. El linfocito tpico presenta un ncleo bien definido que contiene bloques pesados de cromatina. El ncleo ocupa prcticamente toda la clula y tiene forma redonda o un poco dentada. Se tie de color azul oscuro. El citoplasma es escaso y se tie de un color azul plido, exceptuando una zona perinuclear clara, pudiendo aparecer en algunas granulaciones de color rojizo. Se pueden observar linfocitos de mayor tamao, de 12 a 15 micras de dimetro, con ncleos menos densos y citoplasma ms abundante, especialmente en la sangre de los nios, y puede ser difcil de distinguir de los monocitos. Los linfocitos son las principales clulas implicadas en la respuesta inmunitaria, reconociendo por sus receptores de membrana los determinantes antignicos con la colaboracin de otras clulas, como los macrfagos. Un aumento de los valores absolutos se denomina linfocitosis, mientras que una disminucin de estos valores se denomina linfocitopenia. MONOCITOS El monocito es la clula de mayor tamao de la sangre normal con un dimetro medio de 16 micras. Contiene un nico ncleo, generalmente excntrico y con forma redondeada, lobulada o en forma de herradura. Se tie de un azul ms dbil que los linfocitos. El citoplasma es abundante y se tie de un color azul grisceo conteniendo a veces grnulos finos de color entre rojo y prpura, menos diferenciados y pe-
queos que los grnulos de los leucocitos neutrfilos. Ocasionalmente pueden detectarse grnulos de color azul. Los monocitos se producen en la mdula sea para despus pasar a sangre perifrica, donde permanecen entre 4 y 10 horas antes de migrar a los tejidos, convirtindose en ellos en las clulas llamadas macrfagos o histiocitos, donde cumplen su funcin. La funcin principal de los monocitos y macrfagos es la fagocitosis, que realiza de manera semejante a los neutrfilos. Actan como defensa contra microorganismos, en el proceso de la formacin antignica y en la eliminacin de clulas viejas, daadas o tumorales. Adems, el sistema monocito-macrfago desempea un papel principal en la iniciacin y regulacin de la respuesta inmunitaria. El aumento y disminucin de sus valores se denominan monocitosis y monocitopenia respectivamente. VALORES DE REFERENCIA. El nmero total de leucocitos oscila en condiciones normales segn la edad, variando desde el nacimiento hasta los 16 aos, a partir de los cuales las cifras se estabilizan dentro de unos mrgenes de normalidad. Asimismo, el porcentaje normal de los distintos tipos de leucocitos vara tambin con la edad (Tabla 1) RN 1 MES 4 AOS 6 AOS Neutrfilo 37-57% 25-35% 25-45% 45-50% Cayados 0-4% 0-4% 0-4% 0-4% Eosinfilos 1-5% 1-5% 1-5% 1-5% Basfilos 0-2% 0-2% 0-2% 0-2% Monocitos 4-10% 4-10% 4-10% 4-10% Linfocitos 25-35% 45-65% 40-60% 40-45% 3 Leucocitos/mm 9.0005.0005.5005.00030.000 21.000 15.500 14.500 Tabla 1. Valores de leucocitos en sangre perifrica. ADULTO 50-65% 0-4% 1-5% 0-2% 4-10% 25-40% 4.00010.000
FRMULA LEUCOCITARIA O RECUENTO DIFERENCIAL LEUCOCITARIO (RDL) El recuento diferencial leucocitario se puede realizar de forma manual al microscopio o de forma automtica. RECUENTO DIFERENCIAL LEUCOCITARIO MANUAL Consiste en determinar el porcentaje de cada tipo de leucocitos por observacin directa al microscopio de un frotis sanguneo teido. Cuanto mayor sea el nmero de clulas contadas, mayor ser la exactitud del resultado.
Se entiende por frotis o extensin sangunea la formacin de una fina pelcula de sangre sobre una superficie, generalmente un portaobjetos, de forma que pueda ser observada al microscopio sin que las clulas se superpongan entre s. Una vez preparado y secado el frotis, debe ser fijado y teido para poder diferenciar los distintos tipos celulares. Los colorantes ms comnmente utilizados para las tinciones hematolgicas son los derivados de la anilina, colorantes de Romanowsky, que pueden combinar colorantes cidos (eosina), bsicos (azul de metileno) y neutros. Las distintas estructuras celulares se teirn con el colorante de pH antagnico. As, los colorantes cidos teirn las estructuras bsicas como la hemoglobina o los grnulos de los leucocitos eosinfilos y los colorantes bsicos teirn estructuras cidas como el ADN o los grnulos citoplasmticos basfilos. Las estructuras neutrfilas sern aquellas que tienen afinidad por ambos tipos de colorantes. Existen diversos mtodos de tincin, como por ejemplo: el mtodo de Wright, el mtodo de Giemsa, el mtodo de May-grmwald-Giensa o el mtodo del panptico rpido. A la hora de hacer el recuento diferencial de leucocitos hay que tener en cuenta que la distribucin de las clulas no es uniforme. Las clulas grandes (monocitos y neutrfilos) se sitan en los bordes, mientras que las clulas pequeas (linfocitos) lo hacen en el centro de la extensin. Por esta razn, en el recuento se debe seguir una trayectoria que cubra todas las partes de la extensin. Antes de comenzar el recuento se evala si la extensin ha sido bien realizada, si la distribucin de las clulas es uniforme, y su tincin, satisfactoria. Se examina la extensin al microscopio con bajo aumento, para observar si la distribucin celular y la tincin es buena; se cambiar a un objetivo de inmersin para la identificacin de los distintos tipos celulares. El registro de los distintos tipos de leucocitos se puede realizar utilizando aparatos registradores especficos para frmulas leucocitarias o bien manualmente, anotando cada una de las clulas aparecidas en un papel. A medida que se va viendo un leucocito, ste se clasifica, hasta haber contado un nmero determinado de leucocitos. Cuanto ms elevado es este nmero, mayor es la precisin, aunque por razones prcticas normalmente se realizan recuentos de 100 200 clulas. Todos los leucocitos que no puedan clasificarse deberan agruparse conjuntamente en un grupo no identificado. En algunas alteraciones, especialmente en la leucemia, pueden detectarse muchos de estos leucocitos no identificados. Con el nmero total de leucocitos por mm3 y el tanto por ciento de cada tipo, se puede hallar el valor absoluto para cada uno de ellos.
RECUENTO DIFERENCIAL LEUCOCITARIO AUTOMATIZADO El recuento diferencial leucocitario es una de las determinaciones ms solicitadas al laboratorio de anlisis clnicos, por ello, unos resultados exactos y precisos son de vital importancia. Actualmente, la automatizacin permite mejorar la especificidad, la exactitud, disminuir los errores y abaratar los costes de los recuentos diferenciales de leucocitos En los sistemas disponibles hasta la fecha, se han utilizado dos principios generales: a) los sistemas de elaboracin digital de la imagen, que identifican por ordenador las clulas sobre extensiones sanguneas teidas. b) los sistemas de flujo continuo, que analizan las clulas suspendidas en un lquido y utilizan la medida de diferentes propiedades de los leucocitos. Se basan en: Medida de la impedancia y de la conductividad celular que informarn sobre el tamao de la partcula y su estructura celular interna. Medida de la dispersin de la luz lser o halgena. Utilizacin de tcnicas citoqumicas sobre la suspensin leucocitaria y estudio de las distintas poblaciones leucocitarias por mtodos pticos. ANLISIS DIGITAL DE IMAGEN Se basa en la identificacin de los leucocitos mediante anlisis con ordenador de las imgenes, de frotis sanguneos teidos, obtenidas al microscopio. La extensin de sangre, uniformemente teida, se coloca sobre la platina de un microscopio. El movimiento de la platina es controlado mediante ordenador. De esta forma se recorre la superficie del frotis y el ordenador detiene el movimiento cuando encuentra un leucocito en su campo de visin. Las imgenes pticas (tamao, color, grnulos citoplasmticos, etc.) son registradas por una cmara de televisin y digitalizadas por el ordenador, que compara las caractersticas de la clula con una memoria en la que se incluyen las caractersticas correspondientes a los distintos tipos celulares. Si las caractersticas coincidencon las de un tipo celular normal, se identifica como tal; de lo contrario, se clasifica como desconocido. Las coordenadas de estas ltimas clulas son archivadas, para que el tcnico las pueda clasificar. Los leucocitos son clasificados en cinco categoras: polinucleares neutrfilos (segmentados y no segmentados), linfocitos, monocitos, polinucleares eosinfilos y polinucleares basfilos. Algunos sistemas son capaces de captar otros
elementos celulares que eventualmente pueden aparecer en sangre perifrica como mielocitos, metamielocitos, promielocitos, clulas plasmticas, linfocitos atpicos o blastos. Estos sistemas identifican los leucocitos en base a aspectos morfolgicos, por lo que adems de requerir clulas perfectamente conservadss necesitan una muy pequea variacin tintorial para evitar la clasificacin errnea de clulas. Es por ello de gran importancia el empleo de sistemas de realizacin de frotis sanguneos adecuados, para la obtencin de preparaciones homogneas y con la mayor similitud tintorial. Se recomienda, por ello, la utilizacin de sistemas automticos de tincin. Junto a la frmula leucocitaria, muchos de estos contadores proporcionan adems informacin sobre morfologa de glbulos rojos y cuantificacin de plaquetas. Este mtodo es el ms parecido al mtodo microscpico convencional, pero tiene grandes inconvenientes como su bajo rendimiento, tanto por el nmero de clulas analizadas, como por su escasa velocidad en la clasificacin de las mismas, aunque actualmente se estn consiguiendo velocidades aceptables. SISTEMAS DE FLUJO CONTINUO El recuento y anlisis de clulas sanguneas se hacen en aparatos cuyo principio de funcionamiento se basa en uno o en los dos principios que sealamos: a) Resistencia elctrica por impedancia . Con el mtodo de la resistencia elctrica, las clulas en suspensin pasan a travs de una apertura situada entre dos electrodos, entre los que existe una corriente elctrica continua de intensidad constante; cada clula al pasar produce un incremento momentneo de la resistencia elctrica que se traduce en un impulso elctrico. El nmero de pulsos generados es proporcional al de clulas que pasan. La amplitud de cada pulso es proporcional al volumen celular (Figura 2.)
Figura 2. Dispositivo de recuento por impedancia
b) Difraccin de la luz en citometra de flujo, con o son citoqumica. El mtodo de la difraccin de la luz en citometra de flujo se basa en iluminar con un haz de luz lser o halgena un flujo por el que pasan alineadas una suspensin celular. El paso de las clulas dispersa la luz. La medida de la dispersin de la luz en dos ngulos diferentes hace posible la determinacin del volumen celular (Figura 3.)
Figura 3. Mtodos de dispersin de la luz.
Todos los aparatos, sea cual fuere el mtodo de medida empleado, estn dotados de un sistema de preparacin de las muestras: realizan una aspiracin de sangre total (0,2-0,3 ?l) que es alicuotada, diluida y distribuida en dos circuitos independientes: uno para el anlisis de hemates y plaquetas y otro para leucocitos y hemoglobina. El recuento de leucocitos se realiza al medir en el circuito correspondiente, con los hemates lisados, los volmenes de las partculas y en algunos instrumentos tambin al medir la actividad mieloperoxidasa. Vamos a estudiar a continuacin los siguientes sistemas de flujo continuo:
a) Sistemas de anlisis del volumen leucocitario b) Mtodos de difraccin de la luz en citometra de flujo c) Analizadores que incorporan modificaciones de una o ambas tecnolo-
gas d) Analizador NE-800 SISTEMAS DE ANLISIS DEL VOLUMEN LEUCOCITARIO Los autoanalizadores diferenciales basados en este principio pueden obtener las poblaciones leucocitarias por anlisis de los volmenes del ncleo previa eliminacin del citoplasma mediante un agente lisante (Sistemas Coulter) o mediante anlisis de los volmenes de las clulas intactas (serie ELT de Ortho).
Generalmente, el histograma de distribucin de los glbulos blancos no representa el volumen de los leucocitos en la sangre circulante, sino el resultante tras la accin de un agente lisante. Este agente acta al mismo tiempo sobre la membrana y el citoplasma de las clulas, lo que provoca alteraciones diferentes segn el tipo de clula. Los linfocitos aparecen ms pequeos que los monocitos y estos ms pequeos que los granulocitos. De hecho, la posicin de las clulas en la curva de distribucin viene determinada por la morfologa del ncleo: a) A la izquierda las clulas con un ncleo esfrico: los linfocitos. b) En la zona central los monocitos, cuyo ncleo suele presentar una o varias hendiduras. c) A la derecha, los granulocitos con el ncleo menos segmentado seguido de los polinucleares. En el histograma de distribucin pueden diferenciarse tres picos, cada uno de los cuales corresponden a un tipo celular. De aqu que se les conozca tambin como sistemas de tres poblaciones (Figura 4). a) Linfocitos: en el pico comprendido entre 35 y 90 fl. b) Mononucleares: entre 90 y 160 fl. c) Granulocitos: entre 160 y 450 fl. El aparato proporciona una cifra global de granulocitos, ya que no puede distinguir entre neutrfilos, eosinfilos y basfilos. Esta frmula de tres poblaciones puede considerarse como una frmula orientativa. Cuando el aparato advierte una distribucin celular anmala, lo indica sealando unas alarmas.
Figura 4. Histograma normal de la serie blanca.
METODOS DE DIFRACCION DE LA LUZ EN CITOMETRIA DE FLUJO Los aparatos que usan este procedimiento son los denominados H1, H2 y H3 de la casa Technicon. Estos sistemas obtienen el anlisis diferencial de leucocitos de acuerdo con su tamao, su comportamiento citoqumico ante determinados colorantes y su actividad mieloperoxidasa. Estos aspectos son analizados y comparados por la parte informtica del aparato para producir unos resultados precisos, exactos y fiables.
De estos parmetros se obtienen los datos referentes a cuatro poblaciones leucocitarias: linfocitos, monocitos, neutrfilos y eosinfilos. Y adicionalmente dos poblaciones ms: las grandes clulas inmaduras (LUC) y los linfocitos atpicos (Figura 5.)
Figura 5. Citograma de peroxidasa.
En la figura 5 aparece un citograma de peroxidasa, donde en la casilla A aparecen los linfocitos, los ms pequeos y desprovistos de actividad peroxidasa. En la casilla B se encuentran los monocitos, ligeramante mayores y con ligera actividad peroxidasa. En la casilla C se encuentra la poblacin ms numerosa, los neutrfilos, mayores y cargados de peroxidasa. Los eosinfilos, de menor tamao y muy cargados de peroxidasa se encuentran en la casilla D. Y por ltimo, en la casilla E aparece un tipo celular adicional, son los LUC o grandes clulas no teidas: son clulas normalmente presentes en la sangre en una pequea proporcin, como linfocitos grandes hiperactivos y todas las clulas patolgicas sin actividad peroxidasa (linfoblastos, mieloblastos, tricoleucocitos,) Los basfilos son detectados en un canal independiente (canal de lobularidad). Mediante un reactivo lisante, son destruidas las membranas de todos los leucocitos excepto las de los basfilos (Figura 6.)
Figura 6. Citograma de basfilos
La peroxidasa es una enzima contenida en el citoplasma de todos los leucocitos, en cantidad variable, excepto en los linfocitos, y esta caracterstica es utilizada para la obtencin de la frmula leucocitaria clsica.
Para la correcta comprensin de los histogramas por esta tecnologa, se ha de tener en cuenta que las clulas linfoides son peroxidasa negativas y de volumen pequeo. Los monocitos son mayores que los linfocitos y ms ricos en peroxidasa. Los neutrfilos son mayores que los linfocitos y con mucha peroxidasa. La peroxidasa aparece en los promielocitos y aumenta progresivamente conforme se completa la maduracin de la serie mieloide. Los eosinfilos poseen mucha peroxidasa. Los basfilos son peroxidasa negativos. En el citograma de peroxidasa los linfocitos se sitan abajo y a la izquierda. Los monocitos arriba de los linfocitos y hacia la derecha. Los neutrfilos ocupan la parte central del citograma. Los eosinfilos se sitan debajo de los neutrfilos. Las clulas LUC ocupan la zona superior izquierda del citograma. En el citograma de basfilos en la zona derecha se sita los neutrfilos. En la zona izquierda los mononucleares y en la zona de arriba los basfilos. Las clulas blsticas se situaran a la izquierda de las mononucleares. ANALIZADORES QUE INCORPORAN MODIFICACIONES DE UNA O AMBAS TECNOLOGAS Es el caso del analizador Coulter STKS, que mide: 1. 2. 3. 4. Volumen celular por el principio de la variacin de la impedancia Conductividad celular por medio de una corriente de alta frecuencia Estructura celular por la difraccin de la luz lser monocromtico Estos tres parmetros son integrados y analizados conjuntamente en un sistema de tres ejes.
De esta manera se consigue una diferenciacin celular en cinco poblaciones: linfocitos, monocitos, basfilos, neutrfilos y eosinfilos, as como detectar poblaciones anormales: blastos, linfocitos atpicos, granulocitos inmaduros, bandas, La tecnologa VCS mantiene los leucocitos en un estado casi nativo y efecta una lectura en tres dimensiones. Los resultados se pueden examinar en tres planos: DF1, DF2 y DF3, siendo el ms usado el DF1, por ser donde se visualizan mejor todas las poblaciones. En la figura 7 se aprecian los resultados vistos desde tres ngulos, donde 1: Neutrfilos, 2: Linfocitos, 3: Monocitos, 4: Eosinfilos y 5: Basfilos.
Figura 7. Resultados vistos desde tres ngulos
La localizacin de poblaciones anormales se aprecia en la figura 32.8, donde: 1: Sospecha de blastos; 2: Granulocitos inmaduros, 3: Neutrfilos envejecidos, 4: Plaquetas gigantes, 5: Eritroblastos, 6: Linfocitos atpicos, 7: Sospecha de blastos, 8: Linfocitos no definidos y 9: Sospecha de blastos.
Figura 8. Localizacin de poblaciones anormales.
ANALIZADOR NE-800 En el analizador NE-800 se sustituye el haz de luz por una corriente elctrica, bien directa o de radiofrecuencia. Este analizador utiliza tres canales y tres hemolizantes diferentes, especficos para separar cinco poblaciones celulares. Estas clulas son analizadas por los mtodos de Radio Frecuencia (RF) y Corriente Directa (CD) que realiza un scattegrama tridimensional que se visualiza en pantalla, expresndose los datos de RF en el eje de ordenadas y los de CD en el de abcisa, discriminndose las poblaciones celulares de los hemates lisados y separndose tres poblaciones: linfocitos, monocitos y granulocitos. La determinacin de neutrfilos y basfilos se hacen por canales independientes, utilizndose hemolizantes diferentes y selectivos para cada una de estas poblaciones, controlndose el tiempo y temperatura de la reaccin con el hemolizante. Los neutrfilos se determinan mediante la frmula: Neutrfilos = granulocitos - (eosinfilos + basfilos).
Los hemates y plaquetas se analizan mediante el mtodo de corriente directa. Este analizador proporciona de cada muestra un mensaje positivo o negativo. El mensaje negativo significa que todos los parmetros de cada muestra estn dentro de los lmites considerados normales, no necesitando la muestra ninguna verificacin adicional. Un mensaje positivo indica que la muestra excede los lmites aceptables y requiere posterior investigacin y estudio El analizador proporciona un scattegrama, donde se representan los linfocitos, monocitos, granulocitos y clulas anormales, en reas diferentes, segn la figura 8 donde: L: Linfocitos normales M: Monocitos G: Granulocitos 1. Blastos: por debajo de la situacin normal de linfocitos y granulocitos 2. Granulocitos inmaduros: por debajo y hacia la derecha de la situacin normal de los granulocitos. 3. Cayados: por debajo y hacia la derecha de los granulocitos normales. 4. Eritroblastos: en la zona de los estromas de los hemates. 5. Linfocitos atpicos: entre la zona de linfocitos normales y monocitos. 6. Agregados plaquetarios: Siguiendo, por arriba, la lnea divisoria del scattegrama.
Figura 8. Analizador NE-800 Junto al scattegrama, tambin nos presenta tres histogramas: de WBC, de eosinfilos y de basfilos.
TEMA 9. COAGULACIN: REALIZACIN TCNICA Y MEDICIN DEL TIEMPO DE PROTROMBINA, TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADA Y FIBRINGENO
INTRODUCCIN
CONCEPTO DE HEMOSTASIA
La hemostasia es el proceso encargado de prevenir la extravasacin sangunea espontnea, evitar la hemorragia excesiva a nivel de los vasos lesionados y mantener la fluidez de la sangre circulante. El mantenimiento de una hemostasia normal requiere el correcto funcionamiento de cuatro factores: a) pared vascular; b) funcin plaquetaria; c) coagulacin sangunea; y d) fibrinolisis. La alteracin de uno slo de ellos es siempre causa de patologa. De forma resumida, el proceso de la hemostasia es como sigue: Al producirse la lesin vascular, el vaso afectado se contrae transitoriamente, disminuyendo el paso de sangre a su travs (reaccin vascular). A continuacin, las plaquetas circulantes se adhieren al colgeno del tejido subendotelial, que queda expuesto debido a la lesin, y liberan adenosn-difosfato (ADP), lo que facilita la agregacin y formacin de un trombo plaquetario (funcin plaquetaria). Este trombo detiene momentneamente la hemorragia, siendo primero reforzado y luego sustituido por la formacin de fibrina (coagulacin sangunea o plasmtica). Finalmente se inicia la cicatrizacin de la herida vascular, a la vez que la fibrina es degradada por un sistema enzimtico (fibrinolisis).
COAGULACIN PLASMTICA
El proceso de coagulacin sangunea consiste en una serie de reacciones enzimticas donde cada factor de la coagulacin es la enzima del inmediatamente inferior y el sustrato del inmediatamente superior (reaccin en cascada). Este proceso continua hasta que el fibringeno se transforma en fibrina, lo que provoca la modificacin del estado fsico de la sangre, que pasa de un estado lquido a un estado de gel (la red de fibrina insoluble encierra entre sus mallas a los elementos formes de la sangre y refuerza el trombo plaquetario para detener de forma definitiva la hemorragia). En la coagulacin sangunea se pueden distinguir tres grandes etapas: a) activacin de la protrombina; b) formacin de la trombina; y c) formacin de la fibrina.
El activador de la protrombina es un complejo lipoprotico formado por el factor X, el factor V, el factor 3 plaquetario (fosfolpido) y los iones Ca++. La activacin previa del factor X puede realizarse a travs de 2 vas diferentes: va extrnseca y va intrnseca. VA INTRNSECA
FOSFOLPIDOS
VA EXTRNSECA
TROMBOPLASTINA TISULAR
F XII
F XIIa FVIIa FXI FXIa FVII
FX
FIX FIXa
Ca++
FVII FV
FXa PROTROMBINA F II F IIa
TROMBINA
FIBRINGENO
FIBRINA
La coagulacin se limita a la zona de la lesin vascular gracias a la existencia de inhibidores fisiolgicos, que neutralizan a los factores de la coagulacin activados. Los ms importantes son antitrombina III o cofactor de la heparina, 2macroglobulina, 1-antitripsina, y protenas C y S. Fibrinolisis Una vez que el trombo de fibrina ha cumplido su funcin hemosttica, es destruido mediante la fibrinolisis, proceso fisiolgico que se realiza gracias a la plasmina, proteasa activa que se origina a partir de un precursor plasmtico inactivo: el plasmingeno.
FIBRINA
tPlasmingeno u-
Plasmina
Plasmina
Productos de degradacin de la Fibrina. (D-D)
EXPLORACIN DE LA COAGULACIN PLASMTICA Toda trastorno de la hemostasia primaria, debido generalmente a una plaquetopenia, estando el tiempo de sangra excesivamente alargado. Si el recuento de plaquetas y el tiempo de sangra son normales, hay que considerar la posible existencia de hemorragia es el resultado de una alteracin vascular, plaquetaria o de los factores plasmticos de la coagulacin. En el diagnstico de los trastornos hemorrgicos es fundamental la orientacin clnica, que dirigir la exploracin hacia uno de los factores citados. Ante un paciente que sangra se debe pensar en la existencia de un defecto en algn factor de la coagulacin. La exploracin de la coagulacin sangunea se basa en la realizacin de dos pruebas globales: el tiempo de protrombina (TP) y el tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA), que se complementan con una valoracin de la fibrinoformacin mediante la determinacin funcional del fibringeno o la realizacin del tiempo de trombina (TT). Sobre la base de los resultados de estas pruebas podemos realizar una aproximacin diagnstica, cuya confirmacin puede requerir la determinacin especfica de factores de la coagulacin.
Aunque actualmente la casi totalidad de las pruebas de coagulacin se realizan mediante coagulmetros semiautomticos, las tcnicas las describiremos de una forma general aplicable a cualquier mtodo. Todas ellas se realizan a partir del plasma, en el que se ha bloqueado el desarrollo de la coagulacin mediante un agente capaz de eliminar el Ca++: citrato u oxalato. Las pruebas se inician mediante la adicin de la suficiente cantidad de Ca++ y del agente activador de la coagulacin correspondiente a la etapa de sta que se desee explorar, midiendo el tiempo necesario para la formacin del cogulo. Una anomala en alguna de estas pruebas bsicas puede deberse a dos tipos de causas: presencia de un anticoagulante circulante y/o dficit de uno o varios factores de la coagulacin. OBTENCIN DE LAS MUESTRAS PARA PRUEBAS DE COAGULACIN 1. La toma de sangre se realizar por puncin venosa limpia, no debiendo existir un xtasis prolongado por torniquete. 2. Se puede emplear jeringuilla o dispositivos para tubos al vaco. Si hay que extraer ms de una jeringuilla o tubo, se aconseja que el destinado al estudio de la coagulacin no sea el primero. 3. Se utilizarn tubos de plstico o de vidrio siliconado que contengan citrato sdico a concentracin de 0,1 mol/L, una parte de citrato por cada 9 partes de sangre. Una vez introducida la sangre, se mezclan suavemente sin producir espuma. 4. La sangre anticoagulada se centrifuga durante 10-15 minutos a 3.000 r.p.m. El plasma sobrenadante se pipetea cuidadosamente en otro tubo de plstico o siliconado. 5. Debe analizarse en las 2 horas siguientes a la extraccin (aunque puede conservarse hasta 4 horas a 4 C). Si no, congelar a -20 C hasta su procesamiento. La conservacin prolongada a temperatura ambiente conlleva una inactivacin parcial de los factores V y VIII, mientras que la refrigeracin prolongada activa el factor VII. Normas generales para la realizacin manual de las pruebas de coagulacin: A) MATERIAL 1. 2. 3. 4. Bao Mara a 37 C muy preciso. Tubos estndar de hemlisis de plstico (70 10 mm). Pipetas automticas de 100 y 200 L. Cronmetros contrastados.
B) REALIZACIN DE LA PRUEBA 1. Introducir el plasma en dos tubos de hemlisis e incubar 2 minutos a 37 C en el bao Mara. 2. Aadir los reactivos en el orden y con los intervalos que sealen las tcnicas concretas, agitando suavemente el tubo para su mezcla. 3. La adicin del ltimo reactivo a la mezcla debe ser brusca e instantnea, poniendo simultneamente en marcha el cronmetro. Inmediatamente agitar suavemente para mezclar y dejar el tubo en el bao un breve tiempo, variable segn la duracin normal de la prueba; luego mover rtmicamente el tubo, bajo una correcta fuente de luz, hasta ver aparecer la fibrina, momento en el que se detiene el cronmetro. 4. Las pruebas se realizarn por duplicado y la diferencia entre dos determinaciones ser siempre inferior a 1 segundo; de lo contrario se realizar una nueva determinacin. 5. Simultneamente a la valoracin de la muestra debe realizarse la de un plasma control obtenido de una mezcla de plasmas frescos de 15 20 sujetos sanos o de una mezcla similar liofilizada (comercial). Causas de error A) EN LA OBTENCIN DEL PLASMA: a) xtasis venoso demasiado prolongado. Favorece la fibrinolisis local. b) Puncin venosa inadecuada. c) Dilucin errnea del plasma. Proporcin sangre-anticoagulante inexacta. d) Tiempo de centrifugacin inadecuado. e) Presencia de hemlisis en el plasma. f) Conservacin muy prolongada del plasma antes de realizar la prueba. B) EN LA REALIZACIN DE LA TCNICA: a) b) c) d) e) f) g) Errores de pipeteo Empleo de reactivos inadecuados o caducados Empleo de reactivos mal preparados Empleo de una temperatura inadecuada Tiempos de incubacin inexactos Empleo de agua no destilada Errores en la realizacin de la tcnica
TIEMPO DE PROTROMBINA: Valoracin global de la va extrnseca: A) PRINCIPIO El tiempo de Quick o de protrombina (TP) es el tiempo necesario para la coagulacin de un plasma recalcificado en presencia de un exceso de tromboplastina hstica. Explora fundamentalmente la funcin de la va extrnseca de la coagulacin (especficamente el factor VII y tambin los factores V y X), as como la funcin de la protrombina (factor II) y del fibringeno (Factor I). B) MATERIAL a) b) c) d) Tromboplastina clcica comercial. Plasma citratado del paciente. Plasma citratado control. Coagulmetro o equipo para la determinacin manual.
La tromboplastina hstica se prepara a partir de extractos de cerebro o pulmn humanos o de tejidos animales, fundamentalmente de conejo. Existen muchas tromboplastinas comerciales preparadas a partir de tejidos animales, cuya sensibilidad suele variar segn la firma comercial que la prepara, por lo que la OMS elabor un patrn de referencia internacional a partir de cerebro humano (actualmente considerado como patrn primario), y tambin patrones a partir de tejidos bovino y de conejo. Estos ltimos deben utilizarse para verificar la calidad y sensibilidad de los diferentes preparados comerciales, en los que adems debe venir indicado su ndice internacional de sensibilidad (ISI), calculado en relacin al del patrn de referencia internacional, que se considera de 1,0. El ndice Internacional de Sensibilidad (ISI) es el valor de la recta de regresin de los tiempos de protrombina de pacientes anticoagulados obtenidos con la tromboplastina comercial y con la tromboplastina de referencia internacional. Para los estudios de carcter diagnstico es conveniente utilizar una tromboplastina simple de buena sensibilidad (ISI cercano a 1). Para el control del tratamiento anticoagulante esta recomendacin se hace imperativa, existiendo tromboplastinas simples o combinadas (aportan fibringeno y factor V) de muy alta sensibilidad.
C) MTODO Precalentar la tromboplastina reconstituida, a 37 C durante 10-15 minutos. Introducir 0,1 mL (100 L) de PPP del paciente en un fibrotubo, y 0,1 mL de PPP control en otro fibrotubo, e incubar 2 minutos a 37 C. *Aadir 0,2 mL de tromboplastina clcica, a la vez que se dispara el cronmetro. Medir en segundos el tiempo que tarda en aparecer el cogulo. D) INTERPRETACIN DEL RESULTADO Los resultados se expresan en segundos, acompaados del TPNM, y se aconseja aadir la razn o cociente tiempo del paciente /TPNM, para una ms fcil interpretacin. El Tiempo de Protrombina Normal Medio (TPNM) es el valor correspondiente al plasma control. Tambin es conveniente indicar la marca de la tromboplastina utilizada por la gran variabilidad en la sensibilidad entre dos distintos reactivos comerciales. Cuando la tromboplastina tiene una calidad idnea, debe suministrar un tiempo de Quick para plasmas normales (plasma testigo) de 12 a 14 segundos. La aplicacin de la prueba a un nmero elevado de sujetos presuntamente libres de alteraciones de la coagulacin, como ocurre en los grandes laboratorios, permite corregir ligeras desviaciones en el TPNM. Para ello se toma el valor de la razn de un mnimo de 50 individuos sin patologa coagulativa, se eliminan los resultados que se hallen fuera de 2DE, se establece de nuevo la media y se calcula el nmero por el cual sta debera multiplicarse para que su valor fuera exactamente 1,0.
6 Valor inverso de las diluciones 20 Actividad de Protrombina (%)
25
33
50
1 10 20 30 40 50 60 Tiempo de coagulacin (segundos)
100
Figura 1
Este nmero es el factor por el que debern multiplicarse todos los resultados que se obtengan (mientras no se cambien las condiciones de trabajo o el lote del reactivo) para que realmente se adapten a la poblacin atendida en dicho laboratorio. Para expresar el resultado en porcentaje de actividad hay que elaborar una curva de calibracin (Figura 1) a partir de diluciones en tampn citratado del plasma testigo, considerando como 100% el plasma sin diluir (Tabla 1). El tiempo en segundos obtenido del plasma problema se lleva a la curva de calibracin y obtenemos la actividad global en % (actividad protrombnica). El plasma testigo empleado para realizar la curva est generalmente constituido por una mezcla de plasmas normales obtenidos a partir de 15 a 20 donantes sanos. La curva debe volver a realizarse cada vez que se emplee un nuevo lote de tromboplastina, ya que sta puede hacer variar ligeramente el valor de los testigos. concentracin 100 % 50 % suero fisiolgi- 0 0,5 mL co o tampn Owren plasma control 1 mL 0,5 mL 25 % 0,5 mL 12,5 % 0,5 mL
0,5 mL de la dilucin anterior
0,5 mL de la dilucin anterior
Tabla 1: Llevando los tiempos y las concentraciones a un papel semilogartmico se obtiene una recta (Curva de calibracin: Figura 1). La determinacin del TP se utiliza: Para comprobar la normalidad de la va extrnseca y comn de la coagulacin. Como indicador de la funcin heptica (ya que la mayor parte de los factores de la coagulacin son de sntesis heptica). Para controlar los tratamientos con anticoagulantes orales. Si el TP est alargado, se realiza un TP de la mezcla a partes iguales de plasma del paciente con plasma control. Si corrige (es decir, si el TP se normaliza), indica un dficit de factores. Si no corrige indica la presencia de anticoagulante (heparina, endgena o exgena, o PDF).
TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADA: Valoracin global de la va intrnseca:
A) PRINCIPIO El tiempo de cefalina o TTP es el tiempo necesario para la coagulacin de un PPP recalcificado en presencia de cefalina (mezcla de fosfolpidos). Si adems de la cefalina se aade una sustancia que facilite la activacin del sistema de contacto (caoln, celite u otras), se le denomina tiempo de cefalina activado o TTPA. El TTPA explora la va intrnseca y comn de la coagulacin (factores XII, XI, IX, VIII, V, X y II). B) MATERIAL a) Cefalina activada (extracto fosfolipdico para la realizacin del TTPA que contiene un activador del sistema de contacto: silicato en suspensin o cido elgico). b) Solucin de cloruro clcico 25 mmol/L. c) Plasma citratado del paciente. d) Plasma citratado control (mezcla de 10 ms plasmas de donantes sanos) preparado en el laboratorio o comercial. e) Coagulmetro o equipo para la determinacin manual. C) MTODO En dos tubos de hemlisis se introducen 0,1 mL de PPP del paciente y del control, respectivamente. A continuacin se aaden 0,1 mL de la suspensin de cefalina y la mezcla se deja incubar durante 2 3 minutos a 37 C (segn las instrucciones del reactivo). Finalmente se aaden 0,1 mL de CaCl2 (equilibrado a 37 C) a la vez que se dispara el cronmetro Se mide el tiempo necesario para el inicio de la formacin del cogulo. D) INTERPRETACIN DEL RESULTADO Se da el resultado del tiempo en segundos de paciente y control y se aconseja acompaarlo del cociente paciente/control para una ms fcil interpretacin, especialmente cuando se destina al control del tratamiento con heparina. El tiempo normal vara segn la mezcla de cefalina-activador utilizado y generalmente oscila entre 30 y 35 segundos para el plasma normal. Para
corregir pequeas desviaciones en el valor del plasma control se procede de forma similar a como se indic en el TP.
El TTPA se utiliza: Para el estudio global de la coagulacin, junto al TP. Para valorar la existencia de dficit de factores de la coagulacin: Un alargamiento respecto al control indica una alteracin de los factores antihemoflicos (VIII y IX), de los del sistema de contacto (XI y XII) o de los factores pertenecientes a la va comn (V, X y II). Para monitorizacin de la terapia con heparina. Si el TTPA est alargado, hay que realizar un nuevo TTPA de una mezcla apartes iguales de plasma del paciente y plasma control. Si no corrige significa la presencia de heparina o anticoagulante circulante. Si corrige indica un dficit factorial, y entonces hay que valorar conjuntamente TP y TTPA: TP Normal Alterado Alterado TTPA Alterado Normal Alterado Factor deficitario VIII, IX, XI, XII VII X, V, II
Si el TP y el TTPA estn alargados, hay que valorar el N de plaquetas y el fibringeno para descartar una coagulopata de consumo. Dosificacin del fibringeno: Puede realizarse mediante tres procedimientos: ponderal, precipitacin por el calor y medida del tiempo de coagulacin. Este ltimo es el ms preciso y el ms utilizado, valorando el fibringeno funcional. La determinacin inmunolgica por inmunodifusin radial ofrece una buena precisin y existen dispositivos comerciales que hacen muy simple la prueba. La valoracin turbidimtrica a partir del cogulo obtenido en el TP, que ofrecen algunos coagulmetros, proporciona resultados aceptables en el screening, especialmente dentro del intervalo de normalidad. MTODO PONDERAL: PRINCIPIO E INTERPRETACIN DE RESULTADOS Se coagula el fibringeno contenido en un volumen determinado de plasma. El cogulo se lava, se seca y se pesa, obtenindose la cifra de fibringeno en g/L. La cifra normal de fibringeno vara entre 2 y 4 g/L, considerndose que existe hipofibrinogenemia cuando es inferior a 1,5 g/L, e hiperfibrinogenemia si es superior a 6 g/L.
MTODO DE LA PRECIPITACIN MEDIANTE CALOR: PRINCIPIO E INTERPRETACIN DE RESULTADOS El fibringeno humano precipita a 56 C. La medida de la altura del precipitado despus de su centrifugacin es proporcional a su concentracin en el plasma. Es un mtodo poco preciso, pero rpido y orientativo. Es importante tener en cuenta que los productos de degradacin de la fibrina (PDF) precipitan tambin a 56 C y pueden falsear los resultados. MTODO DE LA MEDIDA DEL TIEMPO DE COAGULACIN (Mtodo de Von Clauss) A) PRINCIPIO En presencia de concentraciones elevadas de trombina y baja concentracin de fibringeno, el tiempo de coagulacin es proporcional a la tasa de fibringeno. B) MATERIAL a) PPP del paciente (sangre total con citrato sdico 0,1 mol/L, centrifugada 10-15 min. a 3.000 r.p.m.). Se puede guardar refrigerada no ms de 3-4 horas. b) Tampn veronal-acetato, pH 7,35 (Tampn de Michaelis), o tampn de Owren. c) Solucin de trombina bovina liofilizada a concentracin de 100 NIH/mL. d) Solucin de CaCl2 mol/L. e) Plasma citratado control con tasa de fibringeno previamente conocida. f) Coagulmetro o equipo para la determinacin manual. La lectura manual de esta prueba es difcil por simple observacin de la formacin del cogulo y requiere el uso de un gancho o asa de platino. Todos los coagulmetros de lectura mecnica y la mayora de los modelos modernos de lectura ptica son adecuados para la realizacin de la prueba. C) MTODO Diluir el plasma problema en tampn de Michaelis o en tampn Owren (dilucin 1/10). Introducir en la cubeta del fibrmetro 0,2 mL de la dilucin 1/10 y esperar 2 minutos para equilibrar la muestra (37 C). Aadir 0,1 mL de la solucin de trombina concentrada, al mismo tiempo que se dispara el cronmetro del fibrmetro.
Determinar el tiempo necesario para la coagulacin. Las cifras obtenidas se transforman en valores de concentracin de fibringeno (g/L) mediante el empleo de una curva de calibracin elaborada previamente: se determina el fibringeno de un plasma control por otro mtodo (preferentemente ponderal) y se mide el tiempo de coagulacin correspondiente a diferentes diluciones de este plasma (1/5, 1/10, 1/20, 1/30, 1/40, 1/50) en presencia de una solucin de trombina (segn lo indicado anteriormente). Tampn Patrn Dilucin 0,8 mL 0,2 mL 1/5 0,9 mL 0,1 mL 1/10 1,9 mL 0,1 mL 1/20 2,9 mL 0,1 mL 1/30
En la lnea de abscisas se colocan las concentraciones de fibringeno en g/L y en la de ordenadas los tiempos de coagulacin obtenidos (en segundos) (Figura 2).
Figura 2
D) INTERPRETACIN DE RESULTADOS En las hipofibrinogenemias, la dilucin 1/10 es prcticamente incoagulable; mientras que en las hiperfibrinogenemias hay que aumentar el nmero de diluciones hasta entrar en la zona de sensibilidad de la recta de calibracin. Si la tasa de fibringeno es superior a 500 mg/dL, se hace una dilucin 1/20 (0,1 mL de plasma problema y 1,9 mL del tampn), se realiza una nueva determinacin y el resultado se multiplica por 2 para obtener la cifra real de fibringeno. Si la cifra de fibringeno es inferior a 100 mg/dL se realiza la prueba en plasma diluido 1/5 (0,1 mL de plasma y 0,4 mL de tampn, y el resultado se divide por 2.
La presencia de un inhibidor de accin antitrombina (heparina o PDF) pueden falsear los resultados por alargamiento del tiempo de coagulacin, independientemente de la tasa de fibringeno. TIEMPO DE TROMBINA Es el tiempo que tarda en coagular un PPP citratado al aadir un exceso de trombina. El valor normal oscila entre 12 y 16 segundos. Si el TT excede ms de 3 segundos al tiempo control (que se realiza simultneamente), hay que sospechar patologa del fibringeno. La prueba se alarga tambin por la presencia de heparina, PDF o fibringeno anormal, por lo que ante un tiempo de trombina largo se recomienda la realizacin de un tiempo de Reptilase, y si ste est tambin alargado, deben dosificarse el fibringeno y los PDF. TIEMPO DE REPTILASE Mide el tiempo que tarda en coagular un PPP citratado al aadir reptilase (derivado del veneno de vbora), que acta directamente sobre el fibringeno, escindiendo el fibrinopptido A por un mecanismo independiente de la trombina, por lo que no se altera por la presencia de heparina. El tiempo de reptilase permite diferenciar si el alargamiento del tiempo de trombina se debe a un trastorno en la formacin de fibrina o a la presencia de heparina.
TEMA 10. GRUPOS SANGUNEOS: ABO Y RHO. REALIZACIN, TCNICA E INTERPRETACIN. TCNICA DE LA ANTIGLOBULINA HUMANA (COOMBS DIRECTO): PRINCIPIO, REALIZACIN TCNICA E INTERPRETACIN. ESTUDIO DE LA COMPATIBILIDAD SANGUNEA: PRUEBA CRUZADA MAYOR, FASES DE LECTURA E INTERPRETACIN
ABO Y RHO. REALIZACIN, TCNICA E INTERPRETACIN.

INTRODUCCIN
En pocas anteriores al siglo XX se haban realizado transfusiones entre seres humanos e incluso entre animales de otras especies y el hombre, aunque los resultados adversos frecuentes se consideraban ocasionados por enfermedades transmitidas del donante al receptor. Hasta 1901 con Landsteiner, no se inicia un estudio riguroso al mezclar plasma y hemates de diferentes personas, analizando la existencia o no de aglutinacin, llegando a clasificar las sangres en los diferentes grupos. En 1928, la Comisin de Higiene de la Sociedad de Naciones acepta la nomenclatura que hoy en da se utiliza para el sistema ABO, conocido tambin comnmente como grupo sanguneo. A partir de entonces, se va avanzando en el conocimiento de otros componentes antignicos de la membrana del hemate, establecindose numerosos sistemas eritrocitarios que, hoy en da, nos permiten evitar cualquier reaccin de incompatibilidad al poner en contacto dos tipos de sangre.
CONCEPTOS GENERALES
Un antgeno eritrocitario es toda aquella sustancia presente en la membrana del hemate que rene las caractersticas necesarias de tamao, complejidad, accesibilidad, etc... para que, al ponerse en contacto con las clulas inmunocompeFederacin de Sanidad de las CC.OO.CC. Pgina 102 de 299
tentes de un sistema inmunitario, de lugar a la activacin de dichas clulas, siendo una de las respuestas la formacin de anticuerpos; estos anticuerpos formados se unen a los antgenos correspondientes, inicindose la destruccin de la clula portadora. La destruccin de la clula se consigue por activacin del complemento y/o por fagocitosis Los antgenos eritrocitarios pueden estar pegados a la membrana del hemate o formando parte de ella. Si forman parte integral de la membrana, suelen estar menos accesibles para conectar con los receptores especficos de los antgenos de las clulas inmunocompetentes, disminuyendo por este motivo su capacidad antignica. La capacidad antignica va a depender, por tanto, del nmero de veces que se repite el antgeno en la membrana del hemate. Esta caracterstica se denomina densidad de puntos antignicos. A los antgenos eritrocitarios se les pueden denominar factores. Cuando varios factores son regulados por una serie de genes interrelacionados, forman un sistema (ABO, Rh...)
SISTEMA ABO
SUSTANCIAS QUE COMPONEN EL SISTEMA El sistema ABO est formado por los antgenos A y B, que pueden estar presentes en la membrana del hemate, en otras clulas y en las secreciones (saliva, lquido amnitico, lquido seminal...) dependiendo su existencia y localizacin de un control gentico. Las sustancias A y B empiezan a formarse en las primeras semanas del desarrollo fetal, pero no adquieren toda su potencia inmunolgica hasta pasados varios meses, incluso 18-20 meses despus del parto. Esto es debido a que el nmero de veces que se repite la sustancia en la membrana del hemate al principio es reducido, adquiriendo la densidad mxima de una forma progresiva. La densidad de estos puntos antignicos puede llegar, para las sustancias A y B, hasta casi un milln por clula. La localizacin de estas sustancias es extramembranosa y en su composicin podemos diferenciar dos partes: Oligosacridos: donde se presentan las variaciones antignicas y, otra menos conocida; Glucoprotenas (o soporte): cuando est fijado a la membrana de hemates, le ucocitos u otras clulas epiteliales o endoteliales.
FORMACIN Y CONTROL de LAS SUSTANCIAS A y B Antgenos. Los antgenos que componen el sistema ABO y el sistema Lewis proceden de sustancias precursoras muy similares. Hay dos tipos de sustancias precursoras: tipo I y tipo II, La sustancia precursora tipo I posee todas las uniones entre sus monosacridos por los carbonos que se encuentran en las posiciones 1 y 3, y el soporte est formado por glucoprotenas. La sustancia precursora tipo II posee todas las uniones entre sus monosacridos por los carbonos que se encuentran en posicin 1 y 3, excepto entre la N acetilglucosamina y la galactosa final, que se produce entre los carbonos en posicin 1 y 4. El soporte est formado por glucolpidos. Sobre estas sustancias van a actuar un conjunto de transferasas, controladas por genes que se encuentran en el brazo corto del cromosoma 9, dando lugar a los distintos componentes de los sistemas ABO y Lewis. Los genes que controlan el sistema ABO son el H, A, B y Se. Los genes A y B son codominantes entre s y dominantes sobre el O. La sustancia precursora tipo II es el origen de los antgenos A y B unidos al eritrocito y otras clulas. El proceso se desarrolla de la siguiente forma: el gen H controla la formacin y la accin de una fucosil-transferasa, que cataliza la unin de una fucosa a la galactosa final de la sustancia precursora tipo II, formndose la sustancia H. A continuacin, si el gen A est presente, controlar la formacin y la accin de una N-acetilgalactosaminil-transferasa, catalizando la unin de una N-acetilgalactosamina a la sustancia H; formndose la sustancia A. En cambio si es el gen B el presente, controla la formacin y la accin de una galactosil transferasa, unindose una galactosa a la sustancia H, formndose la sustancia B. Si en la dotacin gentica se encuentran los genes A y B, sobre el hemate aparecen las dos sustancias A y B y si en la dotacin gentica no se encuentran los genes A y B, por ser homocigtico OO, sobre el hemate no habr sustancia ni A ni B. El gen O se considera un gen mudo ya que no controla ninguna transferasa que acte sobre la sustancia H. Los hemates que tienen los antgenos A y B poseen menos cantidad de sustancia H en su membrana que los hemates carentes de dichos antgenos, ya que parte de la sustancia H se utiliza en la formacin de los antgenos A y B.
En la especie humana, siempre que no haya alteraciones genticas, las susta ncias precursoras y la sustancia H son isoantgenos, ya que las poseen todos los individuos de la especie. Sin embargo, las sustancias A y B son aloantgenos porque no se encuentran en todos los individuos de dicha especie. Hay determinados casos, aunque poco frecuentes, en los que el hemate no presenta en su membrana la sustancia H; como consecuencia de ello tampoco hay en la membrana del hemate sustancias A y/o B, aunque en la dotacin gentica estn los genes A y/o B. Esto puede ser debido a varias causas: La persona posee el genotipo homocigoto hh y, por lo tanto, no forma la susta ncia H ni en el hemate ni en las secreciones. Esta sangre se tipifica como Bombay. El gen H est parcialmente reprimido, formndose muy poca sustancia H, que resulta insuficiente para actuar como sustrato para las enzimas controladas por los genes A y B, no producindose, por tanto, las sustancias correspondientes. Este tipo de sangre se denomina para-Bombay serie 1. Hay un fallo en los genes reguladores que mantienen fijas las sustancias H, A y B al hemate. El individuo posee sustancia H y las sustancias A y B que le correspondan genticamente, pero no fijadas al hemate. Esta sangre se tipifica como para-Bombay serie 2. Esta alteracin gentica hace que, para las personas con sangre tipificada como Bombay, la sustancia H sea un aloantgeno. No sucede as en los casos de sangre para-Bombay series 1 y 2, ya que las personas que poseen este tipo de sangre tienen sustancia H (en poca cantidad o fuera del hemate) siendo por lo tanto isoantgeno para ellas. El ltimo gen regulador es el Se (ya sea de forma homocigtica: Se/Se heterocigtica Se/se), este gen controla la formacin y accin de una fucosiltransferasa, permitiendo la unin de una fucosa a la galactosa final de la sustancia precursora tipo I. As se forma la sustancia H, sobre la que pueden actuar los genes A y/o B con formacin de sustancias A y B en secreciones. Por lo tanto, para que un individuo sea secretor de sustancias A o B necesita poseer el gen Se de forma homocigtica o heterocigota. La frecuencia de los diferentes tipos de sangre en personas de raza blanca es la siguiente: O (43-47%), A1 (34-41%), A2 (10%), B (8-9%) y AB (3%) Anticuerpos del sistema ABO. Al nacer, una persona posee en la membrana de sus hemates los antgenos que le corresponden dependiendo de su dotacin gentica. En su plasma no existe ningn tipo de anticuerpos respecto a las sustancias A o B, pero de forma
progresiva, se inicia la formacin de anticuerpos contra los antgenos hemticos que ella no posee. Estos anticuerpos se denominan naturales. Hoy en da se piensa que estos anticuerpos se forman como respuesta a sustancia que se encuentran en la membrana de determinadas bacterias, neumococos o que forman parte de algunos jugos vegetales. Estas sustancias son muy parecidas a los antgenos que componen el sistema ABO. Los anticuerpos naturales reaccionan con antgenos A o B por reaccin cruzada. Estos anticuerpos son preferentemente de tipo IgM y no atraviesan la placenta. Se les denomina tambin completos o aglutinantes porque al unirse al hemate lo aglutinan con facilidad en medio salino. Los ttulos de anticuerpos naturales anti-A o anti-B pueden variar a lo largo de la vida. En trminos generales, sangres tipificadas como O, tienen ttulos de anti-A y anti-B naturales ms altos que las de los grupos A y B. Cuando los hemates tipificados como A, B o AB se transfunden a otra persona que no posea algunos de estos antgenos, el sistema inmunocompetente de sta se estimula formando anticuerpos contra el antgeno desconocido. Este tipo de anticuerpos se denominan inmunolgicos ya que el estimulante es perfectamente conocido (el antgeno hemtico) y la unin antgeno-anticuerpo no tiene lugar por reaccin cruzada. La mayora de estos anticuerpos inmunolgicos son de tipo IgG, atraviesan la placenta y se les denomina tambin incompletos porque para detectarlos en el laboratorio es necesario facilitar la aglutinacin de diferentes formas, ya que en medio salino no se consigue. Es importante diferenciar entre anticuerpos anti-A y anti-B naturales e inmunolgicos. La existencia de anticuerpos inmunolgicos anti A y anti B pueden ser causa de anemia hemoltica en el recin nacido. Sangre con ttulos altos de anticuerpos naturales y/o inmunolgicos no es adecuada para realizar transfusiones. Grupos y subgrupos del sistema ABO. El sistema ABO est formado por cuatro grupos diferentes Grupo sanguneo A B AB O Antgenos hemticos A B AyB Ninguno Anticuerpos en suero Anti-A Anti-B Ninguno Anti-A y Anti-B
Cada grupo presenta en el hemate, en otras clulas y en secreciones (si est presente el gen Se), el antgeno correspondiente a la denominacin del grupo, y en el plasma, el anticuerpo contra el antgeno que no posee.
En grupo AB, al tener los dos antgenos, no presenta ni anti-A ni anti-B (se conoce tradicionalmente como receptor universal) En el grupo O, al no tener ninguno de los dos antgenos, presenta anti-A y anti-B, expresando toda la sustancia H sin utilizar (se conoce tradicionalmente como donante universal) Se conocen algunas variaciones antignicas que dan lugar a diferentes subgrupos, solo los subgrupos A1, A2, A1B y A2B tienen inters, ya que el resto son muy poco frecuentes y sus antgenos tienen muy poca capacidad antignica. Los fenotipos-genotipos del sistema son los siguientes: Fenotipos O A1 Genotipos OO A1A1 A1A2 A1O A2A2 A2O BB BO A1B A2B
A2 B A1B A2B
El gen A1 es dominante sobre el gen A2, siendo los genes A y B codominantes y dominantes sobre el O. Caractersticas del sistema ABO Grupo A1 A2 B A1B A2B O Ag hemticos A1 y A A B A1, A, B AyB Ac plasma Anti-B Anti-A1 y anti-B Anti-A1 y anti-A Anti-A1 Anti-A1, anti-A y anti-B
El subgrupo A1 es mucho ms frecuente que el A2, siendo su capacidad antignica ms elevada. Una persona con sangre A2, si recibe hemates A1, es posible que forme anticuerpos anti-A1 En cambio los anticuerpos anti-A1 procedentes de sangres A2 y A2B suelen ser dbiles y por lo tanto poco tiles para su utilizacin in vitro para tipificar hemates A1.
Determinacin del grupo ABO. La tipificacin de la sangre con respecto al grupo ABO es la ms importante a realizar debido a las graves consecuencias que puede tener un error en su realizacin en caso de transfusiones. Esta importancia va a radicar en la existencia de anticuerpos naturales muy potentes que diferencian este sistema de otros (por ejemplo el Rh), provocando una incompatibilidad desde la primera transfusin (el Rh necesita una transfusin sensibilizante previa). Tipos de muestra y conservacin: Sangre total con cido ctrico, citrato y dextrosa (ACD): se conserva unos 21 das a 2-10 C. Sangre total con etilen-diamino-tetraactico (EDTA): se conserva 48 horas a 210 C. Sangre coagulada: se conserva 5 das a 2-10 C. La toma de muestra por puncin dactilar o en el lbulo de la oreja no es aconsejable, ya que en caso de duda no permite la comprobacin por medio de otra tcnica. Tipos de suero: La mayora de los sueros para el diagnostico son de origen humano, preparndose de mezclas de sueros seleccionados. Los sueros son: anti-A, anti-B y anti-AB. Este ltimo se utiliza de sangre de paciente de grupo O, y se utiliza para confirmar los resultados obtenidos con los anti-A y anti-B o bien cuando la respuesta obtenida es muy dbil. Para diferenciar los grupos A1, A2, A1B y A2B se utiliza principalmente el suero anti-A1, compuesto por una lectina de las semillas del Dolichus biflorus y para la identificacin de la sustancia H un suero anti-H vegetal (lectina del Ulexz europaeus). Tambin pueden emplearse sueros formados por anticuerpos monoclonales de origen murino (hibridacin de clulas B productoras de anticuerpos con clulas de mieloma de ratn) o humano (hibridacin de clulas B infectadas con EBV y clulas de mieloma). Los anticuerpos policlonales captan mejor los antgenos dbiles que los monoclonales.
Tcnicas. Prueba en porta. o En un porta colocar una gota de sangre problema y una gota de suero anti-A y en otro diferente otra gota de sangre con suero anti-B. o Mezclar. Aunque la aglutinacin debe ser inmediata, conviene mover dos minutos a temperatura ambiente para poder captar los antgenos dbiles. o Si no aglutina ni con anti-A ni con anti-B el grupo es el O (se puede confirmar con la negatividad de la prueba al anti-AB). o Si aglutina con anti-B es B y si lo hace slo con el anti-A ser A. En este ultimo caso se deber diferenciar el grupo A1 del A2. Si aglutina con los dos, el grupo ser el AB. En aquellos casos en los que el paciente tenga la VSG elevada o el plasma sea lipmico, es posible que existan dudas en la interpretacin de la prueba. Para solucionarlo deben lavarse los hemates o bien realizar la prueba en tubo. Prueba en tubo. o Lavar aproximadamente 0.2 ml de sangre con solucin salina isotnica 23 veces. Centrifugar y eliminar el sobrenadante. o Tomar 0.1 ml del concentrado de hemates y mezclar con 2 ml de solucin salina isotnica (concentracin aproximada: 4%), a continuacin depositar una gota de la dilucin en dos tubos, aadiendo a uno suero anti-A y al otro anti-B. Mezclar y centrifugar 1 minuto a 1000 rpm, resuspender y comprobar la aglutinacin. EL SISTEMA RHESUS (Rh) En 1940 Landsteiner descubre otro antgeno en los hemates, que era el responsable de que los recin nacidos de madres que no tenan ese antgeno en sus hemates pero si el anticuerpo correspondiente en su plasma, murieran dentro del tero durante el embarazo o padecieran una enfermedad muy grave tras el nacimiento (enfermedad hemoltica del recin nacido). A este antgeno lo denomin Rh por haberse realizado los primeros descubrimientos en el mono MACACO RHESSUS. Observ que al introducir hemates humanos a estos monos, estos fabricaban un anticuerpo que era capaz de aglutinar los hemates del 85% de la poblacin blanca. Llam Rh positivos a los hemates que eran aglutinados por ese anticuerpo, (llevaban el antgeno Rh en su superficie) y Rh negativos a los que no eran aglutinados (no tenan antgeno Rh en su superficie).
El sistema Rhesus est constituido por unos cuarenta antgenos distintos cinco de los cuales revisten una importancia especial. Para designar los diferentes antgenos del sistema Rh existen dos nomenclaturas principales que se utilizan indistintamente la de Fisher-Race y la de Wiener. La terminologa de Fisher-Race se basa en la suposicin de que se heredan de cada progenitor tres genes situados en loci muy prximos. Los alelos ms comunes que pueden ocupar dichos loci se designan con los smbolos D y d, C y, E y e. Cada gen (con excepcin del d) codifica un antgeno especfico, que puede ser detectado en la membrana del hemate. Es posible que sea una alelo silencioso. La presencia o ausencia del antgeno D es la que determina si un individuo es Rh positivo o negativo. La nomenclatura de Wiener se basa en la herencia de un solo gen procedente de cada progenitor. Cada gen tendra una estructura en mosaico, que comprendera un nmero variable de antgenos sanguneos. As, el gen R1 codificara factores que corresponderan a C, D, y e de la nomenclatura de Fisher-Race. El gen reproducira los antgenos c y e pero no D, C ni E. El 85% de los individuos caucasoides expresan el antgeno D y se les denomina Rh positivos. Si el antgeno D no se expresa se denomina al individuo Rh negativo, estos heredan los antgenos C o E pero no el D. El genotipo de la mayora de los individuos Rh negativos es rr (dce/dce). El antgeno D es un potente inmungeno. Aproximadamente el 70% de los individuos Rh negativos producen anti-D si reciben sangre Rh positiva. Los antg enos C y E no son tan inmungenos. TEORIA DE FISHER-RACE
3 GENES ESTRECHAMENTE UNIDOS, HEREDA DOS DE CADA PROGENITOR GEN EN MOSAICO QUE CODIFICA MULTIPLES FACTORES SANGUNEOS
TEORIA DE WIENER
1 GEN Rh HEREDADO DE CADA PROGENITOR
Finalmente, Rosenfield, tan solo propone una nomenclatura, en la cual cada uno de los diversos antisueros Rh recibe un nmero Rh1, Rh2, etc. Este sistema hace posible una determinacin del fenotipo basada tan solo en los resultados observados con los antisueros empleados.
NOMENCLATURA ANTIGENOS DEL SISTEMA Rh FISHER-RACE D C E C E ANTGENOS DEL SISTEMA Rh Los antgenos del sistema Rh son protenas que forman parte integrante de la membrana de los eritrocitos nicamente. (No se encuentran en otras clulas o en las secreciones. A parte del antgeno D, que permite clasificar a los individuos en Rh positivos y Rh negativos, existen otros antgenos en el sistema Rh. De estos los principales son C, c, E, e. Anticuerpos haca cualquiera de estos antgenos pueden ser producidos por un individuo cuyos glbulos rojos carecen de los mismos. EL D El D es una variante dbil del antgeno D poco frecuente entre los individuos caucasoides, pero comn entre los individuos de raza negra (22%). Los hemates D generalmente dan reacciones dbiles o negativas con el anti-D, siendo generalmente detectados gracias a la prueba indirecta de la antiglobulina (prueba D). Los hemates D pueden ser clasificados en tres categoras. D ADQUIRIDO. La herencia del gen C en posicin trans con relacin al gen D (dce/DcE) tiene como resultado una expresin dbil del antgeno D en los hemates (D). Los individuos que representan estas caractersticas no producen anti-D si reciben sangre Rh positiva. D DEPRIMIDO GENOTIPO Dce/dce C en posicin cis con respecto a D Expresin normal antgeno D del Dce/dCe C en posicin trans con respecto a D WIENER Rh rh rh hr hr
Tabla 1.
ROSENFIELD Rh1 Rh2 Rh3 Rh4 Rh5
Fenotipo como D
VARIANTE D. El antgeno D presenta una estructura que consta como mnimo de cuatro partes. Si faltan una o ms partes del antgeno el resto de este puede tener una expresin dbil. Un individuo con la variante D puede producir aloanticuerpos contra la parte del antgeno D que le falta. Estos deben ser transfundidos con sangre Rh negativa. VARIANTE D Antgeno D Normal Variante D falta parte del antgeno D D HEREDITARIO. Algunos individuos D no pueden ser clasificados como D adquirido ni como variante D, puesto que, si bien poseen el antgeno D completo, ste est dbilmente expresado, desconocindose la causa de este hecho. Antgeno D Normal D Hereditario
HEMATES CON DELECCIN Rh (- D -) y Rh nulo De los hemates que no poseen los antgenos dependientes de los loci C ni E se dice que presentan deleccin (- D -). El nmero de lugares antignicos D est muy aumentado en estos hemates y por tanto el anti-D de tipo IgG puede aglutinarlos. De los individuos que no expresan ninguno de los antgenos del sistema Rh en sus hemates se dice que tiene Rh nulo (- - -). Los hemates de stos tienen alterado el transporte de sodio y potasio. Esto da lugar a una anemia hemoltica caracterizada por estomatocitosis, esferocitosis y aumento de la fragilidad osmtica. ANTICUERPOS DEL SISTEMA Rh Los anticuerpos del sistema Rh son casi siempre IgG, siendo estimulada su produccin por transfusin o por embarazo (Enfermedad hemoltica del recin nacido). No activan el complemento debido a que la situacin de los antgenos Rh de la membrana del hemate no permite la formacin de dobletes de IgG necesarios para la activacin del mismo. Los anticuerpos anti-D se emplean para prevenir la inmunizacin de las personas Rh negativas que han recibido hemates Rh positivos a travs de una transfusin o de un embarazo. La administracin antes de 72 horas de inmunoglobulina anti-D consigue destruir los hemates Rh positivos circulantes antes de que el sistema inmune del receptor se active.
GENOTIPO El trmino Rh positivo se refiere tan slo a la presencia del antgeno D en los glbulos rojos. No indica si la formacin gentica de la persona es homocigota (D/D) o heterocigota (D/d). En cualquier persona puede determinarse el genotipo presuntivo. DETERMINACION DEL RhO TIPOS DE MUESTRAS Y CONSERVACIN: Ver el apartado referido a la determinacin del grupo ABO. TCNICAS: Se emplean anticuerpos anti-D de tipo IgG conseguidos a partir de una mezcla de sueros humanos obtenida de donantes inmunizados. Prueba en porta. Se toman dos portaobjetos convenientemente rotulados. En uno ponemos una gota de suero anti-D, en el otro una gota del CD (Control negativo). Aadimos dos gotas de sangre total, a cada uno de los dos portas. Se mezcla bien la sangre y el reactivo con distintos palillos mezcladores. Se colocan los portas sobre el visualizador precalentado. Conviene mover el visualizador durante dos minutos. A continuacin se observa macroscpicamente la presencia de aglutinacin.
La lectura de cada uno de los portaobjetos admite dos posibilidades. o Reaccin negativa: no hay ningn signo visible de aglutinacin, debe ser confirmada con la prueba del D. o Reaccin positiva: la sangre con anti-D muestra aglutinacin visible, y el control negativo no. Prueba en tubo. Rotular dos tubos, uno para el anti-D, y el otro para el control negativo (CD).
Preparar una suspensin de hemates del paciente al 5%. Lavar tres veces con salino, centrifugando durante un minuto a 3.500 r.p.m. En el tubo del D poner una gota de anti-D, y aadir una gota de la suspensin de hemates, en el tubo del control poner una gota del control negativo y una gota de la suspensin de hemates. Agitar ligeramente los dos tubos y centrifugar 15 segundos. Leer los resultados macroscpicamente en el visualizador.
Siempre que resulte, el control del D, positivo, hacer test de Coombs Directo. A todo Rho negativo se le efectuar un D y un CDE. TEST PARA EL D 1. Incubar a 37 C durante media hora, el mismo tubo en el que se haya realizado el anti-D, que dio negativo. 2. Lavamos 3 veces, los hemates con solucin salina isotnica. Decantamos el ltimo sobrenadante. 3. Se aade una gota e suero antiglobulina humana y se mezclan. 4. Se centrifuga durante 30 segundos. Leemos macroscpica y microscpicamente. 5. Si no hay aglutinacin se dar como D (-) y D (-). 6. Si hay aglutinacin se har un anti-D salino, para ello: o Echar en un tubo 1 gota de anti-D salino, ms una gota de suspensin de hemates al 5%. o Incubar a 37 C durante 15 minutos. o Centrifugar y leer macroscpicamente. Slo si el anti-D salino da negativo se considera D positivo. En caso contrario se dar como D positivo. CDE 1. Rotular un tubo CDE y poner en el mismo una gota de anti-CDE. 2. Aadirle una gota de suspensin de hemates al 5% del paciente.
3. Incubar a 37 C durante 15 minutos. 4. Centrifugar 15 segundos y leer microscpicamente si hay aglutinacin. GENOTIPO 1. Rotular cuatro tubos: C, E, c, e. 2. Preparar una suspensin de hemates al 5% del sujeto a genotipar. 3. Poner en cada tubo, una gota de la suspensin de hemates, y una gota del antisuero correspondiente. (anti-C, anti-E, anti-c, anti-e). 4. Incubar durante 15 minutos, los cuatro tubos, a 37 C en bao Mara. 5. Centrifugar 15 segundos a 3.500 r.p.m., y leer macroscpicamente. 6. Apuntar resultados, ver en tablas genotipo correspondiente. Rho positivo D + C + E c + Rho negativo D C + E c Tabla. 2
e +
Genotipo Smbolo Dce/dce Rr
e +
Genotipo Smbolo dCe/dCe rr
TCNICA DE LA ANTIGLOBULINA HUMANA (COOMBS DIRECTO) PRINCIPIO, REALIZACIN TCNICA E INTERPRETACIN

PRINCIPIO
La fijacin de anticuerpos de tipo IgM a los hemates generalmente produce aglutinacin, a diferencia de los anticuerpos IgG (denominados anticuerpos bloqueantes o incompletos), que no suelen producir aglutinacin. La prueba de Coombs sirve para poner de manifiesto estos anticuerpos incompletos. Esta prueba puede aplicarse bsicamente de dos formas: directa e indirecta. Ambas tienen el mismo fundamento: las dos detectan el anticuerpo o el complemento unido a la clula. La Prueba Directa de la Antiglobulina es positiva cuando los hemates han sido sensibilizados en su propio organismo (sensibilizacin in vivo). La Prueba Indirecta de la Antiglobulina detecta la existencia de anticuerpos antieritrocticos en el suero de un enfermo, que provocan la sensibilizacin de hemates in vitro, por lo que aglutinan al aadirles el suero de Coombs. En ambos casos, el anticuerpo sensibilizante o el complemento actan como antgeno para el reactivo antiglobulina humana (suero de Coombs). Dicho reactivo se prepara inmunizando animales (conejos generalmente) con IgG y complemento (C3) humanos. La aglutinacin se produce porque el anti-IgG y el anti-C3 se unen al antgeno correspondiente (IgG y C3, respectivamente), que a su vez est unido a hemates colindantes, actuando as como puente (Fig. 1).
REALIZACIN TCNICA
Se llama directa porque los hemates se toman directamente del paciente y son examinados sin manipulacin intermedia. Antes del examen es importante lavar los glbulos rojos para que queden libres de protenas plasmticas, que podran reaccionar con el suero antiglobulina y dar falsos positivos. MATERIAL Centrfuga. Tubos de hemlisis (12 75 mm). Pipetas de Pasteur. Solucin salina fisiolgica. Sangre del paciente anticoagulada con EDTA. Eritrocitos control (Coombs-control).
Suero antiglobulina (suero de Coombs) estandarizado. Algunos anticuerpos de tipo IgG y la mayora de los IgM pueden fijar el complemento a los hemates in vivo. El componente del complemento detectado en dichos hemates es C3d, razn por la cual el reactivo antiglobulina utilizado para la prueba de Coombs directa debe contener anti-IgG y anti C3d. MTODO a) Centrifugar la sangre del paciente 5 minutos a 3.000 r.p.m. y separar el plasma. b) Lavar cuatro veces los eritrocitos con solucin salina fisiolgica, teniendo cuidado de decantar completamente despus de cada lavado. c) Preparar una suspensin de eritrocitos al 2-5 % en un tubo de hemlisis. d) Colocar una gota de los eritrocitos del paciente y una gota del suero antiglobulina humana. e) Mezclar y centrifugar 1 minuto a 1.000 r.p.m. f) Resuspender suavemente el botn de clulas (sin sacudir, usando slo una suave agitacin por medio de un suave temblor del tubo) y girar los tubos cuidadosamente para la lectura macroscpica.
Fig. 1: Test de Coombs directo
Una reaccin positiva mostrar aglutinados visibles macroscpicamente (Fig. 1). Una reaccin negativa se reconocer por la suspensin homognea de todos los hemates. Las reacciones negativas deben leerse tambin microscpicamente despus de hacer una extensin en porta. Puntuacin de las aglutinaciones: Smbolo C +++ ++ + (+) w o Aglutinados Un nico aglutinado Varios aglutinados grandes Aglutinados ms pequeos Grnulos Grnulos pequeos Lectura microscpica; aglutinados pequeos Lectura microscpica: negativa Puntuacin 12 10 8 5 3 1 0
INTERPRETACIN DE RESULTADOS Una prueba de Coombs directa positiva suele significar la presencia de inmunoglobulinas fijadas en la superficie de los eritrocitos, del tipo: 1. Autoanticuerpos contra antgenos intrnsecos de los hemates (con o sin anemia hemoltica autoinmune). 2. Aloanticuerpos en un receptor reciente de una transfusin que reacciona con los hemates transfundidos. 3. Anticuerpos presentes en el plasma del donante que reaccionan con antgenos de los hemates del receptor (poco frecuente). 4. Aloanticuerpos maternos que atraviesan la placenta y se fijan a los hemates del hijo (suelen provocar EHRN). Sin embargo, esta prueba no slo puede ser positiva en presencia de anticuerpos antieritrocitarios, sino que tambin puede indicar: a) Adsorcin sobre la superficie eritrocitaria de complejos inmunes formados por ciertos medicamentos y su correspondiente anticuerpo (penicilina, quinidina, fenacetina). b) Alteracin de la superficie eritrocitaria por efecto de ciertos medicamentos como la cefalotina, la metildopa y otros. c) Fijacin inespecfica de inmunoglobulinas a los hemates en pacientes con hipergammaglobulinamia (por ejemplo: cirrticos) o en pacientes tratados con dosis altas de Ig va IV. Por tanto, la prueba de Coombs est indicada siempre que exista sospecha clnica o biolgica de hemlisis por mecanismo inmune:
1. Anemia hemoltica autoinmune (hemates sensibilizados por autoanticuerpos). 2. Anemia hemoltica inducida por frmacos. 3. Enfermedad hemoltica del recin nacido (hemates sensibilizados por anticuerpos anti-Rh producidos por la madre). 4. Reaccin hemoltica postransfusional. Cuando la prueba de Coombs sea positiva, debe procederse a investigar si lo que recubre la superficie eritrocitaria es una inmunoglobulina, el complemento o ambos simultneamente. Asimismo, debe investigarse la naturaleza del autoanticuerpo existente (IgG, IgM). Por otra parte, no hay que olvidar la posibilidad de errores capaces de enmascarar el resultado de la prueba de Coombs, dando lugar en la prctica a falsos positivos y falsos negativos, cuyas causas generales son: 1. Falsos positivos: Sensibilizacin eritrocitaria in vitro por efecto de anticuerpos naturales o del complemento cuando se mantiene la sangre durante cierto tiempo a 4 C antes de su anlisis. Lavado insuficiente de los hemates. Fijacin inadecuada de suero antiglobulnico que contiene anticuerpos capaces de unirse a hemates no sensibilizados. Reaccin con la slice coloidal de los tubos de cristal. Elevada reticulocitosis en la muestra de sangre analizada.
2. Falsos negativos: Tiempo insuficiente de incubacin, que no permite alcanzar la aglutinacin eritrocitaria. Dilucin incorrecta del suero antiglobulina. Suero antiglobulina de mala calidad. Cuando el antisuero es de naturaleza IgA (debido a que los sueros antiglobulina normalmente empleados carecen de anti-IgA). Alteracin del suero antiglobulina debido a mala conservacin o contaminacin bacteriana. Lavado inadecuado de los hemates, que facilita la neutralizacin de los anticuerpos fijados sobre ellos por las inmunoglobulinas plasmticas o el complemento. Eliminacin de los anticuerpos fijados sobre la superficie eritrocitaria mediante el lavado. Empleo de sangre caducada. Empleo de placas o portaobjetos sucios, hmedos o con residuos de jabn.
El denominado Coombs-control se utiliza para detectar los falsos negativos. Consiste en hemates sensibilizados con IgG, que se aaden a los tubos con resultado negativo (sin aglutinacin). Dichos hemates control slo sern aglutinados si el suero de Coombs est libre (lo que confirma la negatividad del test). Si los tubos negativos no aglutinan con el suero Coombs-control, el test no es fiable y hay que repetirlo. Un test de Coombs positivo no indica necesariamente un acortamiento de la supervivencia de los hemates. Este acortamiento que aparece cuando existe hemlisis se demuestra mediante el correspondiente estudio eritropatolgico: haptoglobina, recuento de reticulocitos, determinacin de bilirrubina y LDH, etc. El resultado de estas pruebas es lo que confirmar la existencia o no de hemlisis. PRUEBA DE COOMBS DIRECTO EN TARJETA Las tarjetas son un moderno mtodo de ruti na utilizado actualmente en los bancos de sangre para los estudios pretransfusionales. El sistema est formado por tarjetas que llevan varias microcolumnas, que constan de: Una zona superior donde se depositan los hemates con o sin los sueros o antisueros (segn la tcnica), y en la que se originar la reaccin de aglutinacin. Una zona inferior que contiene un gel filtrante de dextrano (donde va el suero de Coombs o los antisueros especficos, segn la tcnica), que durante la centrifugacin permitir el paso de los hemates libres, pero no el de los aglutinados, que sern retenidos por su mayor tamao. Cuanto mayor sean los aglutinados, menos hemates atravesarn el gel, lo que indica una mayor intensidad de reaccin, que se expresa en cruces. Existen varios tipos de tarjetas: a) Tarjetas que llevan un medio salino inerte con o sin enzimas (se utilizan para estudio ABO, pruebas cruzadas en fro, etc) y b) Tarjetas que llevan suero antiglobulina humano, tambin denominado de Liss-Coombs (el medio tiene un potencial inico bajo que facilita la sensibilizacin), y que se utilizan para el Coombs directo, para pruebas cruzadas en fase de Coombs indirecto, etc. Material Tarjetas de Liss-Coombs. Diluyente 2 Liss.
Procedimiento Se diluyen 10 L del sedimento de la sangre del paciente (anticoagulada con EDTA) en 1 mL del diluyente 2 y se mezcla. Coger 50 L de la mezcla y echar en un microtubo. Incubar 2 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar y leer. Si es positivo, montar la tcnica con sueros monoespecficos (anti-IgG, anti-IgM, anti-IgA, anti-C3).
Interpretacin La misma que la de la tcnica en tubo.
ESTUDIO DE LA COMPATIBILIDAD SANGUNEA: PRUEBA CRUZADA MAYOR, FASES DE LECTURA E INTERPRETACIN

INTRODUCCIN
La inmunohematologa es la parte de la hematologa que estudia los procesos inmunitarios que tienen lugar en el organismo en relacin con los elementos sanguneos. Uno de los aspectos ms importantes comprende el estudio y la cuantificacin de los llamados grupos sanguneos eritrocitarios ( componentes antignicos presentes en la superficie de los eritrocitos) ya que estn relacionados directamente con la teraputica transfusional y la prevencin de accidentes hemolticos graves secundarios a ella. Todas las pruebas pretransfusionales intentan detectar reacciones antgenoanticuerpo potenciales antes de que la sangre sea transfundida. Para descartar incompatibilidades entre el donante y el receptor, las premisas generales son las siguientes: 1. Asegurar la compatibilidad ABO. Pueden usarse concentrados de hemates ABO-compatibles si no se dispone de sangre ABO-especfica. 2. Utilizar sangre del mismo grupo Rh0 (D), lo que es especialmente importante en mujeres antes de la menopausia. En una gran emergencia puede transfundirse sangre Rh0 (D) positiva a un paciente Rh0 (D) negativo no sensibilizado, pero sta es una decisin que debe tomar el director mdico y el clnico del banco de sangre, porque existe un 60-70 % de riesgo de formar anti-Rh0 (D). Puede darse inmunoglobulina anti Rh0 (D), sobre todo si el paciente es una mujer en edad frtil. Cuando el donante y el receptor pertenecen al mismo grupo ABO y RH0 (D), la transfusin ser compatible en el 98 % de los casos. 3. Para asegurar la compatibilidad del 2 % restante, son fundamentales: a) El estudio de anticuerpos irregulares clnicamente importantes en el suero del receptor. b) La prueba de compatibilidad directa entre el suero del receptor y los hemates del donante. No debe olvidarse que la identificacin inequvoca de las muestras de sangre, tanto del receptor como del componente o componentes a transfundir, es un aspecto fundamental, dado que la mayor parte de las reacciones hemolticas tienen su origen en errores de identificacin y/o de trascripcin. Por ello, el banco de
sangre debe disponer de un sistema que garantice la identificacin correcta del paciente y el etiquetado correcto de la sangre que ha sido objeto de la prueba cruzada. La clasificacin ABO, las pruebas Rh0 (D) y la deteccin de anticuerpos irregulares se hacen con cada nueva muestra de paciente. No es posible confiar en registros anteriores para esta informacin, aunque todos los resultados de pruebas de laboratorio deben conservarse para poder comparar los actuales con los anteriores. Cualquier discrepancia debe resolverse antes de entregar la sangre al paciente. Mientras las pruebas cruzadas se estn realizando, aplicar a la unidad de sangre un rtulo con los datos de identificacin del posible receptor, y colocarla en la zona del refrigerador reservada a sangre de pruebas cruzadas. Las pruebas de compatibilidad se efectan antes de transfundir la sangre, para asegurarse de que los hemates del donante son compatibles con el paciente. Comprende las siguientes determinaciones: 1) Tipaje correcto del grupo ABO y Rh del receptor. El grupo sanguneo y Rh de una persona no cambian, pero siempre existe el peligro de identificacin incorrecta de las muestras sanguneas. 2) Determinacin de anticuerpos irregulares en el suero del receptor, para poder administrar sangre solamente de aquellos donantes que carecen de los antgenos especficos. 3) Tipaje correcto de los grupos ABO y Rh del donante. 4) Realizacin de un autocontrol de los hemates del receptor. Si es positivo (los hemates autlogos en diluyente Liss muestran aglutinacin), se realiza un Coombs directo con los hemates del receptor. 5) Pruebas cruzadas. Son el ltimo estudio que se realiza en busca de incompatibilidad entre la sangre del donante y del receptor. An cuando no es posible efectuar un estudio completamente exhaustivo en busca de incompatibilidad antes de cada transfusin, la prueba cruzada debe ser lo ms completa posible, a fin de proteger al paciente. Hay que tener en cuenta que, excepto en las transfusiones entre gemelos univitelinos y en las transfusiones autlogas, ninguna sangre puede ser 100 % compatible. PRUEBA CRUZADA MAYOR Las pruebas cruzadas son importantes, ya que confirman in vitro que la transfusin prevista ser bien tolerada y probablemente eficaz. Se distinguen: a) Prueba cruzada mayor: Consiste en enfrentar suero del paciente con hemates del donante bajo condiciones ptimas para la actividad de los anticuerpos en el laboratorio. Se realiza para demostrar la posible exis-
tencia en el suero del paciente de anticuerpos hemolizantes, de revestimiento (incompletos) y/o aglutinantes contra los hemates del donante. b) Prueba cruzada menor: El suero del donante se enfrenta con los hemates del paciente. Debido al empleo generalizado de concentrados de hemates, esta prueba ya no se utiliza en muchos hospitales. Y aunque toda unidad con investigacin de anticuerpos irregulares positiva es rechazada por el banco de sangre, puede ocurrir que posea anticuerpos a bajo ttulo o de baja incidencia no detectados por los reactivos habituales, por lo que cuando se administre un gran volumen de plasma es aconsejable la realizacin de esta prueba cruzada menor, para detectar la posible existencia en el donante de estos anticuerpos contra los hemates del receptor. Para la prueba cruzada debe utilizarse suero del receptor y no plasma, ya que la mayora de los anticoagulantes actan quelando los iones calcio, lo que impide la activacin del complemento, por lo que algunos anticuerpos que fijan el complemento no podrn ser detectados si se emplea sangre anticoagulada. Adems las muestras de sangre deben estar completamente coaguladas, pues si no los restos de fibrina atrapan los hemates del donante y la diferenciacin entre cogulos y aglutinados es difcil de establecer. Para preparar la suspensin de hemates del donante se debe usar sangre de los segmentos hermticamente sellados derivados de la bolsa hemtica (tubo colector). Los hemates y el suero han de ser incubados durante el tiempo suficiente para que puedan reaccionar incluso los anticuerpos muy poco potentes. En general, slo los anticuerpos reactivos a 37 C y/o en fase de antiglobulina sern importantes desde el punto de vista clnico. Por ello es necesario aadir suero antiglobulina despus de la incubacin, para detectar los anticuerpos que recubren a los hemates pero que no llegan a aglutinarlos. La prueba debe comprobarse mediante controles. Es muy importante para la sensibilidad de la prueba el cociente suero/clulas, por lo que siempre que sea posible la proporcin debe ser de 4 volmenes de suero por cada volumen de la suspensin de hemates al 2-5 % en suero salino isotnico. La prueba cruzada mayor puede hacerse usando uno o dos tubos. Cuantos menos tubos se usen en el procedimiento sanguneo cruzado, menos son las posibilidades de confusin y error. La prueba debe ser lo ms sencilla posible para evitar las equivocaciones. Debe usarse en todo el banco de sangre una forma nica de clasificacin de los resultados en grados, para facilitar su comparacin. Un sistema comnmente utilizado es el siguiente:
4+ 3+ 2+ 1+ W+ 0H
1 agregado slido Varios agregados grandes Agregados de tamao mediano con fondo claro Agregados pequeos con fondo rojizo Agregados diminutos, con fondo rojizo turbio Suspensin lisa sin agregados Hemlisis, que debe interpretarse como reaccin positiva
Tambin puede hacerse una prueba cruzada titulada empleando diluciones dobles progresivas. REALIZACIN 1. Colocar en un tubo de hemlisis rotulado 2 gotas de suero del paciente y 1 gota de la suspensin salina al 5 % de los hemates del donante (Fig. 1). 2. Incubar a temperatura ambiente (22 - 24 C) durante 15 minutos. Centrifugar a unas 1.500 r.p.m. durante 1 2 minutos.
Fig. 1: Prueba cruzada mayor.
3. Leer la reaccin (fase salina) con ayuda de un espejo de aumento iluminado, rotando suavemente las clulas del botn de hemates, y registrar los resultados en ese mismo momento (no confiar en la memoria, pues aumenta las posibilidades de error).
4. 5. 6. 7.
Agregar 2 3 gotas de albmina bovina 20 -30 % al tubo anterior. Incubar a 37 C durante 30 minutos. Centrifugar. Leer (fase albuminosa) y registrar los resultados como en el punto 3. Lavar 3 4 veces los hemates con solucin salina isotnica y despus del ltimo lavado decantar completamente. 8. Agregar 2 gotas de suero antiglobulina al tubo. Centrifugar. 9. Leer (fase de antiglobulina o fase de Coombs) y registrar los resultados como en el punto 3. Si la prueba cruzada es negativa: 10. Agregar una gota de hemates de control de Coombs a cada tubo negativo. Centrifugar, leer y registrar. Pueden aplicarse diversas modificaciones de la Prueba Indirecta de la Antiglobulina para favorecer la deteccin de anticuerpos: Hemates tratados con enzimas: Los hemates que se utilizan en la fase de antiglobulina de las pruebas cruzadas pueden tratarse con enzimas proteolticas (papana, ficina, bromelina o tripsina), que separan de la membrana del hemate las protenas portadoras de cido silico, cargado negativamente. Por ejemplo, la bromelina resulta til como prueba cruzada adicional en el estudio de receptores que han sufrido reacciones transfusionales. Esto favorece la sensibilizacin y la aglutinacin por algunos anticuerpos clnicamente significativos (como Rhesus y Kidd). Algunos antgenos (como M, N, S y Duffy) son destruidos por el tratamiento enzimtico, por lo que sus anticuerpos no son detectados. El tratamiento enzimtico tambin aumenta la reaccin de algunos autoanticuerpos de fro que clnicamente carecen de importancia, como el anti-I. Solucin salina de bajo potencial inico (LISS): Cuando la tcnica de la antiglobulina se efecta con los hemates del donante suspendido en solucin salina normal, se necesita un tiempo de incubacin de 30-60 minutos para lograr un mximo de fijacin de los anticuerpos a los antgenos de los hemates. Si los hemates se suspenden en una solucin LISS, el perodo de incubacin puede reducirse a 5-10 minutos. Albmina: La adicin de albmina a los hemates suspendidos en medio salino normal aumenta la tasa de sensibilizacin, permitiendo un tiempo de incubacin ms corto. Despus de completar las pruebas sanguneas cruzadas, si hay compatibilidad consignarlo en el rtulo de la unidad y completar el registro de compatibilidad. Este rtulo o etiqueta debe permanecer unido a la bolsa de sangre hasta completar la transfusin. INTERPRETACIN La aglutinacin indica que algn anticuerpo del suero del receptor se ha unido a hemates del donante, por lo que se dice que la prueba cruzada es incompatible.
La prueba cruzada es compatible si no existe aglutinacin, pues indica que no hay anticuerpos eritrocitarios en el suero del receptor. Como ya se ha indicado, todas las pruebas de antiglobulina negativas deben ser comprobadas para asegurar que la tcnica se ha realizado correctamente. Si los resultados son correctos, los hemates del control de Coombs deben ser aglutinados; si esto no ocurre, la prueba no es vlida y debe repetirse. Entre las causas de una prueba falsamente negativa estn: Olvidarse de aadir el suero antiglobulina humana. Reactivo de antiglobulina carente de anticomplemento. Lavado incorrecto de los hemates reaccionantes (se dejan residuos de protenas plasmticas humanas que neutralizan el suero antiglobulina, invalidndolo). Uso de suero viejo. La muestra empleada no debe tener ms de 48 horas, conservada en refrigeracin. Uso de una suspensin celular densa (debe ser del 2-4 %). Centrfugas mal calibradas. Incubador a temperatura inapropiada.
Investigacin de anticuerpos irregulares
Prueba cruzada
Causa de la aglutinacin
Compatible para la transfusin
*El Ac reacciona con algn Posiblemente (fenotipar los Ag de los hemates reactivo, hemates del donante para pero no reacciona con los confirmar la compatibilidad) hemates del donante
*El Ac reacciona con un Ag de baja incidencia *Los hemates del donante son Coombs directo positivo *Error de tcnica repetir
No
*El Ac reacciona con algn Ag de los hemates del donante y de los hemates reactivo
No
*No se detecta Ac
Los anticuerpos solamente sern detectados mediante la prueba cruzada si los hemates del donante poseen el antgeno correspondiente. Para asegurar la deteccin de todos los anticuerpos clnicamente significativos, el suero del paciente se incuba con 2 3 muestras seleccionadas de sangre del grupo 0, que expreFederacin de Sanidad de las CC.OO.CC. Pgina 127 de 299
sen los antgenos ms corrientes de los principales sistemas de grupos sanguneos. Esto se denomina investigacin de anticuerpos irregulares. La aglutinacin de alguna de las muestras de hemates reactivo empleadas significa la presencia de un anticuerpo especfico. Dicho anticuerpo puede identificarse enfrentando el suero del receptor con un panel de hemates fenotipados (el mismo procedimiento que se utiliza en la prueba cruzada, pero sustituyendo los hemates del donante por hemates del grupo 0 extensamente fenotipados). Los anticuerpos dirigidos contra antgenos de baja frecuencia que no estn en los hemates reactivo, no sern detectados. Si los hemates del donante en potencia poseen dicho antgeno de baja frecuencia, la incompatibilidad sera detectada en la prueba cruzada. OBSERVACIONES GENERALES SOBRE LAS PRUEBAS CRUZADAS: Un factor que puede confundir las pruebas cruzadas es el fenmeno rouleaux, donde los hemates aparecen formando como pilas de monedas. Para comprobar que no se trata de una aglutinacin, se usa la tcnica del reemplazo salino: 1. Despus de incubacin y resuspensin, volver a centrifugar la mezcla suero-clulas y remover el suero. 2. Reemplazar el suero con 2 gotas de solucin salina y mezclar. 3. Centrifugar la mezcla de clulas salinas. 4. Volver a suspender la mezcla de clulas salinas y observar la aglutinacin. Los rouleaux se dispersan pero la verdadera aglutinacin permanece. Una prueba cruzada negativa no asegura una supervivencia normal de los eritrocitos despus de transfundir la unidad. Los pacientes pueden tener anticuerpos muy dbiles (concentracin menor del nivel de deteccin) en el momento de la prueba cruzada, pero al transfundir, el antgeno especfico queda expuesto al sistema inmune, y a menudo el anticuerpo reaparece con ttulo y avidez mayores (respuesta inmune secundaria), y la supervivencia de los glbulos rojos se acorta despus de la transfusin. Cada vez que un paciente es transfundido existe la posibilidad de que esos hemates produzcan una estimulacin secundaria. Por ello, tras 24 horas de la transfusin, si se precisa otra, se debe extraer una nueva muestra de sangre del receptor y realizar una nueva prueba cruzada. Con esto se podr poner en evidencia cualquier anticuerpo recin adquirido, a la vez que se asegura la presencia de complemento en la prueba cruzada (los niveles de complemento en suero viejo son muy bajos, por lo que las reacciones Ag-Ac que fijen el complemento no podrn ponerse de manifiesto, y esa incompatibilidad no ser detectada). Como medida de precaucin, se deben conservar en el refrigerador muestras del donante y del receptor al menos hasta 4 das despus de la transfusin.
Las pruebas realizadas en fase salina a temperatura ambiente son capaces de descubrir varios tipos de incompatibilidades en el sistema ABO, anticuerpos antiP, anti-MNSs, anti-Lewis y algunos otros anticuerpos aglutinantes fros. Las pruebas realizadas en fase albuminosa a 37 C se realizan tras la de temperatura ambiente si sta ha sido negativa. Estas pruebas permiten evitar in vivo reacciones debidas a anticuerpos aglutinantes de los sistemas Rhesus y Lewis fundamentalmente. Las pruebas en fase de antiglobulina detectan anticuerpos de clase IgG, es decir, inmunoglobulinas no aglutinantes. Esta prueba detecta prcticamente la totalidad de anticuerpos Rhesus y algunos otros anticuerpos dirigidos contra antg enos de los sistemas Duffy, Kell y Kidd. La responsabilidad final de la calidad de la sangre que se transfunde recae en la persona que efecte la prueba cruzada. Por ello es muy importante recordar: Leer cuidadosamente las etiquetas. No utilizar nunca muestras contaminadas o de fechas atrasadas. Examinar siempre la unidad de sangre que se va a transfundir, para descartar la presencia de cogulos, ictericia, turbidez anormal y hemlisis (cualquiera de estas situaciones es causa de rechazo de la bolsa hemtica, por lo que no podr transfundirse). Indicar el nombre del receptor en la etiqueta, de modo que pueda leerse sin confusin.
TEMA 11. DIAGNSTICO SEROLGICO. PRINCIPIOS, TCNICAS Y UTILIDAD.
INTRODUCCION Inmunologa es la rama de la ciencia que estudia la inmunidad. Esta se considera como la resistencia del organismo a las agresiones que pueda sufrir, sean de microorganismos, venenos, etc. El hombre, como cualquier otro animal, posee unos sistemas que ante la invasin de sustancias extraas al organismo, generalmente microorganismos, las reconoce y posteriormente las destruye. Los animales vertebrados tienen dos grandes tipos de sistemas que confieren la resistencia o el estado de inmunidad frente a los agentes patgenos: A) Uno, del que forman parte elementos celulares como fagocitos (macrfagos), clulas NK (natural killer o asesinas naturales), factores humorales bactericidas o bacteriostticos (lisozima, PCR, complemento, interfern). Este sistema es natural, es decir, sus componentes estn siempre presentes y dispuestos para actuar inmediatamente sin requerir ningn fenmeno que induzca su generacin. Carece de especificidad, es decir actan sobre gran variedad de microorganismos sin que posean un mecanismo de reconocimiento que les permita distinguir selectivamente unos de otros. Tampoco presenta memoria , es decir que no aumentan su eficacia al responder al mismo microorganismo en un segundo contacto con l.
B) El segundo sistema inmunitario es mas complejo y eficaz. Son responsables de este sistema los linfocitos y los anticuerpos. Aquellos se unen a las sustancias extraas (Antgenos) provocando su destruccin. Asimismo producen unas sustancias, llamadas anticuerpos, que tambin se unen a las sustancias extraas provocando una serie de reacciones tendentes a eliminar el antgeno del organismo. Este segundo sistema tiene la capacidad de memoria . Es decir que en un futuro contacto con el mismo antgeno, se repite el mismo proceso inmunitario pero con mayor intensidad y en un tiempo mucho ms corto. Tambin es especfico , es decir, las clulas y las sustancias (Ac.) que forman parte de l, reconocen a las sustancias extraas (antgenos) acFederacin de Sanidad de las CC.OO.CC. Pgina 130 de 299
tuando sobre ellas. Es decir tienen receptores especficos por cada uno de los antgenos que puedan existir. Finalmente, y al contrario que el primer sistema, los anticuerpos necesitan un estmulo antignico para que se produzcan en el organismo.
Los dos sistemas el innato y el adaptativo no actan separadamente sino que interaccionan ayudndose uno a otro REACCION ANTIGENO - ANTICUERPO Las tcnicas inmunolgicas se basan, casi todas, en las reacciones Ag.-Ac. y enlas manifestaciones que de dicha reaccin se derivan. Definiremos los conceptos de antgeno y anticuerpo. ANTGENO: Es una sustancia extraa al organismo capaz de inducir una respuesta inmunitaria, es decir, capaz de provocar la aparicin de anticuerpos o de clulas que actan sobre ella. En la superficie del antgeno existen unas estructuras, trozos o fragmentos moleculares, que son las que verdaderamente van a reaccionar con el anticuerpo y con las clulas que las van a atacar. Estos fragmentos se llaman determinantes antignicos o eptopos. Un Ag. es ms inmunognico cuanto mayor nmero de determinantes antignicos posea. Puede haber en un Ag. varios determinantes antignicos del mi smo tipo o diferentes. Pueden reaccionar todos con el Ac. o Acs. o no. El n de determinantes antignicos presentes en un Ag. es la valencia total del antigeno . El n de molculas de Ac. que se pueden unir al mismo tiempo con el Ag., o lo que es lo mismo, el n de determinantes antignicos expuestos, es la valencia efectiva o funcional del antgeno. La composicin qumica del Ag. puede ser variada. En general son protenas, aunque tambin pueden ser lpidos o glcidos, pero tienen menor poder antignico o inmunognico. Los antgenos particulados, como virus, bacterias o hemates extraos, son altamente inmunognicos.
A) FACTORES QUE AFECTAN LA ANTIGENICIDAD : Naturaleza qumica: Dependiendo de si son proteinas, hidratos de carbono o lpidos, son mas o menos antignicos. Tamao: Cuanto mayor sea la molcula de antgeno mas poder inmunognico tendr. Ejemplo, si el Ag. tiene 25 aminocidos ser mas inmunognico que si tiene 6. Complejidad: Cuanto mas complejo sea el antgeno mayor poder inmunognico. Ej., Si el Ag. est formado por cadenas polipeptdicas de un slo aminocido, ser menos inmunognico que las de varios aminocidos diferentes. Conformacin: La configuracin espacial (tridimensional), es decir, la estructura 3 de las molculas influyen en su antigenicidad. Ej. Ags. que qumicamente son iguales tienen diferente poder antignico cuando vara la situacin espacial de algunos determinantes antignicos. Accesibilidad: Cuanto mas soluble es un Ag. mas poder antignico tendr, ya que ser mas accesible a todas las partes del organismo. Concepto de extrao : Generalmente las sustancias extraas son las que provocan respuestas inmunes. Sern mas inmunognicas las sustancias mas distantes, evolutivamente hablando, entre el Ag. y el huesped. Ej., si la albmina de un ratn se inyecta a un hombre tendr ms poder inmunognico que si inyectamos la albmina de un primate. Gentica: La respuesta inmune est bajo control gentico. Ej., a ratones se le inyecta un Ag., y responden fuertemente, a otros ratones, con otra base gentica, al inyectarle ese mismo Ag. no responden de la misma forma o no responden. Modo de administrar los antgenos: El hecho de que un Ag. induzca una respuesta inmunitaria depende de la dosis y de la forma de administracin. B) HAPTENOS : Hay sustancias de estructura qumica muy simple que son capaces de unirse a los Acs., una vez formados estos, ya que por si mismas son incapaces de provocar su formacin. Son los llamados HAPTENOS. Para que sean inmunognicas (que provoquen la produccin de Acs.) hay que unirlas a otras sustancias ms complejas, generalmente protenas. Estas sustancias se denominan transportadores o "carrier".
ANTICUERPOS : Son molculas sintetizadas por los linfocitos B, en respuesta a un estmulo antignico, que tienen la propiedad de unirse especficamente al Ag. que indujo su formacin. Son protenas de peso molecular elevado a las que se les llama Inmunoglobulinas (Ig.), ya que migran en la electroforesis a la fraccin globulnica. Existen 5 tipos de Igs.: Ig. G, Ig. A, Ig. M, Ig. D, Ig. E. Dentro de estos tipos existen una gran variedad de subtipos, clases, subclases etc. Difieren segn su carga, tamao, composicin de aminocidos, contenido en carbohidratos, enlaces entre cadenas, etc. Dado que un animal puede fabricar Acs. especficos contra todas las molculas que existen en la naturaleza, el n de Acs. especficos que puedan hallarse en un momento dado puede ser del orden de varios millones. Los Acs. pueden encontrarse libres y circulante por el plasma, pero algunos, como las Ig.E se encuentran asociadas a clulas. Normalmente el organismo no desarrola Acs. contra sus propios componentes. Cuando lo hace estamos ante una enfermedad autoinmune. Cuando un Ac. entra en contacto con un Ag. contra el que est dirigido, ambos se unen formndose un complejo Ag-Ac o complejo inmune o inmunocomplejo. Esta unin es reversible y su permanencia depende del grado de adaptacin entre ambas molculas y de la fuerza y estabilidad de los enlaces que las unen. Una caracterstica de la reaccin Ag.-Ac. es la especificidad. Cuando un Ac. solo es capaz de reaccionar contra un Ag., se dice que ese Ac. es muy especfico. La reaccin Ag.-Ac. puede mostrar un alto grado de especificidad distinguiendo pequeas variaciones de la estructura del Ag., carga, configuracin ptica, conformacin espacial, etc. METODOS SEROLOGICOS Se llaman as porque el suero sanguneo es el vehculo habitual de los Acs. Estos mtodos estn basados generalmente en la reaccin Ag.-Ac. Otros mtodos se basan en el aislamiento de las diferentes poblaciones linfocitarias. Son muy tiles ya que podemos estudiar un Ag. disponiendo de su Ac. correspondiente o viceversa.
Las pruebas serolgicas se caracterizan por su: A) Especificidad: Es la capacidad que presenta la prueba de distinguir entre Ags. o Acs. (depende de lo que busquemos) de estructura muy similar. B) Sensibilidad: Es la cantidad de Ag. o Ac. (depende de lo que busquemos) que es capaz de detectar. Fines de las pruebas serolgicas: A) Cualitativos: Cuando slo se persigue conocer si en una muestra existe o no Ag. o Ac., no nos interesa la cantidad. B) Cuantitativos: Cuando pretendemos saber la cantidad de Ag. o Ac. presente en la muestra. Lo podemos saber: Semicuantitativamente: Se logra saber de manera aproximada la cantidad de Ag. o Ac. presente en la muestra. Esto se consigue mediante el ttulo de Ac.: La inversa de la mxima dilucin de la muestra que enfrentada a una cantidad standard del Ag. sigue manifestando positividad. De una manera exacta: o cuantitativas propiamente dichas, en los que el resultado se expresa de una manera exacta. Se dar en mg, ml, g, l. etc.
INMUNOANALISIS CON MARCADORES Se basan en utilizar molculas indicadoras unidas al Anticuerpo o al Antgeno con el fin de demostrar que ha tenido lugar la reaccin Ag- Ac., es decir demostrar la existencia del Ag. o el Ac. buscado. Estas pruebas se caracterizan por: Utilizar cantidades pequeas de reactivos, se decir son microtcnicas. Ser muy rpidas en ofrecer los resultados (desde minutos a horas, generalmente menos de 24 horas. Poseen una mxima sensibilidad, es decir detectan cantidades muy pequeas de Ac. o Ag. Son automatizables.
Se clasifican segn las molculas indicadoras utilizadas: ENZIMOINMUNOANALISIS ( E.L.I.S.A. o E.I.A.): Se usa una enzima. INMUNOFLUORESCENCIA (I.F.): Se usa un fluorocromo (colorante fluorescente) RADIOINMUNOANALISIS (R.I.A.): Se usa un istopo radioactivo.
INMUNOFLUORESCENCIA (I.F.) Son pruebas que utilizan sustancias fluorescentes (fluorocromos) unidas al Ac o al Ag. para demostrar que ha tenido lugar la reaccin Ag.- Ac., es decir para demostrar que existe el Ac. o el Ag. buscado. Los fluorocromos son sustancias que sometidas a una fuente luminosa absorben luz a una determinada longitud de onda y emiten luz a una longitud de onda mayor. Absorben luz ultravioleta y emiten fluorescencia (luz visible). Los fluorocromos usados habitualmente son: Fluorescena: emiten fluorescencia de color verde. Rodamina: " " " " anaranjada.
Para detectar la fluorescencia emitida se usarn: Microscopio de fluorescencia. Fluormetros.
TIPOS DE REACCIONES DE INMUNOFLUORESCENCIA: A) INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA: Se utiliza para la deteccin de Antgenos con ayuda de un Ac. marcado. Se usa para identificar microrganismos en un material clnico (lquidos, tejidos, etc.). Fases: 1.- Fijacin de la muestra (Ag.) en un portaobjetos. 2.- Se cubre la preparacin con el Ac. especfico marcado. 3.- Se lava para eliminar el exceso de Ac: fluorescente. 4.- Se observa al microscopio de fluorescencia. La observacin de microorganismos fluorescentes indica que se ha producido la reaccin Ag.- Ac.
Es una tcnica rpida, pero su uso est limitado por la necesidad de disponer de un Ac. especfico marcado por cada Ag. que queramos detectar. Se usa esta tcnica en la deteccin de diferentes grmenes en las muestras biolgicas. Ejemplo para el bacilo de Koch. B) INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA: Se utiliza para la identificacin de Ac. libres presentes en el suero. Fases: 1. 1. Fijamos en una fase slida (portaobjetos) Ags. especficos de los Acs. que buscamos.(Estos portaobjetos se obtienen en el mercado con sus correspondientes Ags.) 2. Se aade la muestra problema (Ac buscado). 3. Se aade Antisuero marcado (Antiglobulina marcada) unindose de esta forma con el Ac. de la muestra causando la fluorescencia del Ag.
Este mtodo es mas sensible que el anterior y adems tiene la ventaja de que para la investigacin de Acs. en suero humano solo requiere un Ac. marcado, la
antiglobulina marcada. Tiene muchsimas aplicaciones. Ejemplo, para detectar Acs. contra los toxoplasmas, contra el virus de Epstein-Barr (mononucleosis infecciosa),para el diagnstico de la sfilis, etc. C) MTODO SANDWICH: Se usa para detectar Acs. unidos a clulas. Fases: 1.- Se fija el material clnico en un portaobjetos. 2.- Se aade el Ag. especfico del Ac. buscado. 3.- Se aade un Ac., igual al buscado, pero marcado. 4.- Observacin al microscopio de fluorescencia.
Este ltimo mtodo, al igual que otro que usa el complemento, no se usa frecuentemente. ENZIMOINMUNOANALISIS (ELISA) Son pruebas que se basan en la deteccin de la reaccin Ag.-Ac. mediante el empleo de Ags. o Acs. marcados con una enzima. La presencia de la enzima en el inmunocomplejo es detectada por una reaccin coloreada que se produce al aadir un sustrato. Una sola molcula de enzima puede convertir millones de molculas de sustrato en molculas de producto. De ah la alta sensibilidad de este procedimiento. Las enzimas usadas habitualmente como marcadoras son: peroxidasa, glucosa oxidasa, fosfatasa, etc.
La medicin de los cambios de color, como resultado de la conversin enzimtica del sustrato a producto, se lleva a cabo habitualmente mediante un espectrofotmetro. Actualmente, al ser casi todas las tcnicas automatizadas, se utilizan lectores de placas que llevarn un espectrofotmetro incorporado. Se pueden dividir los ensayos de ELISA en: * ELISA homogneos, en los que la interaccin antgeno-anticuerpo modula la actividad de la enzima por lo que no hay que separar los componentes marcados enzimticamente de los no marcados. * ELISA heterogneos, en los que la reaccin antgeno-anticuerpo no modifica la actividad del marcador enzimtico. Estos mtodos requieren la separacin fsica del inmunocomplejo Ag.-Ac. de los constituyentes no fijados. Son los ms usados Aunque se pueden hacer estas pruebas en fase lquida casi siempre se harn en fase slida, es decir se utilizar un soporte para fijar el Ac. o el Ag. Los soportes pueden ser placas de microtiter, tubos de plstico, perlas de vidrio, etc. TIPOS DE REACCIONES DE ELISA EN FASE SLIDA: I) METODOS PARA DETECTAR ANTIGENOS: A) MTODO SANDWICH: Sirve para detectar Ags. grandes ( virus de la hepatitis, gonococo ...). Tienen que ser polivalentes ya que se tienen que unir a dos molculas de Ac. Habr varias etapas: 1. Se fija el Ac. especfico del Ag. buscado en un soporte. 2. Se aade la muestra problema (con o sin el Ag. buscado). 3. Se aade el Ac. especfico del Ag. buscado pero marcado con una enzima. 4. Se aade un sustrato incoloro, especfico de la enzima empleada, y se mide el cambio de color producido al transformarse el sustrato en producto.
La intensidad del color medido ser directamente proporcional a la cantidad de Ag. que haya en la muestra. Los resultados se compararn con soluciones patrones. B) MTODO DE UNIN COMPETITIVA: Se utiliza para detectar drogas, hormonas, etc, en lquidos biolgicos. Etapas: 1. Se fija el Ac. especfico del Ag. buscado a un soporte: 2. Se aade una mezcla que contiene la muestra problema (Ag. buscado) y una solucin con Ag.( igual al que queremos estudiar) marcado con una enzima 3. Se mide la cantidad de Ag. marcado que se ha fijado al Ac. unido al soporte, mediante la adicin de un sustrato:
La concentracin del Ag. problema ser inversamente proporcional a la intensidad del color medido. Se compararn los resultados con soluciones patrones. II) METODOS PARA DETECTAR ANTICUERPOS: A) MTODO INDIRECTO: Etapas: 1. Fijamos a un soporte el Ag. especfico del Ac. que buscamos. 2. Se aade la muestra problema( tendr o no el Ac. buscado). 3. Se aade la antiglobulina marcada con una enzima. 4. Se mide el cambio de color producido al aadir un sustrato incoloro.
La intensidad del color medido ser directamente proporcional a la cantidad de Ac. presente en la muestra. Los resultados se compararn con soluciones patrones. Es la tcnica de mayor aplicacin para detectar Acs. por su elevada sensibilidad y especificidad, a la vez que por su posibilidad de automatizacin. Se utiliza, por ejemplo, para diagnosticar la rubola, SIDA, citomegalovirus, etc. B) MTODO SANDWICH: Etapas: 1.- Se fija al soporte una antiglobulina del Ac que buscamos. 2.- Se aade la muestra problema (con o sin el Ac que buscamos). 3.- Se aade un Ag. especfico del Ac. que buscamos. 4.- Se aade un Ac., igual al buscado pero marcado con una enzima. 5.- Se mide el cambio de color al aadir un sustrato incoloro.
La intensidad del color medido ser directamente proporcional a la cantidad de Ac. presente en la muestra. Se compara los resultados con soluciones patrones. C) MTODO DE UNIN COMPETITIVA: Se usan sobre todo para detectar Ac del tipo Ig.M.
Etapas: 1. Se fija a un soporte el Ag. especfico del Ac. que buscamos. 2. Se aade el suero problema (con el Ac. buscado) mezclado con Ac. (igual al buscado) marcado con enzima:
3. Se mide la cantidad de Ac. marcado que se ha fijado al Ag., midiendo la cantidad de color que se forma cuando se aade un sustrato incoloro.
La concentracin de Ac. en la muestra ser inversamente proporcional al color medido por el espectrofotmetro. Se compararn los resultados con soluciones patrones. RADIOINMUNOENSAYO (R.I.A.) Son pruebas que detectan el complejo Ag. - Ac. formado mediante el marcaje con istopos radiactivos del Ag. o del Ac. Los istopos radiactivos usados habitualmente son: - Carbono 14 (14C), Fsforo 32 (32P), Tritio (3H). Emiten radiacin . - Iodo 125 (125I), Iodo 131 (131I), Cobalto 57 (57Co). Emiten radiacin ?.
Los aparatos detectores de la reaccin son los contadores de centelleo de rayos ? o , segn el radioistopo usado como marcador. Estos aparatos miden la radiactividad. Aunque son las pruebas ms sensibles, presentan una serie de desventajas: o Hay que manipular radioistopos, con el peligro que esto conlleva. o Hay que tener una serie de normas de seguridad muy estrictas. No todos los laboratorios pueden aplicarlas.. o El instrumental que hay que utilizar es complicado y caro. o La vida media de los istopos usados habitualmente es muy corta, en comparacin a la de las enzimas. 57Co: 271,3 das, 125 I: 60 das. Hay mtodos en los que se inmoviliza el Ag. o el Ac. en una fase slida y otros en los que no (fase lquida). Los ms utilizados son los primeros. Los mtodos del RIA son los mismos del ELISA, los que mas se utilizan son los de unin competitiva. REACCIONES DE PRECIPITACION. Son unos mtodos serolgicos que se basan en detectar la reaccin Ag.-Ac. por la formacin de un precipitado visible y reversible. Es decir, si existe el Ag. o el Ac. buscado se produce la unin del Ag. con el Ac. y como consecuencia de esta unin se forma el precipitado. Es un efecto "in vitro" de la reaccin Ag.-Ac., es decir solo se produce en el laboratorio para poner de manifiesto la reaccin Ag.-Ac. Para que se produzca la reaccin de precipitacin es necesario que los Ags. y los Acs. sean multivalentes, ya que se tiene que formar una malla o red que finalmente precipita. Habr unos Acs. que precipiten mejor que otros. El Ag. tiene que ser soluble, no particulado, por lo que se tendr que formar una gran red antes de que el precipitado sea visible, requiriendo esto una gran cantidad de anticuerpos. Es pues una reaccin poco sensible. Sin embargo es una prueba muy especfica. Si a una solucin con exceso de Acs. le vamos aadiendo concentraciones crecientes de Ag., y se representa el porcentaje de precipitacin frente a la cantidad de Ag., se obtiene la curva siguiente:
Vemos que existen 3 zonas bien diferenciadas: 1. Prozona (Exceso de Ac.): Inicialmente no se forma precipitado. Se forman uniones Ag.-Ac. pero son altamente solubles debido al exceso de Acs. Cada molcula de Ag. est saturada de Acs. La formacin de precipitado aumenta conforme aumenta la concentracin de Ag. 2. Zona de equivalencia : Es la zona de mxima precipitacin. Cada Ag. est ligado a un Ac., que a su vez est ligado por su otra(s) valencia(s) a otro Ag. formndose de esta forma una gran red que precipita. 3. Postzona (Exceso de Ag.): La adicin continuada de Ag. da como resultado la solubilizacin del precipitado debido a la formacin de pequeos complejos con exceso de Ag. Cada molcula de Ac. est saturada de Ag., se une con varias molculas de Ag., tantas como valencia tenga el Ac.; por tanto no se puede formar la malla necesaria para que se produzca la precipitacin. Para una mejor cuantificacin del Ac. o Ag. es conveniente que la zona de equivalencia sea lo mas estrecha posible. Esto se conseguir utilizando Ags. fcilmente solubles, as como que la muestra no tenga una mezcla excesiva de Acs. similares, ya que si no se producen diferentes uniones Ag.-Ac. ensanchando la zona de equivalencia. Aparte de la relacin de proporcin Ag.-Ac., existen otros factores que pueden afectar la precipitacin: - Especificidad y afinidad del Ac. - pH y la fuerza inica del buffer en el que se desarrolle la reaccin. - temperatura a que se incube la reaccin. - peso molecular de los reactantes.
TIPOS DE REACCIONES DE PRECIPITACION: Las reacciones de precipitacin se pueden realizar en un medio slido o en medio lquido. Atendiendo a este criterio las vamos a clasificar. PRECIPITACION EN MEDIO LQUIDO: A) PRUEBA DEL ANILLO: La mezcla de un Ag. soluble y su Ac. correspondiente en un tubo da lugar a un precipitado visible unicamente si la proporcin de Ag. y Ac. son las apropiadas. Se puede hacer la prueba de una manera cualitativa o cuantitativa. Cualitativa: Nos permite identificar un Ag. disponiendo de su Ac. especfico, y viceversa. Las etapas de la reaccin son: 1.- Colocar el Ac. en el fondo del tubo 2.- Aadir el Ag. problema 3.- Reaccin de precipitacin En caso de que exista el Ag. problema se formar, en la interfase de ambos lquidos, un disco de precipitado de color blanquecino. Esta reaccin se usa para detectar la PCR, identificacin de los grupos de Lancefield de los Streptococcus. La prueba cuantitativa se hace de la misma forma pero utilizando varios tubos con Ac y aadiendo a ellos cantidades crecientes de Ag. Se mide la cantidad de precipitado que se forma en cada tubo. Los resultados se llevan a una grfica, como la anterior. En el tubo donde aparezca ms cantidad de precipitado se cuantifica el Ag. problema, tubo que corresponde, en la grfica a la zona de equivalencia. PRECIPITACION EN MEDIO SLIDO: Los Ags. y los Acs. pueden incorporarse a un medio gelificado (slido) donde podrn difundir. En el lugar donde se encuentren en sus proporciones ptimas aparecer una lnea de precipitado. Se utiliza, fundamentalmente, para el estudio de Ags, disponiendo de Acs adecuados. Cada unin Ag.- Ac. da una lnea de precipitado diferente e independiente.
Se pueden hacer las pruebas de una manera cualitativa o cuantitativa. Las ms importantes son: A) INMUNODIFUSIN SIMPLE EN TUBO (MTODO DE OUDIN): 1. El Ac., especfico del Ag. que buscamos, se incorpora al agar fundido a 45C. Se introduce en tubos de pequeo dimetro donde solidifica. 2. Se deposita encima una solucin adecuada del Ag.. 3. El Ag. difunde a traves del agar encontrandose con el Ac., que est repartido por todo el medio. En la zona donde el Ag. y el Ac. se encuentren en las proporciones adecuadas aparecer una lnea de precipitado. Es una prueba cualitativa. B) INMUNODIFUSIN RADIAL SIMPLE (MTODO DE MANCINI): Es una prueba cuantitativa. Las etapas son: 1. Se incorpora el Ac., especfico del Ag. que buscamos, al agar fundido, que se deposita en placas de Petri o en lminas de vidrio. Una vez solidificado, se realiza sobre el agar diferentes pocillos. 2. Se aaden a los pocillos el Ag. a determinar. Se aadirn varios Standard y las muestras problemas. El Ag. difundir por el medio
slido. 3. Donde se encuentren el Ac. (que est repartido por todo el medio) y el Ag. en las proporciones adecuadas se producir una lnea de precipitado circular (anillo de precipitado).
El dimetro del anillo, su cuadrado, ser proporcional a la cantidad de Ag. presente en cada pocillo. Se har una curva de referencia con los Standards. En el eje de abcisa pondremos el cuadrado del dimetro de los anillos, y en el eje de ordenadas la concentracin del Ag. Una vez hecha la curva se calcula la concentracin de Ag. de la muestra problema. Se usa para cuantificar las diferentes protenas plasmticas. C) INMUNOD IFUSIN RADIAL DOBLE (MTODO DE OUCHTERLONY): Este mtodo cualitativo se realiza tambien en placa, pero a diferencia del anterior, donde solo se desplazaba el Ag., se desplazan tanto el Ag. como el Ac. en el medio soporte (agar). 1. Aadir a una placa o lmina de vidrio una capa de agar virgen fundido. Una vez solidificado se le hacen 2 pocillos adecuadamente separados, uno para el Ac. y otro para elAg. 2. El Ag. y el Ac. difunden radialmente en el seno del agar. Donde se encuentren en las proporciones adecuadas se formar una lnea de precipitado. La precipitacin se produce en el punto de equivalencia Ag.- Ac.
La posicin y forma de la lnea de precipitado estn dictadas por la concentracin y el ta-mao del Ag. y del Ac.. La lnea estar mas cerca del pocillo con el reactante de menor concentracin, ya que la distancia recorrida es directamente proporcional a la concentracin. Se suele utilizar para la deteccin de infecciones por Candidas y Aspergillus.
D) ELECTROINMUNODIFUSIN SIMPLE O INMUNOELECTROFORESIS EN COHETE (ROCKET): Este mtodo se basa en la aplicacin de la corriente elctrica a la inmunodifusin simple, obtenindose resultados que tambin se pueden cuantificar. Un medio gelificado que contenga Acs. se introduce en un campo elctrico, perpendicularmente al sentido de la corriente elctrica se disponen pocillos que contienen las muestras problemas y los Standards. La difusin electrofortica del Ag. a travs del gel que contiene el Ac. permite la aparicin de lneas de precipitado en forma de conos o cohetes. La distancia entre el pocillo y la punta del cono (altura del cohete) esm directamente proporcional al logaritmo de la concentracin de Ag. que haya en la muestra.
E) ELECTROINMUNODIFUSIN DOBLE El Ac. y el Ag. se colocan en pocillos prximos, como en una inmunodifusin doble. A continuacin se aplica una corriente elctrica de tal forma que el Ag. vaya a encontrarse con el Ac. Si se utiliza un pH ptimo (8) y un bajo voltaje permite que el Ac se desplace ilnealmente hacia el ctodo arrastrado por la fuerza endosmtica, en una direccin contraria a la corriente elctrica, encontrndose con el Ag. que migra hacia el nodo arrastrado por la fuerza elctrica. En la zona donde el Ag. y el Ac. se encuentren en las proporciones optimas se formar una lnea de precipitado. Es un mtodo cualitativo muy rpido y ms sensible que la inmunodifusin radial doble. F) INMUNOELECTROFORESIS: Es un procedimiento que se utiliza para identificar diferentes Ags. de una muestra. Esta tcnica consta de 2 fases: 1.- Electroforesis: Separacin de los diferentes componentes (Ags.) de una muestra a estudiar, por su migracin diferencial cuando se somete la muestra a un campo elctrico. La diferente velocidad de migracin depender de la carga de la partcula, pH del tampn, fuerza inica del tampn, tamao y forma de la partcula y el potencial del campo elctrico aplicado. 2.- Inmunodifusin: Los Ags separados se enfrentarn a sus Acs. especficos en el mismo medio soporte donde se han separado. Difundirn ambos; donde se encuentren en las proporciones optimas, se formarn tantas lneas de precipitado como uniones Ag.-Ac. haya.
Pasos a seguir: 1. Colocar la muestra en un medio soporte y separarla electroforticamente. 2. Colocar los Acs., especficos de los Ags. buscados, paralelamente al eje de migra-cin de los Ags. 3. Difusin de los Ags. y los Acs. Donde se encuentren en las proporciones ptimas se formarn las lneas de precipitado, que revelarn la presencia de los Ags buscados. Se usa esta tcnica, sobre todo, para identificar anomalas cualitativas de protenas especficas o para analizar la composicin de una mezcla de protenas en lquidos biolgicos. G) INMUNOELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL: Este mtodo se utiliza como tcnica de investigacin para la separacin analtica de Ags. estrechamente relacionados, con propiedades electroforticas afines (variantes genticas de algunas protenas, heterogeneidad del factor VIII de coagulacin etc.). Este procedimiento se realiza en 2 etapas y en ambas se emplea la electroforesis. 1. La mezcla de Ags., normalmente suero, orina, LCR, se somete a electroforesis en agarosa para separar sus componentes segn su carga. 2. La tira de agarosa que contiene las protenas separadas se transfiere a una placa de soporte mayor. Sobre esta se vierte agarosa lquida que llevar disuelta Acs. contra todos los Ags. a analizar, haciendo contacto en un extremo con la tira de agarosa que contienen los Ags.
3. Una vez solidificada la agarosa que contiene los Acs. se aplica una corriente elctrica en direccin perpendicular a la primera separacin electrofortica a fin de que los Ags. migren hacia la agarosa que contiene los Acs. Se obtienen de esta forma unos arcos de precipitado ntidos, en forma de picos. REACCIONES DE AGLUTINACIN Es una reaccin serolgica que comprende la agregacin de una suspensin de Ags particulados cuando se unen a sus Acs. especficos. Es un mtodo secundario ya que primero se une el Ag. y el Ac. que van formando agregados, estos empiezan a aumentar y finalmente se depositan. Cuando los Ags. que intervienen en la reaccin son particulados "per se" la reaccin se llama: aglutinacin directa o activa. Como ejemplos de estos Ags. estn las bacterias y los hemates. Cuando los Ags., para que se produzca la reaccin de aglutinacin, tienen que ser acoplados a la superficie de clulas o partculas inertes (ltex, bentonita...) la reaccin se llama: aglutinacin indirecta o pasiva. Cuando un Ac. se une a su Ag. particulado especfico y se produce la aglutinacin, se llama: Anticuerpo completo. Cuando un Ac. se une a su Ag. especfico particulado y no se produce aglutinacin se llama: Anticuerpo incompleto. Caractersticas de las reacciones de aglutinacin: o Son bastantes sensibles, ya que detectan cantidades pequeas de Ag. o Ac. o Son menos especficas que las reacciones de precipitacin. o Son mtodos cualitativos o semicuantitativos. o Son pruebas muy tiles, ya que se puede acoplar el Ag. o el Ac. deseado a una partcula y as detectar su Ac. o Ag. especfico. o Se pueden observar a simple vista. Factores que influyen en la reaccin de aglutinacin: * Carga de las partculas: Las partculas poseen en suspensin una carga superficial negativa (potencial zeta) repelindose entre ellas. La unin con el Ac. ayuda a establecer puentes de unin entre las diferentes partculas producindose la aglutinacin. Algunas veces no es suficiente y habr que emplear diferentes sistemas para disminuir el potencial zeta. Uno de ellos es aumentar la viscosidad aadiendo sustancias como la albmina. Otro es el tratamiento con enzi-
mas proteolticas cuando las partculas son hemates. Tambien el buffer empleado puede disminuir las cargas (-) superficiales de las partculas. * Tipo de anticuerpo: Las Inmunoglobulinas del tipo Ig.M, debido a su tamao, siempre van a aglutinar. Las del tipo Ig.G podrn aglutinar o no dependiendo de la subclase o de otros factores. En caso de no aglutinar se llamaran Acs. incompletos. * Concentracin de electrolitos: Ya hemos comentado la influencia del buffer en las cargas (-) superficiales de las partculas. Para una mejor aglutinacin ser conveniente que la fuerza inica del buffer sea lo mas baja posible. * pH: Debe ser el mas prximo al fisiolgico. * Viscosidad: Cuanto mas viscoso sea el medio mejor se produce la reaccin de aglutinacin. Esto se puede conseguir aadiendo sustancias como la albmina o el dextrano. * Antgenos: Un Ag. con un solo determinante antignico nunca podr aglutinar. Cuantos ms determinantes antignicos posea un Ag. la aglutinacin se producir mejor. * Temperatura y tiempo de incubacin: La temperatura debe ser lo mas prxima a la fisiolgica, aunque hay algunos casos en que la t optima es 4 C. El tiempo de incubacin ser el mayor posible. * Agitacin: Las tcnicas que facilitan el contacto Ag. -Ac. como la agitacin o la centrifugacin facilitan la aglutinacin. Tipos de reacciones de aglutinacion: A) AGLUTINACION DIRECTA: Se produce cuando se unen el Ac. y su Ag. especfico particulado "per se", es decir de forma natural.
Se puede utilizar esta reaccin de manera cualitativa o cuantitativa.
a) Cualitativa: Se realiza en un portaobjetos o en un tubo, enfrentando un Ac. a una suspensin de Ags., de los que uno de ellos es desconocido. Tras una breve agitacin se observa si hay aglutinacin. Es una reaccin de uso comn para la identificacin de bacterias y la determinacin de grupos sanguneos. b) Cuantitativa: Nos permite una estimacin aproximada de los Acs. presentes en el suero, mediante la determinacin del ttulo de Ac. Esta tcnica de utiliza habitualmente para el diagnstico serolgico de las infecciones por Brucella y Salmonella. Hay que tener en cuenta el efecto zona, es decir, cuando hay un exceso de Acs. en el suero problema se puede solubilizar el aglutinado. Esto se evitar empleando una batera amplia de tubos. B) AGLUTINACION INDIRECTA: Es la reaccin de los Acs. con sus Ags. especficos solubles pero que han sido acoplados a la superficie de partculas. Se usan con frecuencia eritrocitos, humanos o no, bacterias, partculas inertes como ltex o bentonita. As un Ag. soluble al adsorberse en una partcula convierte la reaccin Ag.-Ac. de precipitacin a aglutinacin, incrementndose enormemente la sensibilidad de la prueba. Son ms sensibles las pruebas que usan como partculas portadoras de Ags. los eritrocitos que las que usan ltex o bentonita. Tambin se puede utilizar esta r eaccin de manera cualitativa o cua ntitativa. Para detectar antgenos solubles se utiliza una variacin de esta tcnica, la aglutinacin indirecta inversa, en la que en lugar de acoplar el antgeno a la +partcula acoplamos el anticuerpo especfico del antgeno buscado. Esta tcnica es la ms utilizada en serologa, por su bajo coste, su rapidez y su buena sensibilidad. Tiene el inconveniente de ser poco especfica, por lo que ofrecer falsos positivos. Pruebas tpicas basadas en este mtodo son: las pruebas reumticas (Protena C reactiva, Factores reumatoides, Waale- Rose, Singer-plotz, Antiestreptolisina), la RPR, la VDRL y la TPHA, que se usan en el diagnstico de la sfilis, la del ltex Criptococo etc.
C) INHIBICION DE LA AGLUTINACION: Los Acs. reconocen y reaccionan con sus Ags. especficos. Puede suceder que en la muestra problema el Ag. est en forma soluble (no unido a una partcula) por lo que se producir la reaccin Ag.-Ac. pero no se observar la aglutinacin. Esta prueba es una adaptacin de las reacciones de aglutinacin que nos permite la deteccin y cuantificacin de los Ags. solubles. La prueba se realiza en varias etapas: 1. Se aade a la muestra problema (Ag. soluble buscado) el Ac. especfico del Ag. buscado. Si no se produce aglutinacin puede deberse a 2 causas: a) Que no exista el Ag. buscado:
b) Que exista el Ag. buscado, pero que est en forma soluble:
Para saber si existe el Ag. en forma soluble o no existe el Ag. buscado, se hace la 2 etapa: 2. Se aade a la mezcla anterior partculas recubiertas con el Ag. buscado en la muestra problema. Puede ocurrir:
a) Que se produzca una aglutinacin:
Esto significa que no existe el Ag. buscado, ya que los lugares de unin del Ac. aadido en la 1 etapa (especfico del Ag. buscado) estaban libres y han reaccionado en la 2 etapa con las partculas aadidas que tenan el Ag. recubrindolas. b) Que no se produzca la aglutinacin: Esto significa que existe el Ag. soluble que estamos buscando, ya que los lugares de unin del Ac. aadido en la 1 etapa (especfico del Ag. buscado) estaban ocupados por el Ag de la muestra problema y por tanto no ha podido reaccionar, el Ac aadido, con el Ag. particulado aadido en la 2 etapa.
Esta prueba, de inhibicin de la aglutinacin tambin se puede realizar cuantitativamente. Para ello utilizaremos diferentes diluciones de la muestra problema. Una aplicacin de esta prueba es el diagnstico del embarazo, en el que se detecta la hormona GCh, antgeno soluble. D) TEST DE COOMBS O ANTICUERPOS NO AGLUTINANTES: Algunos tipos de IgG pueden unirse a los Ags. fijados a las partculas, pero no aglutinarlos. Son los llamados Acs. incompletos. Esta prueba detecta estos Acs. no aglutinantes mediante la adicin de antiglobulinas-IgG (antiinmunoglobulinas), que ayudarn a formar puentes de unin entre las partculas.
Hay 2 tipos de pruebas: a) Prueba de coombs directa: Ayuda a detectar Acs. unidos a partculas. Ej. los hemates en el recin nacido con enfermedad hemoltica por incompatibilidad Rh estn sensibilizados por Acs. no aglutinantes (IgG materna). La adicin de antiglobulinas humanas permite el establecimiento de puentes entre los hemates a travs del Ac. anti-IgG y hace posible la aglutinacin.
b)- Prueba de coombs indirecta: Detecta Acs. no aglutinantes libres en el suero. Se realiza e 2 fases: a) Se aade a la muestra problema (Ac. no aglutinante buscado) Ags. especficos particulados. No se producir la aglutinacin b) Se aade antiglobulinas (anti-IgG) a la mezcla anterior. Las antiglobulinas se unirn a los Acs.no aglutinantes fijados y provocarn la aglutinacin de las partculas.
Se usa esta prueba para el diagnstico serolgico de la brucelosis crnica. Tambin para detectar los Acs. no aglutinantes maternos en el caso de incompatibilidad Rh. REACCIONES CON INTERVENCION DEL COMPLEMENTO Son procedimientos muy sensibles, pero actualmente han sido superados por el RIA, el IF. y el ELISA. Todava hay tcnicas, que usan la fijacin del complemento para el diagnstico de enfermedades fngicas, vricas y parasitarias. El trmino COMPLEMENTO se usa para designar una serie de protenas plasmticas, cerca de 20, que son activadas en secuencia (en cascada) despus de producirse la reaccin Ag.-Ac. La primera protena del complemento que se activa se une a un sitio del interior del Ac. que seria inaccesible si el Ac. no ha reaccionado con el Ag. Despus de esta reaccin hay cambios conformacionales en la molcula del Ac. de tal manera que hace que la regin de articulacin se abra quedando expuesta al sitio de fijacin del complemento. Las protenas del complemento tienen la capacidad de lisar las clulas cuando la reaccin Ag-Ac. se produce con Ags. situados en las superficies celulares.
PRUEBAS DE FIJACION DEL COMPLEMENTO: Se pueden utilizar, como todas las pruebas serolgicas, para detectar Ags. o Acs. Se basan en que los complejos Ag.-Ac. formados al fijar el complemento impiden la hemlisis que ese mismo complemento producira sobre un sistema hemoltico incompleto ( hemates (Ag.)- Acs. hemolticos.). La prueba se realiza en 2 etapas: 1.- Se pone en contacto el Ag. y el Ac., de los cuales uno es conocido y el otro no, en presencia de complemento.
2.- Se investiga la presencia de complemento libre por la adicin de un sistema hemoltico incompleto (hemates + hemolisinas) Podremos observar 2 resultados: a) Que exista el Ag. o el Ac. buscado:
b) Que no exista el Ag. o el Ac. buscado:
INMUNOTURBIDIMETRIA Y INMUNONEFELOMETRIA Cuando un haz de luz choca con una partcula en suspensin, sufre una serie de fenmenos, parte de la luz es transmitida, parte absorbida, parte reflejada, y por ltimo parte es dispersada.
INMUNOTURBIDIMETRIA Esta tcnica se basa en la medicin de la luz que no se ha transmitido a travs de una suspensin cuando sobre sta incide un rayo de luz colimado. Es por tanto la medida de la disminucin de la intensidad de la luz incidente (causada por dispersin, reflexin y absorcin de la luz). Se puede medir como %T o como absorbancia. Cuando un antgeno y un anticuerpo se unen en un medio lquido, se forman inmunocomplejos que quedan en suspensin, dando una turbidez al lquido que es proporcional a la cantidad de antgeno o anticuerpo de la muestra.
INMUNONEFELOMETRIA Se basa en la medicin de la luz dispersada por las partculas de una suspensin cuando sobre sta incide una luz colimada. Se mide la luz desviada en un determinado ngulo (de 15 A 90), con respecto a la direccin del rayo incidente. La formacin de inmunocomplejos antgeno-anticuerpo es capaz de dispersar la luz que atraviesa la solucin donde se desarrolla la reaccin. Por tanto mediante esta tcnica podremos determinar la existencia de antgenos o anticuerpos en una muestra. REACCIONES DE TRANSFERENCIA O INMUNOBLOTTING Se basan en la transferencia de una sustancia desde un gel, donde se hayan separado sus diversos componentes, a un soporte fcilmente manejable. Las sustancias a estudiar se separan en un gel de poliacrilamida mediante la electroforesis. Una vez separadas todas las sustancias se realiza la transferencia, por capilaridad o por electroforesis (electrobotting), a una membrana, generalmente de nitrocelulosa. Esta membrana tiene una gran capacidad para fijar las protenas. Tambin se pueden bloquear fcilmente los sitios de unin libres. Las diferentes sustancias que se han transferido se podrn estudiar por diferentes mtodos, fundamentalmente ELISA o RIA, aadiendo a la membrana los anticuerpos especficos de las sustancias a estudiar. Es una tcnica cualitativa y los resultados se observaran en forma de unas bandas correspondientes a cada una de las sustancias estudiadas presentes en la muestra problema. La tcnica se llama Western blot
Actualmente tiene una gran aplicacin como tcnica para confirmar la infeccin por VIH (SIDA), ya que a una buena sensibilidad, comparable al ELISA, une una gran especificidad, eliminndose de esta forma los falsos positivos. Se hara de la siguiente forma: o Fraccionamiento, mediante electroforesis en un gel de poiacrilamida, del virus VIH desorganizado y parcialmente purificado. Las diferentes protenas vricas se separarn segn su peso molecular. o Transferencia a una membrana de nitrocelulosa de las protenas separadas, que actuarn como antgenos. o Se aade la muestra problema (suero con sospecha de tener anticuerpos contra el VIH) a la membrana anterior. Si existen los anticuerpos se unirn a sus antgenos correspondientes. o Se aade antiglobulina conjugada con un marcador que se unir a los complejos Ag.-Ac. formados anteriormente. o Se visualiza segn el mtodo empleado (ELISA o RIA) o Se compara el resultado con un control. Tambin se utiliza este mtodo para la determinacin de cidos nucleicos. Si determinamos DNA la tcnica se llamar Southern blot, y si es RNA se llamar Northern blot.
METODOS TERCIARIOS Estn basados en los efectos biolgicos que siguen a la unin Ag-Ac. o a las consecuencias derivadas de dicha unin. Algunos de estos efectos son: a.- Fagocitosis. b.- Opsonizacin: preparacin del Ag. para ser fagocitado. c.- Adherencia inmunitaria: facilita la fagocitosis. d.- Desgranulacin celular. e.- Bacteriolisis. f.- Inmovilizacin de microorganismos. etc. Casi todos estos efectos biolgicos estn basados en la actividad del complemento. PRUEBAS MS IMPORTANTES: A) PRUEBAS DE PROTECCIN: Estudian, mediante pruebas "in vivo", los Acs. protectores, que son los responsables de la inmunidad adquirida, y sus Ags. correspondientes. Pueden ser activas o pasivas: a) Activas: Sirven para determinar la capacidad vacunante de una preparacin antignica. Para ello se administra sta a un lote de animales y tras un periodo de tiempo (para que pueda fabricar Acs.), se les inocula el germen virulento. La proteccin se medir por la supervivencia de los animales. b) Pasivas: Se usan para medir el poder protector de un suero inmune. Para ello se administra el suero a un lote de animales y, tras un periodo de tiempo se inocula el germen virulento. La proteccin se medir, al igual que antes por la supervivencia de los animales. B) PRUEBAS DE NEUTRALIZACIN: Cuando un Ag. se une a su Ac. correspondiente puede perder su capacidad patgena, txica, hormonal, enzimtica etc., de que est dotado el Ag. Esto se manifestar por la posterior inoculacin de la unin Ag.-Ac. a un animal de experimentacin, a un cultivo, etc. Ejemplo: si unimos una toxina con su correspondiente antitoxina se neutralizar el efecto txico. Esto se demuestra inoculando a un animal de experimentacin la mezcla. C) TEST DE NELSON: Prueba utilizada en el diagnstico de la sfilis. Entre los mtodos 3 tambin podemos encontrar las pruebas que pueden ayudarnos a determinar la hipersensibilidad de un individuo a diferentes sustancias
como medicamentos, plenes, productos qumicos, polvo de la casa, alimentos etc. Se entiende por hipersensibilidad a la respuesta inmunitaria que causa dao en el individuo que la produce. Las pruebas ms comunes son: D) TEST CUTNEOS POR INTRADERMOREACCIN DEL ALERGENO: Consiste en inyectar bajo la piel las sustancias a estudiar, como alergenos, y observar la reaccin que se produce al cabo de poco tiempo E) PARCHES CUTANEOS: Se escarifica la piel y posteriormente se coloca un parche impregnado con la sustancia a estudiar en la zona escarificada. Tras un periodo de tiempo se observa los resultados. F) PRUEBAS DE PROVOCACIN: Las sustancias o alergenos se administran por va natural (inhalacin, va oral etc.) para provocar la reaccin alrgica. G) TEST DE PRAUSNITZ-KUSTNER O DE ANAFILAXIA CUTNEA PASIVA: El suero de un paciente alrgico se inyecta en la piel de un individuo sano. A las 24 horas se inocula en el mismo lugar el alergeno. Si existe el Ac., se origina una reaccin alrgica (prurito, eritema, edema). H) PRUEBA DE MANTOUX O DE LA TUBERCULINA: Consiste en inyectar intradrmicamente en el brazo una preparacin de tuberculina. Tras un periodo de 48-72 horas se observar una inflamacin en el lugar de la inyeccin. Se medir el dimetro de la inflamacin para dar como (+) o (-) la prueba. ESTUDIO DE LAS DIFERENTES POBLACIONES LINFOCITARIAS En los mtodos inmunolgicos no solo hay que estudiar la reaccin antgenoanticuerpo y sus consecuencias correspondientes, a veces hay que estudiar las diferentes clulas pertenecientes a la inmunidad celular, en concreto los linfocitos T y B. Hay tcnicas que permiten el aislamiento de los linfocitos del resto de los componentes de la sangre. Se basan generalmente en la velocidad de sedimentacin o en la centrifugacin en gradiente de densidad.
Tambin hay mtodos que permite la identificacin de las diferente subpoblaciones linfocitarias como la prueba de la formacin de rosetas E. Se basa en la capacidad que tienen los linfocitos T de formar rosetas de manera espontnea con los glbulos rojos de carnero, sin la intervencin de inmunoglobulinas. En algunas ocasiones hay que determinar la capacidad funcional de los linfocitos, parmetro ms adecuado para valorar el estado inmunolgico del individuo que su cantidad. Se valora la capacidad de produccin de anticuerpos, la respuesta a los mitgenos etc. Entre las tcnicas ms importantes estn: la transformacin linfoblstica, el cultivo mixto de linfocitos, y la proliferacin de linfocitos frente a diversas sustancias, como por ejemplo las lecitinas vegetales.
TEMA 12.- ESTUDIOS DE PATERNIDAD POR ADN.
Cmo se hace un estudio de paternidad por ADN?
La molcula de ADN (cido desoxirribonucleico) es la portadora de toda la informacin gentica que pasa de una generacin a la siguiente y contiene todas las instrucciones necesarias para la formacin de un organismo nuevo, as como para el control de todas las actividades de las clulas durante el tiempo de vida del organismo. Est presente en todos los organismos vivos desde virus y bacterias hasta plantas y animales.
En organismos superiores el ADN es nico para cada individuo de cada especie e invariable durante el periodo de vida del organismo. Esta caracterstica es lo que se conoce como " huella gentica" y es la base de los estudios de identificacin gentica de individuos.
Salvo unas pocas excepciones (glbulos rojos en mamferos, etc.), todas las clulas de un organismo vivo tienen ADN. Gracias a ello es posible extraer el ADN a partir de cualquier muestra biolgica (sangre, pelo, semen, huesos etc.) e incluso a partir de muestras degradadas. M ediante la tcnica del PCR o "reaccin en cadena de la polimerasa", es posible amplificar la molcula de ADN de forma exponencial en el laboratorio. Para realizar un anlisis gentico se necesita muy poca cantidad de muestra ya que a partir de una simple molcula de ADN se pueden obtener millones de copias.
Desde un punto de vista estructural, el ADN est formado

por una sucesin de molculas simples llamadas nucletidos, compuestos por un azcar (desoxirribosa), un grupo fosfato y una base nitrogenada, que puede ser prica (Adenina o Guanina) o pirimidmica (Citosina o Timina). Los nucletidos aparecen unidos entre s mediante enlaces qumiFederacin de Sanidad de las CC.OO.CC. Pgina 165 de 299
cos de forma especfica (una adenina siempre se aparea con una timina y una citosina con una guanina) creando una hebra de longitud variable. La naturaleza fsica de estas molculas hace que dos hebras se asocien de forma complementaria formando una doble cadena helicoidal. Mediante el proceso de secuenciacin, y empleando unos aparatos muy sofisticados llamados secuenciadores automticos, es posible conocer la secuencia exacta de nucletidos que forman cada molcula de ADN.
Dentro de las clulas el ADN sufre un proceso de plegamiento y empaquetamiento dando lugar a los cromosomas. Los humanos poseen 46 cromosomas, 23 procedentes de la madre y 23 procedentes del padre. Esta es la base de los anlisis de paternidad ya que estudiando una serie de marcadores genticos situados en los diferentes cromosomas (los STRs o "secuencias cortas repetidas en tandem") es posible determinar de forma inequvoca la paternidad de un individuo.
La molcula de ADN tiene una gran estabilidad lo que

facilita su transporte y almacenamiento. As, es posible mantener congeladas muestras de ADN durante mucho tiempo para realizar con ellas estudios genticos posteriores.
UN POCO DE HISTORIA La demostracin por parte de Avery y colaboradores en la dcada de los 40 de

la existencia del DNA como la estructura sobre la que recae toda la informacin gentica y el posterior descubrimiento en los aos 50 de la estructura de doble hlice del DNA por Watson y Crick (pulse aqu para ver una copia del trabajo original de Watson y Crick), dieron lugar a toda una serie de trabajos experimentales en las dcadas de los aos 60 y 70 encaminados a la elucidacin de las claves de la codificacin gentica que nos han conducido a la revolucin cientfica que se vive actualmente en el campo de la gentica y la biologa molecular.
Posteriormente, el descubrimiento de la "reaccin en cadena de la polimerasa"

(PCR) por K. Mullis en 1987 permiti la amplificacin in vitro de fragmentos de DNA de inters, abriendo todo un nuevo abanico de posibilidades en la manipulacin del DNA que se complet posteriormente en los aos 90 con el desarrollo de la secuenciacin automtica de DNA por el mtodo de Sanger con reactivos fluorescentes en lugar de radiactivos, permitiendo conocer exactamente el
orden de los nucletidos en la secuencia del fragmento de DNA en cuestin. En la actualidad, las tcnicas de PCR y de secuenciacin automtica de DNA son totalmente rutinarias en la mayora de los laboratorios de Bioqumica y Biologa Molecular.
En fechas recientes, el inicio del denominado Proyecto Genoma Humano por

parte de diferentes laboratorios de todo el mundo, est permitiendo la ordenacin y asignamiento de diferentes segmentos de DNA a localizaciones conocidas dentro de los cromosomas, lo que est facilitando el descubrimiento continuo de los denominados marcadores genticos, localizaciones fsicas y perfectamente identificables en un cromosoma cuyo paso hereditario de generacin en generacin puede ser monitorizado. Estos marcadores genticos pueden ser regiones de DNA que se expresan en forma de protenas, o segmentos de DNA sin funcin codificante pero con un patrn hereditario que puede ser determinado.
El PCR permite la amplificacin especfica de una secuencia requerida de DNA

cientos de millones de veces en un tiempo de pocas horas, independientemente de su origen (virus, bacterias, plantas, animales o humanos). Esta tcnica es especialmente valiosa y prcticamente insustituible teniendo en cuenta su alta especificidad, fcil automatizacin y alta capacidad para amplificar insignificantes cantidades de muestra de DNA. El PCR tambin puede ser utilizado para detectar la existencia de una secuencia definida en una muestra de DNA.
Durante mucho tiempo la aplicacin de estas tcnicas de Bioqumica y Biologa

Molecular han estado prcticamente restringidas al mbito acadmico e investigador. Sin embargo, en los ltimos aos estas tcnicas se estn convirtiendo en una herramienta fundamental e imprescindible en muchas reas como la biomedicina, biologa forense, agricultura, ganadera, tecnologa de alimentos, etc. Como ejemplo, en biologa forense, la utilizacin de PCR es prcticamente insustituible debido a que las caractersticas ambientales, de almacenamiento, etc. de las muestras, pueden llevar a la degradacin del DNA y llegar a impedir la utilizacin de otras tcnicas alternativas. En pases como Estados Unidos o el Reino Unido, la aplicacin de este tipo de tcnicas se lleva a cabo de forma continua y rutinaria en diversos campos de la ciencia. Sin embargo, en Espaa es un campo nuevo y de reciente implantacin.
Extraccin del ADN: La muestra biolgica (sangre, uas, hisopados o cualquier otro tejido que contenga clulas humanas con ncleo) se somete a la accin de detergentes, que disuelven los lpidos; y enzimas proteolticas, que cortan las protenas.
Luego de incubar la mezcla una noche a 60 grados centgrados, se produce la

ruptura de la estructura celular liberando todo su contenido a la solucin.
La mezcla se limpia mediante sucesivos lavados con solventes orgnicos (fenol,

cloroformo), que coagulan protenas y extraen los lpidos, y finalmente el ADN se separa por precipitacin con alcohol en medio salino.
Eventualmente, en los casos de manchas antiguas o huesos, se realizan purificaciones posteriores por dilisis o adsorcin a soportes slidos.
Existen mtodos alternativos en los cuales la muestra sangunea se deposita

sobre un papel especial, que la mantiene inalterada por aos a temperatura ambiente. Previo al anlisis, se cortan con un sacabocados pequeo fragmentos del papel (alrededor de 1 mm) y se extraen las impurezas mediante lavados. El papel as procesado, con el ADN adherido, se analiza directamente colocndolo en la mezcla de amplificacin.
Anlisis del ADN: Existen dos metodologas diferentes:

a)
Corte con enzimas de restriccin, corrimiento electrofortico en geles de

agarosa, transferencia a una membrana de nylon o celulosa y tratamiento con sondas de locus mltiple o de locus especfico. Estas tcnicas han cado en desuso, por lo cual no sern tratadas aqu.
b)
Amplificacin mediante PCR o reaccin en cadena de la polimerasa: es

un proceso que consiste en imitar una actividad normal de la clula: la copia de ADN, aunque en este caso limitado a pequeos fragmentos, en los cuales estn ubicadas las regiones variables.
Para ello, se coloca en cada tubo una porcin del ADN extrado de cada persona y una mezcla que contiene nucletidos, sales, una enzima que "copia" ADN (denominada polimerasa) y los "primers" que reconocen la zona variable.
La mezcla se somete a variaciones de temperatura en un ciclador trmico, que

produce sucesivamente tres temperaturas diferentes: una que desnaturaliza o separa las cadenas del ADN, otra que facilita que los "primers" reconozcan y se adhieran a la regin a copiar, y la tercera que permite la extensin de la cadena copiada, mediante la unin de los nucletidos que se encuentran en la solucin, con la ayuda de la polimerasa.
Luego, los amplificados se someten a un campo elctrico en el interior de un

soporte semislido o gel (electroforesis ). Como el ADN est cargado negativamente, se dirige hacia el polo positivo, los fragmentos pequeos ms rpido que los grandes, produciendo su separacin.
Finalmente, los fragmentos separados se visualizan mediante diferentes mtodos:
Radiactivos: si uno de los nucletidos estaba marcado radiactivamente,

basta poner el gel en contacto con una pelcula radiogrfica, que se revela para observar las variantes. Tincin con plata: se trata el gel con sales de plata, que por su carga positiva son atradas por la carga negativa de los fragmentos de ADN, y se revela de modo similar a una fotografa.
Tanto los mtodos radiactivos como los de tincin con plata estn cayendo en
desuso, y en la actualidad son empleados solamente por laboratorios que poseen un escaso volumen de trabajo.
Sistemas automatizados: son los de ltima generacin, en los cuales al

proceso de electroforesis lo efecta un secuenciador automtico, que lee mediante un rayo laser los "primers", marcados con un fluorocromo, adheridos a las zonas variables. Una computadora permite determinar qu variantes son las que se encuentran en cada muestra.
Interpretacin de los resultados: Segn las metodologas empleadas, los resultados se visualizan como "bandas"
(en los formatos radiactivos o de tincin) o como "picos" en un grfico (sistemas automatizados). Dado que la interpretacin es idntica, en los ejemplos utilizaremos los grficos obtenidos de un secuenciador automtico.
Madre:
Considerando que cada individuo hereda una variante

de su madre y la otra de su padre biolgico, supongamos los siguientes resultados para un hipottico "sistema A":
Hijo:
Es evidente que el hijo comparte una variante con su

madre y la otra con su padre alegado, por lo cual podra ser hijo de ambos. Sin embargo, esa situacin puede darse por azar, ya que hay muchos individuos de la poblacin general que presentan esa variante compartida.
Padre alegado:
Entonces, repetimos el estudio con otro sistema, que analizar una zona variable diferente. El resultado para ese " sistema B" podra ser:
Madre:
Hijo: se confirmara la inclusin. Para que el estudio resulte suficientemente creble, se acepta a nivel mundial que deben analizarse un mnimo de 12 sistemas de microsatlites, por supuesto, con inclusin en todos los casos. Para las tcnicas actuales automatizadas, ello no presenta Padre aleningn inconveniente, ya que existen mtodos de gado: amplificacin de 15 regiones v ariables en una sola reaccin.
El estudio completo, con sistemas de ltima generacin, se vera as:
Madre:
Hijo:
Padre alegado:
Madre:
Hijo:
Padre alegado:
Madre:
Hijo:
Padre alegado:
En el ejemplo anterior, se observan 15 sistemas variables y adems el denominado "amelogenina", que sirve para determinacin de sexo: en lo varones se aprecian dos picos ("XY") y en las mujeres, slo uno ("XX"). Los nmeros debajo de cada variante indica el nmero de repeticiones que posee la secuencia "core" que define al sistema cuyo nombre se coloca en la parte superior del registro grfico (ej.: D5S818, D13S317, etc).
Otra posibilidad para el sistema B sera:
Madre:
Que indicara la exclusin del padre alegado como

padre biolgico (obsrvese que la variante 11 est en el hijo pero no en la madre ni en el padre alegado). Para asegurarse que no se deba a una falsa exclusin debida a una mutacin, se sugiere continuar el estudio hasta observar al menos tres situaciones como sta, de no comparticin de variantes entre padre e hijo alegado.
Hijo:
Las variantes mencionadas se codifican por convenPadre gado: alecin mediante un nmero (ubicado en el esquema en la parte inferior de cada pico), que expresa el nmero de veces que est repetida la secuencia que caracteriza al sistema. As, en nuestro hipottico "sistema A", los resultados se expresaran como:
Madre: 8-12. Hijo: 8-13. Padre alegado: 12-13.
Cualquier otro estudio, realizado en cualquier lugar del mundo, del mismo "sistema A", debe necesariamente arrojar los mismos resultados numricos. Si eso no ocurre, alguno cometi un error.
Finalmente, se realiza un clculo estadstico de la probabilidad de paternidad e

ndice de paternidad, basndose en anlisis efectuados previamente de las variantes observadas en individuos no relacionados de la poblacin general. Cuanto menos frecuentes en la poblacin sean las variantes obtenidas, mayores sern la probabilidad y el ndice de paternidad.
Habitualmente, para individuos vivos, la "probabilidad de paternidad"

es superior al 99,99%. Por ejemplo, un "ndice de paternidad" de 1,2 x 106 indica que 1 de cada 1200000 individuos de la poblacin general podran ser asignados como padres biolgicos del hijo en cuestin, sin serlo, es decir, por azar.
TEMA 13.- MTODOS PTICOS PARA EL DIAGNSTICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS
INTRODUCCIN Cuando se establece el diagnstico clnico de una enfermedad infecciosa, con frecuencia es crucial el poder identificar rpida y provisionalmente el agente etiolgico con el fin de poder instaurar las adecuadas medidas teraputicas y en ocasiones epidemiolgicas; en todo caso siempre es conveniente llegar a la confirmacin bacteriolgica. En realidad las tcnicas utilizadas actualmente han variado muy poco desde el inicio de la era bacteriolgica; ms o menos sofisticadamente, se contina con la identificacin de los grmenes por visualizacin directa, por tcnicas de cultivo y en ocasiones por inoculacin animal. VISUALIZACION DIRECTA O EXAMEN MICROSCPICO El estudio microscpico directo de una muestra no permite por s solo, ms que en raras ocasiones, la identificacin precisa del microorganismo observado. No obstante, nunca se debe prescindir de l como orientativo, salvo en algunos casos, en relacin con la naturaleza de la muestra examinada, cuando no existe probabilidad de obtener ninguna informacin. El examen microscpico sirve de pauta para el uso de tcnicas complementarias de cultivo o de estudio bioqumico y evita, muchas veces, incurrir en errores graves. Este examen permite obtener informacin respecto a la presencia de bacterias y su abundancia, observar su morfologa y disposicin (por ejemplo los Streptococcus se disponen en cadena y los Staphylococcus en forma de racimos), determinar sus caractersticas de tincin, la reaccin celular, e incluso conocer la citologa del material examinado. Si se parte de un cultivo, la informacin puede ampliarse an ms y apreciarse mejor la forma, tamao, disposicin y las peculiaridades de tincin.
El examen microscpico comporta habitualmente dos modalidades diferentes: examen en fresco y mediante tincin. EXAMEN EN FRESCO Tambin conocido como montaje hmedo, consiste en colocar el material a examinar entre un porta y un cubreobjetos; si se trata de un producto slido, se realizar previamente una suspensin del mismo en agua destilada o s.s.f estriles. Para la observacin se coloca el condensador bajo y el objetivo seco fuerte (40X).La microscopa de contraste de fases y la de campo oscuro facilitan la observacin de estructuras con bajo ndice de refraccin que pasaran inadvertidas con el microscopio de campo claro; sus indicaciones son muy precisas (por ejemplo, la identificacin de espiroquetas). El examen en fresco se dirige principalmente a la deteccin de microorganismos directamente en las muestras, a cuantificar su concentracin, a obtener alguna informacin sobre su morfologa y, con frecuencia, a determinar la movilidad de una especie aislada. Adems, tambien permite observar otro tipo de clulas (hemates, leucocitos, clulas epiteliales), cristales y algunas estructuras que ayudan para la valoracin clnica de determinadas muestras. El examen en fresco puede ayudarse de recursos que facilitan la visualizacin de ciertos microorganismos:
La simple adicin de azul de metileno u otro colorante favorece la diferenciacin de elementos celulares. La preparacin con tinta china (mtodo de Burri) o nigrosina permite la evidenciacin de la cpsula microbiana. Se utiliza para el diagnstico de infeccin por Cryptococcus. El montaje con potasa al 10% en caliente o con azul de lactofenol es de gran utilidad para el estudio de estructuras fngicas, sobre todo de hongos dermatofitos. La preparacin con solucin yodada(lugol) es de eleccin para la identificacin de algunas parasitosis intestinales.
EXAMEN POR TINCIN El examen del material teido, ya sea directamente a partir de muestras clnicas o del desarrollo en los cultivos, es el mtodo ms til para la identificacin presuntiva de las bacterias y de ciertos virus y para la identificacin definitiva de la mayora de los parsitos y de muchos hongos. Las preparaciones teidas se visualizan al microscopio con el condensador alto y el objetivo de inmersin de gran aumento (100X). De forma resumida podemos decir que la coloracin o tincin es un proceso mediante el cual un elemento toma color bajo la accin de una sustancia colorante. Un colorante es una sustancia capaz de comunicar su color a otros cuerpos. Pueden ser: cidos (tien a estructuras bsicas; ejemplos: Eosina, cido Pcrico,Aurantina.), bsicos (tien estructuras cidas). Son colorantes nucleares. Ejemplos: Azul de metileno, Verde malaquita, Fuchina, Violeta de genciana, Safranina,...) y neutros (son capaces de teir tanto las estructuras cidas como bsicas. Ejemplos: Eosinato de Azul de metileno. En Microbiologa se utilizan sobre todo colorantes bsicos o nucleares debido a la gran basofilia del citoplasma bacteriano, rico en ARN. Estos colorantes se presentan generalmente asociados a un mordiente (cido fnico) para reforzar su accin, aunque algunas tcnicas de tincin aplican, adems, otro mordiente suplementario (lugol en la tincin de Gram). Preparacin de un frotis. Todas las tcnicas de tincin exigen una preparacin previa del frotis antes de proceder a la tincin en s. Los pasos a seguir son :
Extensin Cuando el producto a teir es lquido se depositar con asa de Pt, previamente flameada, una gota del mismo sobre el portaobjetos y se extender formando una capa fina y uniforme de aproximadamente 1,5 cm. de lado. Cuando se parte de un medio slido o semislido se depositar una gota de agua destilada o s.s.f. en el porta y, utilizando asa de Pt previamente flameada, se suspender en ella una pequea cantidad de cultivo. Se extiende de la misma forma que en el caso anterior. Hay que cuidar no poner demasiada masa de microorganismo, pues se formara una capa gruesa que dificultara la observacin. Cuando se trata de una muestra tomada con escobilln se pueden exte nder directamente o se suspenden en 2 c.c. de suero fisiolgico estril contenidos en un tubo. Se deposita una gota de la suspensin en el centro del portaobjetos y se extiende.
Desecacin. Se deja secar al aire o manteniendo el portaobjetos alto por encima de la llama. Fijacin. Cuando la extensin est bien seca hay que proceder a fijarla. Tiene por objeto adherir los grmenes al portaobjetos para que al lavar no se arrastre. Se consigue mediante la coagulacin de las protenas de los grmenes. En Microbiologa, el agente fijador que se suele emplear es el calor: una vez seca la extensin, se pasa el portaobjetos dos o tres veces por la llama del mechero con la extensin hacia arriba. El portaobjetos debe notarse caliente pero no quemar cuando se coloca en el dorso de la mano. Una vez fijada la preparacin se dejar enfriar antes de proceder a la coloracin ya que de lo contrario precipitara el colorante. Tambin se puede realizar la fijacin mediante el empleo de fijadores qumicos tales como el alcohol metlico o etlico, dejndolos en contacto dos o tres minutos, eliminando despus el exceso. Una vez preparada y fijada la extensin, el siguiente paso sera la tincin.
TIPOS DE TINCIONES TINCIN SENCILLA. Se realiza utilizando un slo colorante. Se puede emplear cualquier colorante bsico, preferiblemente azul de metileno o fucsina. Tcnica: 1. 2. 3. 4. Extensin. Desecacin. Fijacin. Dejar enfriar. Tincin: Se cubre la preparacin con el colorante (azul de metileno) durante 1-2 minutos. 5. Lavado: Se lava con abundante agua para eliminar el exceso de colorante. Lo idneo es usar agua destilada, pero tambien se puede usar agua corriente (esto puede causar errores, como por ejemplo depsitos de cal). 6. Secado: Se secar primeramente entre papel de filtro, evitando presionar directamente sobre la extensin. Se limpiarn los restos de colorante que queden en el portaobjetos fuera de la extensin y se dejar que acabe de secarse al aire. 7. Observacin al microscopio. Se observarn las bacterias con su forma y agrupacin caracterstica, teidas de azul. TINCIONES DIFERENCIALES TINCIN DE GRAM Se estudia con esta coloracin la morfologa de las bacterias y su forma de agrupacin y a la vez tiene inters taxonmico ya que se emplea para diferenciar los dos tipos clsicos de microorganismos: Gram (+) y Gram (-). Las bacterias que son capaces de retener el primer colorante usado (Cristal violeta o Violeta de genciana) aun despus de la decoloracin son las denominadas Gram (+). Las bacterias Gram (-) pierden el colorante al ser tratadas con el decolorante. Como se ha indicado la diferencia entre los dos tipos reside en la pared celular: Las Gram (+) tienen una pared muy gruesa, con una malla bien engarzada, reteniendo bien el colorante durante la coloracin. La pared de las Gram (-) es mas delgada y su malla es ms floja, por lo que el decolorante destie a este tipo de bacterias. Adems las Gram (+) tienen en su pared celular un contenido de lpidos (1-4 % ) menor que en las Gram (-) ( 11-20 % ). Estos lpidos van a ser disueltos por el decolorante orgnico empleado, aumentando la permeabilidad de la membrana y eliminando el colorante, decolorndose con facilidad las Gram (-).
El valor diagnstico de esta tincin es variable; normalmente permite una buena orientacin al microbilogo para seleccionar las tcnicas de cultivo ms adecuadas y tambin tiene valor en orientar hacia un diagnstico etiolgico, en especial para instaurar un tratamiento inicial; en otras ocasiones el diagnstico puede considerarse prcticamente cierto, como ocurre en el caso de la uretritis gonoccica aguda masculina, la meningitis purulenta por meningococo o neumococo, etc. Tcnica: 1. 2. 3. 4. Extensin. Desecacin. Fijacin. Dejar enfriar. Coloracin: Se cubre la preparacin con Violeta de Genciana o Cristal violeta y se deja actuar durante 1,5 o 2 minutos. 5. Lavar ligeramente con agua para eliminar el exceso de colorante o simplemente volcar el portaobjetos y escurrir el colorante. A continuacin se cubre la preparacin con Lugol (mordiente) durante 2 minutos. El mordiente produce una unin mas intima entre el colorante y la estructura a colorear. La funcin de mordiente la tiene el Iodo; el Ioduro potsico se utiliza para favorecer la disolucin del Iodo metlico en el agua. 6. Decoloracin: Escurrir la solucin de Lugol, lavar con agua y sosteniendo el portaobjetos entre el pulgar y el ndice decolorar con Alcohol-acetona hasta apenas arrastrar colorante violeta. Al aadir cristal violeta se tien todas las bacterias, pero al decolorar solo las G (-) pierden el colorante. 7. Lavar con agua abundante a fin de detener la decoloracin. 8. Coloracin de contraste: Se cubre la preparacin con Fucsina fenicada diluida o con Safranina (preferentemente) y se deja actuar durante 1-2 minutos. 9. Lavar con agua. 10. Secado. 11. Observacin al microscopio. Las bacterias gram positivas se observan de color azul violeta y las gram negativas de color rosa. Existe una variante de la tincin de Gram ideada para daltnicos en la que en lugar de usar Safrani na o Fucsina fenicada como colorante de contraste, se emplea el marrn de Bismarck durante 30-60 segundos. Las bacterias G (-) se observarn, en este caso, de color pardo-amarillento. Hay ciertos grupos de bacterias que pierden sus caractersticas tintoriales cua ndo envejecen, pasando de G (+) a G (-); a estas bacterias se les denomina Gram lbiles o Gram variables. Se recomienda realizar la tincin de Gram a cultivos de 24 horas.
TINCIONES PARA CIDO-ALCOHOL RESISTENTES Existen una serie de microorganismos que poseen en su pared celular ciertos lpidos complejos, que dificultan la penetracin de los colorantes en la clula. Solamente utilizando colorantes enrgicos como la fucsina fenicada, y forzando su accin mediante la aplicacin de calor o prolongando el tiempo de contacto, estos microorganismos logran retener el colorante. Y lo hacen de tal manera, que incluso decolorantes muy enrgicos como el alcohol-cido no consiguen decolorarlos. Por esto se denominan cido- alcohol resistentes. Los gneros Mycobacterium, Nocardia, y los parsitos coccdeos como Cryptosporidium, se caracterizan por sus propiedades de cido-alcohol resistencia. Estas tinciones constituyen una importante ayuda para la bsqueda del bacilo de Koch (Mycobacterium tuberculosis).Entre ellas podemos citar: la tincin de Zhiehl-Neelsen y la de Kinyoun. TINCIN DE ZIEHL-NEELSEN Los colorantes y reactivos usados en esta tincin son: o Fucsina fenicada. o Alcohol-cido (decolorante). Alcohol de 961: 97 ml.; ClH : 3 ml. Hay que aadir lentamente el cido al alcohol ya que puede haber desarrollo de calor. o Azul de metileno o Verde de malaquita. Tcnica: 1. 2. 3. 4. Extensin. Desecacin. Fijacin. Dejar enfriar. Coloracin: Cubrir la preparacin con fucsina fenicada y calentar el portaobjetos o bien directamente sobre el mechero o bien utilizando un algodn impregnado en alcohol, hasta la emisin de vapores por parte de la preparacin. Cuando se observa la emisin de vapores se retirar el foco calorfico, volvindolo a aplicar 2 0 3 veces de modo que se mantenga dicha emisin durante 5 minutos. Hay que evitar la ebullicin del colorante y que en ningn momento la preparacin quede sin colorante. Tambin se puede realizar la coloracin cubriendo la preparacin con un rectngulo de papel de filtro y aadiendo el colorante de modo que quede perfectamente impregnado el papel de filtro. A continuacin se ir calentando mantenindose la emisin de vapores durante 5 minutos sin dejar que se seque el papel de filtro. 5. Se dejar enfriar y se lavar con agua. En el caso de utilizar papel de filtro se retirar este mediante unas pinzas y a continuacin se lavar con agua.
6. Decoloracin: enrgicamente con alcohol-clorhdrico hasta que la preparacin quede con un ligero tinte rosa. A continuacin se lavar con agua. 7. Coloracin de contraste: Cubrir la preparacin con azul de metileno durante 2-3 minutos. 8. Lavar con agua. 9. Secar y observar el microscopio. Los microorganismos cido-alcohol resistentes se observarn de color rojo y los restantes de color azul. Si como colorante de contraste en vez de azul de metileno se hubiera empleado verde malaquita, los microorganismos no cido-alcohol resistentes se observan de color verde. TINCIN DE KINYOUN Es una tincin cido-alcohol resistente, modificacin de la de Ziehl-Neelsen, llamada tambien como mtodo fro debido a que en lugar de emplear calor para facilitar la penetracin del colorante se aumenta la proporcin ed fenol y fucsina en la frmula del colorante con respecto a la fucsina de Ziehl. Tcnica: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Extensin. Desecacin. Fijacin. Dejar enfriar. Coloracin: Cubrir la preparacin con la fucsina de Kinyoun y dejar actuar durante 5-7 minutos-min., sin calentar. Lavar con agua o simplemente escurrir el colorante. Decolorar con alcohol-HCl. Lavar con agua. Coloracin de contraste: azul de metileno durante 2-3 min. Lavar, secar y observar al microscopio.
La observacin ser similar a la expuesta en la tincin de Ziehl-Neelsen. Cuando se observa una tincin AAR se recomienda hacer una valoracin cua ntitativa de los bacilos presentes en la muestra. El objetivo se ha de colocar en el extremo de la preparacin y se recorre toda una lnea (100 campos en objetivo de inmersin) contando los bacilos AAR encontrados. Una forma de informar nmero de BAAR observados en frotis teidos es la siguiente: N1 de BAR observados 0 1 - 2/300 F 1 - 9/100 F 9 - 9/10 F 1 - 9/F Informe del mtodo CDC Negativo para BAR (-) N1 visto (? ) N1 promedio/100 F (1+) N1 promedio/10 F (2+) N1 promedio/F (3+)
N1 de BAR observados > 9/F
Informe del mtodo CDC > 9/F (4+)
Estos datos se refieren a observacin en microscopio con objetivo de inmersin. Existen factores para establecer una equivalencia entre estos datos y los correspondientes a la observacin con objetivo 25X o 40X. TINCIONES ESTRUCTURALES Utilizan ms de un colorante y sirven para poner de manifiesto distintas estructuras bacterianas. TINCIN DE ESPORAS. MTODO DE WIRTZ-CONKLIN Algunos microorganismos tienen la propiedad de formar esporas, que son formas de resistencia. Su formacin se debe a una concentracin de protoplasma bacteriano. Pueden ser de forma esfrica u oval y de diverso tamao. Pueden ser de localizacin central, subterminal, o terminal. Tambin pueden salir al exterior. La pared de las esporas es bastante impermeable, por lo que cuesta trabajo teirlas, de modo que en las preparaciones teidas por los mtodos corrientes, las esporas aparecen como cuerpos incoloros y refringentes. Pero si se fuerza la coloracin mediante el calor, el colorante llegar a teir las esporas. Debido a la citada impermeabilidad de la pared de las esporas, durante el periodo de decoloracin, se decolorar toda la clula bacteriana excepto las esporas. Se necesitan cultivos de al menos 48 horas, para que el microorganismo haya tenido tiempo suficiente de formarlas. Tcnica: 1. 2. 3. 4. Extensin. Desecacin. Fijacin. Dejar enfriar. Coloracin: Cubrir la preparacin con verde malaquita al 5% en solucin acuosa, mantenindola a emisin de vapores durante 5 min, teniendo las mismas precauciones que las especificadas en la tincin de ZiehlNeelsen. Dejar enfriar. Lavar con abundante agua. La espora sigue teida de verde y la clula vegetativa pierde el colorante. Colorante de contraste: Safranina y dejar actuar durante 1 min. Lavar con agua.
5. 6. 7. 8.
9. Secar y observar al microscopio. Las esporas se vern de color verde y las clulas vegetativas se observarn de color rosa. La disposicin y tamao de las esporas tiene gran inters en taxonoma. Existe otra tincin de esporas, el mtodo de Moeller, que utiliza como reactivos: solucin acuosa de cido crmico, fucsina fenicada de Ziehl-Neelsen, solucin acuosa de clorhidrato de anilina, azul de metileno y alcohol absoluto. TINCIN DE FLAGELOS Para su observacin, se debe partir de cultivos jvenes, de entre seis y doce horas. Se prepara una suspensin del germen en agua destilada, mezclando suavemente hasta obtener una suspensin lechosa. Si se sospecha que el germen es patgeno, se debe utilizar agua formolada al 5-10%. Se deposita unas gotas de la suspensin en un extremo del portaobjetos inclinado, de forma que las gotas se extiendan a lo largo del cristal. Se dejar secar al aire sin aplicar calor. A) MTODO DE RHODES o Se cubre la extensin con el mordiente de Rhodes durante 3-5 min. Lavar cuidadosamente con agua destilada, mejor por inmersin. o Cubrir con la solucin de nitrato de plata amoniacal, calentndolo hasta casi ebullicin y dejndolo actuar de 3-5 min. o Lavar con agua destilada y secar. Se observa con objetivo de inmersin, directamente o bajo un cubreobjetos. Los flagelos podrn observarse gracias al precipitado de nitrato de plata que se deposita en torno suyo.
B) MTODO DE TRIBONDEAU o Se fija el frotis con alcohol y se cubre con la mezcla formada por 5 ml del mordiente de Tribondeau y 0,5 ml de cristal violeta previamente sometida a ebullicin. Se deja actuar durante 20 segundos. o Se lava rpidamente con agua, sin volcar previamente el colorante, se seca y se observa al microscopio con objetivo de inmersin. Los flagelos se vern de color castao. C) MTODO DE LEIFSON o Se cubre la preparacin con el colorante de Leifson y se deja actuar durante unos 10 minutos. o Se lava con agua, sin volcar el colorante, se seca y se observa al microscopio con objetivo de inmersin. Los flagelos se observan de color rojo oscuro a azul negruzco. TINCIN DE CPSULAS La cpsula es una capa mucosa, ms o menos gruesa, que envuelve la pared celular de algunas bacterias. A) MTODO DE HISS o Realizar un frotis espeso de una mezcla de suspensin bacteriana con solucin fisiolgica y suero sanguneo. Secar a temperatura ambiente y fijar al calor. o Cubrir la preparacin con solucin de cristal violeta al 1% y calentar con vapor fluyente durante un minuto. o Lavar con solucin de sulfato de cobre al 2%, secar y observar al microscopio con objetivo de inmersin. Las cpsulas se colorean de azul plido y las bacterias de color prpura. B) MTODO DE LA TINTA CHINA o Sin fijar el frotis, se cubre con fucsina diluida durante dos minutos. Lavar con agua destilada y secar al aire. o Se colocan en un extremo del porta dos gotas de nigrosina o de tinta china y se hace una extensin por el mtodo de los dos portaobjetos. Se deja secar y se observa al microscopio con objetivo de inmersin. El fondo aparecer negro, las bacterias teidas de rojo y la cpsula como un halo blanco que las envuelve.
TINCIN DE CORPSCULOS METACROMTICOS El gnero Corynebacterium presenta unos grnulos de reserva de fosfato, llamados grnulos o corpsculos metacromticos. A) MTODO DE ALBERT o Se fija el frotis al calor, se cubre con el colorante de Albert, se deja actuar durante 15 minutos y se lava con agua destilada. o Se cubre la preparacin con lugol durante un minuto, lavar con agua, secar a temperatura ambiente y observar con objetivo de inmersin. Los corpsculos metacromticos se tien de color azul oscuro. B) MTODO DE LOEFFLER o Fijar el frotis con calor, cubrir con el colorante de Loeffler y dejar actuar durante tres minutos. o Lavar con agua destilada, dejar secar y observar con objetivo de inmersin. Los grnulos se vern de color azul intenso. C) MTODO DE ERNST-NEISSER o Fijar el frotis al calor, cubrir con azul actico y dejar actuar durante 10 min, calentando hasta emisin de vapores los primeros minutos. o Lavar con agua destilada y cubrir con una solucin de vesuvina d urante un minuto. o Lavar, secar y observar con objetivo de inmersin. TINCIONES DIFERENCIALES PARA PARSITOS Diversas coloraciones diferenciales son empleadas para mejorar la visualizacin y destacar la estructura interna de quistes, trofozoitos u otras formas de parsitos, especialmente de los que se encuentran en heces. Entre stas podemos destacar la de Wheatley-tricromo y la de hierro hematoxilina. La coloracin con toluidina O, se emplea para el examen rpido de material del tracto respiratorio con el fin de determinar la presencia de Pneumocystis carinii. Una modificacin rpida de la coloracin de Gomori con metenamina-plata ha demostrado ser muy valiosa para el diagnstico de P. carinii en lavados bronquiales y otras muestras.
TINCIONES DIFERENCIALES PARA FROTIS DE SANGRE Y CORTES DE TEJIDOS Los parsitos que circulan en la sangre con frecuencia se encuentran dentro de los eritrocitos o libres en el plasma. Se han desarrollado diversas coloraciones que permiten diferenciar estos parsitos de los componentes celulares normales. Las dos coloraciones que se emplean ms comnmente son la de Wright y la de Giemsa. La tincin de Giemsa tambin se emplea para visualizar inclusiones virales o de otro origen en las clulas infectadas que se obtienen directamente de materiales clnicos, como la base de vesculas que se supone son herpticas o raspados de crnea en casos sospechosos de conjuntivitis por Chlamydia trachomatis. Tambin puede detectarse mediante la coloracin de Giemsa la presencia de otros parsitos como toxoplasma en tejido cerebral. Ni la tincin de Wright ni la de Giemsa teirn en forma regular los elementos fngicos o bacterianos, de modo que deben usarse junto con otras coloraciones si se desconoce totalmente la etiologa de la supuesta infeccin. Se conocen otras tinciones que son empleadas para propsitos especiales, como la coloracin con yodo para detectar la presencia de inclusiones en monocapas celulares infectadas con clamidias, la de Sellers para cuerpos de inclusin en tejidos infectados con el virus de la rabia y la de Gimnez para Chlamydia y Legionella.
TINCIONES PARA HONGOS Los elementos de los hongos pueden visualizarse en materiales fijados por diversas coloraciones. La coloracin con cido preydico-Schiff (PAS) es probablemente una de las mejores tinciones generales ya que la mayora de los ho ngos presentes en materiales clnicos (esputo, tejidos, etc.) tomarn la coloracin. La metenamina-plata, adems de teir a ciertos parsitos, tambin colorea las paredes de las clulas micticas de marrn oscuro-negro. El polisacrido capsular de ciertos hongos, especialmente Cryptococcus neoformans, toma un color rosa brillante con la coloracin de mucicarmn, que ha demostrado ser muy til para diferenciar este hongo en los tejidos.
TINCIONES FLUORESCENTES Algunos colorantes denominados fluorocromos tienen la propiedad de ser excitados cuando absorben luz ultravioleta (luz de longitud de onda corta). A medida que las molculas excitadas regresan a su estado normal, liberan el exceso de energa en forma de luz visible de mayor longitud de onda que la radiacin excitante. Esta propiedad se denomina fluorescencia. Los objetos fluorescentes aparecen brillantemente iluminados contra un fondo oscuro, segn el color del colorante usado. En la figura anterior se representa un diagrama de un microscopio de fluorescencia. TINCIN FLUORESCENTE CON AURAMINA-RODAMINA Es una tincin muy usada para micobacterias, cuando el volumen de muestras a examinar es elevado. Se fundamenta en la afinidad que poseen los cidos miclicos de la pared celular de las micobacterias por los colorantes fluorescentes o fluorocromos Auramina y Rodamina. Estos colorantes se fijan a las bacterias que aparecen de color amarillo o naranja brillante contra un fondo oscuro. Un aspecto importante de la coloracin rodamina-auramina es que luego los frotis pueden ser reteidos con la coloracin de Ziehl-Neelsen o Kinyoun directamente sobre la tincin con el fluorocromo, si se elimina antes el aceite de inmersin. Tcnica: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Extensin. Desecacin. Fijacin. Dejar enfriar. Coloracin: Cubrir la preparacin con el colorante auramina-rodamina previamente filtrado. Mantenerlo as durante 15 min. No hay que calentar. Lavar con agua destilada. Decoloracin con alcohol -HCl. Cubrir la preparacin con el decolorante y dejar actuar de 3 a 4 minutos. Lavar con agua destilada. Aadir permanganato potsico al 0,5% en agua destilada y dejar actuar de 2 a 4 minutos. El permanganato se utiliza para eliminar la fluorescencia residual de los desechos de fondo. Pero debe evitarse el tratamiento excesivo con el contracolorante porque puede rebajar la intensidad fluorescente de los bacilos coloreados. Lavar con agua destilada.
9.
10. Secar al aire y observar con el microscopio de fluorescencia. El agudo contraste entre las micobacterias coloreadas brillantemente y el fondo oscuro ofrece las grandes ventajas de una fcil, rpida y completa observacin. Puede usarse un objetivo de 25X (100X en la tincin de Ziehl-Neelsen y similares), para observar el frotis, lo que permite la inspeccin de un rea extensa en poco tiempo. Otras ventajas son el mejor contraste, el mnimo esfuerzo visual y la relativa falta de importancia de la agudeza para el color del observador. TINCIN FLUORESCENTE CON NARANJA DE ACRIDINA Se basa en la tincin de los cidos nucleicos de los microorganismos por el fluorocromo naranja de acridina. Esta tincin se utiliza principalmente para el estudio de microorganismos en hemocultivos y lquido cefalorraqudeo. La tcnica es muy simple: o Cubrir la preparacin ya fijada con solucin de naranja de acridina durante 2 min. o Lavar con agua destilada. o Dejar secar. o Observar al microscopio de fluorescencia. Las bacterias se observan de color naranja fluorescente. TINCIN FLUORESCENTE CON BLANCO DE CALCOFLOR Las paredes celulares de los hongos fijan el colorante blanco de calcoflor aumentando considerablemente su visibilidad en los tejidos y otras muestras. En algunos laboratorios ha suplantado al azul de lactofenol en muchas aplicaciones. Los organismos fluorescen con luz blanco-azulada o verde manzana, segn la fuente luminosa. TINCIONES DE INMUNOFLUORESCENCIA Estas tinciones se basan en el uso de colorantes conjugados con anticuerpos. Se emplean con profusin en el laboratorio los anticuerpos monoclonales, que son muy especficos, conjugados con isotiocianato de fluorescena. Sus indicaciones son de dos tipos: o La tincin de inmunofluorescencia directa (IFD) es til para el diagnstico de Legionella, Neisseria gonorrhoeae y microorganismos difciles de cultivar como Treponema, Pneumocystis, Chlamydia, y virus Herpes. o La tincin de inmunofluorescencia indirecta (IFI) se utiliza preferentemente para el diagnstico de algunas viriasis, investigando los anticuerpos en el suero (virus Epstein-Bar).
MICROSCOPA ELECTRNICA El microscopio electrnico emplea electrones en vez de luz para visualizar objetos pequeos. Mediante el empleo del microscopio electrnico se han descubierto muchas caractersticas morfolgicas de las bacterias, componentes bacterianos, hongos y parsitos. La microscopa electrnica permite efectuar el diagnstico directo presuntivo de diversas infecciones vricas, en particular las gastroenteritis e infecciones por herpes simple.
TEMA 14.- TCNICAS DE CULTIVO Y AISLAMIENTO DE PATGENOS

INTRODUCCIN. Para estudiar las reacciones metablicas de las bacterias es necesario cultivarlas en medios de cultivo, que son mezclas de sustancias que proporcionan en forma asimilable todos los elementos necesarios para su crecimiento y multiplicacin. Los medios de cultivo deben incluir los elementos indispensables para la vida bacteriana, tales como carbono, nitrgeno, hidrgeno y oxgeno, elementos minerales (fsforo, azufre, calcio, magnesio e hierro), micronutrientes o elementos traza (Zn, Co, Cu, Mn,...) y factores de crecimiento (vitaminas, bases pricas y pirimidnicas, aminocidos,...) COMPONENTES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO. COMPONENTES BSICOS: Agua: Para asimilar los alimentos, las bacterias necesitan agua. Tambin da condiciones de humedad necesaria para la vida. El agua ser destilada ya que la del grifo contiene calcio y magnesio que pueden formar precipitados con otros compuestos del medio de cultivo. Peptonas: protenas parcialmente hidrolizadas. Principalmente son fuente de nitrgeno, y tambin de carbono, azufre... Extracto de carne: Constituye una fuente de carbono, nitrgeno, sales inorgnicas y factores de crecimiento. Cloruro sdico : Tiene como fin proporcionar un adecuado equilibrio osmtico. Incrementa la presin osmtica del medio para evitar la lisis de las bacterias. Agentes solidificantes: Los contienen los medios slidos y semislidos. El agar es el ms usado; la gelatina y la albmina se usan escasamente.
OTROS COMPONENTES: Sustancias inhibidoras de crecimiento : Son sustancias que impiden el crecimiento de los microorganismos que no nos interesan que se desarrollen. Entre stas podemos citar colorantes como el cristal violeta, el verde brillante que inhiben a gram positivos; sales biliares que tambin inhiben a gram positivos; antibiticos, etc.
Indicadores: Se utilizan para detectar variaciones en la acidez o alcalinidad del medio causadas por el metabolismo bacteriano. Estas variaciones se aprecian por el cambio de color del indicador. Sustancias enriquecedoras: Son sustancias que se aaden para favorecer el crecimiento de ciertos microorganismos que son ms exigentes. Ej.: suero, leche, sangre, huevo. Agentes reductores: Se aade a los medios para promover la anaerobiosis. Entre los ms empleados estn: tioglicolato sdico, cistena, c. ascrbico. Hidratos de carbono: sobre todo mono y disacridos. Se pueden adicionar con fines de nutricin o para realizar pruebas de identificacin bioqumica. Sales minerales: sulfatos y fosfatos de calcio, potasio, magnesio, hierro,.. Tampones estabilizadores del pH : ya que ste puede variar durante el proceso de preparacin del medio o como consecuencia de la acumulacin de los productos del metabolismo bacteriano.
PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO. NORMAS GENERALES. Los medios de cultivo se comercializan desecados, en forma de polvo, para su disolucin y esterilizacin. Actualmente se pueden adquirir tambin medios slidos ya preparados, dispuestos en frascos, que se licuan mediante ebullicin y se dispensan en placas; medios en tubos y medios slidos en placa, listos para su inoculacin. Aunque esta ltima prctica se ha extendido enormemente facilitando el trabajo rutinario, conviene conocer las operaciones necesarias para preparar un medio de cultivo en buenas condiciones. Para ello seguiremos los siguientes pasos: A) PESADA DE LOS COMPONENTES: Debe ser lo ms precisa posible. Como hemos dicho anteriormente, actualmente los medios vienen deshidratados y no habra que pesar uno por uno cada componente.
B) DISOLUCIN DE LOS COMPONENTES: Siempre se hace en agua destilada, salvo indicacin contraria. El agua desionizada no se aconseja. Los recipientes deben ser de vidrio y estar limpios. El calor favorece o es imprescindible para la disolucin de algunos productos, pero debe limitarse al estrictamente necesario, sin llegar a la ebullicin prolongada. Para evitar el desborde por ebullicin, los envases con soluciones que deben ser esterilizadas en el autoclave, slo deben contener dos tercios de su volumen total de lquido. C) AJUSTE DEL pH: Es muy importante para la calidad del medio. Se realiza con tiras indicadoras y soluciones de cidos y bases. Normalmente se ajustan a pH neutro. D) REPARTO EN RECIPIENTES: Si el medio preparado se va a utilizar en tubos o frascos, se repartir en stos con ayuda de un dosificador, se les pondr un tapn y una vez rotulados se dispondrn en gradillas o cestillos de autoclave y se proceder a su esterilizacin. Si el medio se fuera a repartir en placas de Petri, se esterilizar en el matraz donde se hubiese preparado y posteriormente se repartir ante mechero en placas estriles. E) ESTERILIZACIN: Se suele realizar en el autoclave a 1 atm. de sobrepresin (121 C), durante 1520 min..En caso de medios de cultivo que no se puedan esterilizar a estas temperaturas, se recurrir a la filtracin esterilizante o bien a la tindalizacin. Una vez que el ciclo de esterilizacin ha finalizado, debe reducirse lentamente la presin dentro del autoclave. El medio no debe permanecer dentro de ste una vez que se ha equilibrado la presin, ya que el calentamiento prolongado puede alterar alguno de los componentes. F) CONSERVACIN DE LOS MEDIOS: Deben conservarse en el refrigerador (las placas, invertidas e introducidas en bolsas de plstico; los tubos, convenientemente tapados). Transcurrido un mes, no se debe usar ningn medio. Si se quiere comprobar la esterilidad del medio, se incuban las placas o tubos a 37 C durante 48 h. y se comprueba si hay crecimiento. La calidad final del medio de cultivo preparado depende de la forma en que se prepara, por lo que es de real importancia que se sigan las normas expuestas anteriormente.
CLASIFICACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO. Se pueden clasificar atendiendo a distintos criterios: ATENDIENDO A SU ESTADO FSICO: Lquidos: favorecen mucho el desarrollo y multiplicacin de las bacterias porque al difundirse estas por todo el medio encuentran fcilmente las sustancias que necesitan para nutrirse. No contienen agar. Slidos: contienen de 15 a 17 g de agar por litro. Las bacterias crecen con mayor dificultad; no obstante, son de gran utilidad para el estudio de las caractersticas de crecimiento, de la produccin de hemlisis y otras peculiaridades. Semislidos: se utilizan mucho para observar la movilidad de los m icroorganismos. Contienen agar en una proporcin de 3 a 5 g. por litro.
ATENDIENDO A SU UTILIDAD: GENERALES O COMUNES : Son apropiados para el cultivo de la mayora de los microorganismos por la facilidad con que se desarrollan en ellos. Se usan para cultivar bacterias poco exigentes. Entre ellos podemos citar el caldo nutritivo, el TSB, el agar nutritivo y el TSA. MEDIOS ESPECIALES: Conocidos tambin como especficos, van dirigidos al cultivo de determinadas especies bacterianas o son utilizados con fines de diferenciacin. Entre stos tenemos: A) MEDIOS ENRIQUECIDOS: son medios generales a los que se les aade ciertos productos (sangre, suero, glucosa,...), favoreciendo as el crecimiento de ciertos microorganismos muy exigentes. Ejemplos: agar-glucosa (agar nutritivo aadido de glucosa), agar sangre (agar nutritivo aadido de sangre), agar chocolate , etc. B) MEDIOS SELECTIVOS: estos medios contienen componentes que inhiben el desarrollo de ciertos microorganismos, lo cual permite aislar el microorganismo que se busca. Entre estos medios podemos citar: agar Salmonella-Shigella (agar SS, selectivo para Salmonellas y Shigellas), agar MacConkey (se utiliza para el aislamiento de Enterobacterias), agar de Thayer-Martin (selectivo para Neisseria), agar Manitol salado (Chapman, selectivo de Estafilococos coagulasa positivos), agar de Lowenstein-Jensen (selectivo para el cultivo de micobacterias, es-
pecialmente Mycobacterium tuberculosis, agar de Sabouraud (para el cultivo de la mayora de las levaduras y hongos patgenos). C) MEDIOS DIFERENCIALES: son aqullos en los que adems de crecer las bacterias, al actuar stas sobre alguno de los componentes especficos del medio, demuestran alguna de sus propiedades bioqumicas. Contienen azcares e indicadores, concebidos para provocar una respuesta bioqumica conocida (si la bacteria es capaz de fermentar el azcar que lleva el medio, se producir una acidificacin del medio con el consiguiente viraje de color del medio por el cambio de pH). Ejemplos:Agar hierro de Kligler, Agar de MacConkey (diferencia los bacilos entricos fermentadores y no fermentadores de la lactosa. Fermentadores de lactosa---> colonias rosas; No fermentadores de lactosa (lactosa negativos) ---> colonias incoloras). D) MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO: son medios lquidos que favorecen o permiten la multiplicacin de unas bacterias, inhibiendo parcial o totalmente la de otras. Ejemplos: agua de peptona alcalina (favorece la multiplicacin de Vibrio cholerae), caldo selenito (favorece el crecimiento de Salmonellas y Shigellas, fundamentalmente Salmonellas). E) MEDIOS DE TRANSPORTE: se utilizan para asegurar la viabilidad de las bacterias desde el momento de la toma de las muestras hasta su posterior siembra en el laboratorio o para su envo de unos laboratorios a otros. Actualmente los medios de transporte ms utilizados son los de Stuart, Amies, y el medio de Cary-Blair. F) MEDIOS DE CONSERVACIN: son una variacin de los medios de transporte. Aseguran las caractersticas morfolgicas y fisiolgicas de las bacterias por un periodo largo de tiempo. Ejemplo: agar de tripticasa y soja. Un gran nmero de medios de cultivo utilizados en el laboratorio de microbiologa se podran englobar en varios de los grupos anteriormente expuestos. Ej.: agar sangre, es un medio enriquecido y diferencial. CONDICIONES PATGENOS. NECESARIAS PARA EL DESARROLLO DE LOS
Para que las bacterias y hongos puedan desarrollarse en un medio artificial, adems de tener los nutrientes necesarios, se deben cumplir una serie de condiciones:
CONDICIONES ATMOSFRICAS: Los microorganismos patgenos pueden ser aerobios, anaerobios, microaerfilos, anaerobios facultativos y capnfilos. Aerobios; es decir, utilizan el oxgeno como aceptor terminal de electrones y presentan un desarrollo abundante en una atmsfera con la concentracin normal del aire. Anaerobios: relativamente intolerantes a la presencia de oxgeno. Microaerfilos: crecen bien en atmsferas con menor presin de oxgeno. Anaerobios facultativos : pueden crecer en condiciones aerobias o anaerobias. Capnfilos: crecen mejor en una atmsfera con mayor concentracin de CO2 que la ambiental. Los microorganismos aerobios y anaerobios facultativos pueden ser incubados en una concentracin de aire ambiental sin mayor dificultad. Los microorganismos capnfilos pueden ser cultivados en una estufa de incubacin con puertas selladas, en una atmsfera de 5-10% de CO2.Una mezcla adecuada de gas, contenido en cilindros cercanos, penetra automticamente en la estufa. Como rutina debe controlarse la concentracin de CO2. El sistema ms comnmente usado para crear una atmsfera especfica anaerobia o capnfila es la jarra anaerobia. Las que se encuentran en el comercio son la GasPak y las de Scott Laboratories y Oxoid U.S.A. Ambos sistemas utilizan una jarra de plstico transparente, pesada, con una abrazadera para evitar prdidas. Existen modelos que presentan en la tapadera un manmetro y vlvulas para hacer el vaco y para introducir la mezcla gaseosa que proporciona la anaerobiosis. En la cara interior de la tapadera hay una especie de "clip" para sujetar la bolsa que lleva el catalizador. Las jarras para anaerobiosis se emplean principalmente para cultivos en placas.
La atmsfera anaerobia en el interior de estas jarras se puede conseguir segn varios procedimientos: A) TCNICA DE EVACUACION/REEMPLAZO: En este procedimiento se precisa primero crear el vaco mediante una bomba de vaco y una vez hecho sto se introducir la mezcla gaseosa que suele estar constituida por un 10% de H2 , 5% de CO2 y 85% de N2 . Se usa un indicador redox que nos permite controlar si se ha producido o no la atmsfera anaerobia. B) TCNICA QUE EMPLEA UN SISTEMA GENERADOR DE H 2 Y CO2: En este sistema utilizaremos: * Generador descartable de H2-CO2, que consiste en una envoltura sellada de papel de aluminio que contiene dos tabletas, una de las cuales contiene a su vez cido ctrico y bicarbonato sdico y la otra borohidruro de sodio. Cuando se introduce agua en este sobre, la primera tableta libera CO2 y la segunda libera H2. El H2 producido, en presencia del catalizador, reaccionar con el oxgeno presente, produciendo agua. 2H2 + O2 ------> 2H2 O
Existen sobres generadores de atmsferas especiales requeridas por determinados microorganismos. * Indicador de anaerobiosis: los hay de tipo bacteriolgico y qumico. Los bacteriolgicos consisten en introducir en la jarra un cultivo de un aerobio estricto; si ste crece, indica un fallo en el establecimiento de la atmsfera de anaerobiosis. El inconveniente de estos indicadores es que los resultados no son conocidos hasta el final del perodo de incubacin. Por ello, son ms usados los indicadores qumicos , los cuales se decoloran cuando estn reducidos. En el mercado existen indicadores qumicos como son
las tiras de azul de metileno y tiras de resazurina. El azul de metileno es azul cuando est oxidado y la resazurina es rosa. * Catalizador en "fro": consta de unas bolitas de almina recubiertas de paladio. Este catalizador se inactiva por el SH2 y otros productos metablicos voltiles producidos por las bacterias, as como por el exceso de humedad. Se asegura una actividad ptima del catalizador reemplazndolo por uno nuevo cada vez o bien "reactivndolo" despus de cada utilizacin, lo cual se consigue calentndolo en el horno a 160-170C durante 2 horas, y mantenindolo en recipiente seco y limpio despus del calentamiento. El proceso a seguir en esta tcnica es el siguiente: 1. Reemplazar el catalizador por uno nuevo o "reactivado." 2. Colocar los materiales a incubar en la jarra; si son placas se colocaran en el portaplacas de forma invertida 3. Abrir el sobre del indicador y exponer unos 10 mm de la tira. 4. Aadir 10 ml de agua al sobre generador. 5. Cerrar la jarra hermticamente y meterla en estufa para incubacin. 6. Se puede comprobar el buen desarrollo del proceso por los siguientes datos: a. La tapadera, con el catalizador en su superficie interna, debe estar caliente al tacto. b. Debe aparecer en el interior de la jarra agua de condensacin a los 15-30 minutos de haber aadido el agua al generador. c. El indicador cambiar de color a las dos o tres horas. d. Si la jarra lleva manmetro, se puede observar el buen desarrollo del proceso mediante la evolucin de los cambios de presin: la produccin de gas origina una presin positiva de aproximadamente 0,3 bar. La presin bajar en un perodo de 30-40 minutos a 0,1 bares aproximadamente. C) TCNICA QUE EMPLEA UN SISTEMA GENERADOR DE CO2: En este sistema se utiliza el generador descartable de CO2 y un indicador de anaerobiosis (igual al descrito anteriormente.) El generador descartable de CO2 consiste en un sobre que contiene como principio activo el cido ascrbico. Cuando este sobre se coloca en una jarra cerrada, el oxgeno atmosfrico de la jarra es rpidamente absorbido con la generacin simultnea de dixido de carbono. Este mtodo difiere del anterior en que la reaccin contina sin produccin de hidrgeno, y por tanto no requiere un catalizador. Tampoco es necesaria la adicin de agua para activar la reaccin. Precauciones: tan pronto como la bolsita es expuesta al aire se inicia la reaccin. Es por tanto esencial colocar sta en la jarra y cerrar sta ltima en menos de un minuto.
Las condiciones anaerobias estrictas que exigen algunos microorganismos pueden obtenerse en sistemas cerrados como una caja con guantes anaerobios o cmara anaerobia, que consiste en una cmara de gas sellada con puertas en forma de guantes y una cerradura para la transferencia de materiales dentro y fuera de la cmara. El operador coloca sus manos y brazos dentro de los gua ntes para manejar los materiales de cultivo que se han colocado dentro. Para crear la atmsfera de anaerobiosis se usa un sistema similar al descrito en la tcnica de evacuacin/reemplazo en la jarra de anaerobiosis. Con objeto de eliminar el oxgeno residual que haya podido quedar se hace circular H2 a travs de un catalizador de paladio. Los medios se incuban dentro de una incubadora colocada dentro de la cmara o bien manteniendo toda la cmara a 35 C. TEMPERATURA: La temperatura ptima de incubacin para la mayora de los patgenos humanos est prxima a la corporal (35-37 C), pero existen variaciones. Algunos no pueden soportar esta T, y otros tienen un margen ms amplio. Determinados hongos y levaduras dermatofitos, crecen mejor a temperatura ambiente, prxima a los 30C. Es muy importante que la T de incubacin se mantenga en los lmites establecidos durante todo el proceso .La humedad puede ser controlada de forma automtica si se hace llegar agua desde una fuente externa a medida que el sistema lo necesita o manualmente si se coloca un recipiente con agua en el estante inferior de la estufa. TIEMPO DE INCUBACIN : Ser de 18-24 h, en trminos generales. Algunas bacterias necesitan una incubacin adicional para desarrollarse bien y han de mantenerse hasta 48-72 h. A veces ser necesario ms tiempo, como por ejemplo las que crecen a T < 17 (psicrfilas) se mantienen 5 das a 17 C.; 15 das para los hongos dermatofitos. pH DEL MEDIO : Las bacterias se desarrollan habitualmente a pH prximo a la neutralidad, aunque algunas exigen un pH especfico distinto. PRESIN OSMTICA: Debido a la composicin de la pared celular bacteriana, las bacterias se adaptan bien a las variaciones de la presin osmtica; sin embargo, "in vitro", los medios de cultivo se preparan en condiciones de isotona.
CARACTERISTICAS DE ALGUNOS MEDIOS DE CULTIVO EMPLEADOS CON MAYOR FRECUENCIA. Existen en el mercado una extenssima variedad de medios de cultivo, tiles para su empleo en el laboratorio de Microbiologa clnica, con lo que se van a considerar solamente aquellos de mayor inters para el diagnstico general. AGAR NUTRITIVO Composicin: extracto de carne, peptona, cloruro sdico, agar y agua destilada. Es un medio de cultivo general.Sirve como base para la preparacin de otros medios enriquecidos y selectivos. CALDO DE TRIPTICASA Y SOJA ( TSB ) Composicin: tripticasa, soja y agua destilada. Es un medio de uso general. Se puede adicionar de agar para obtener un medio slido que, dispuesto en tubos inclinados, es de utilidad para el mantenimiento de microorganismos. Si se le aade cistina se obtiene un medio ms reducido y capaz de conservar microorganismos que requieren bajas concentraciones de oxgeno. INFUSION DE CEREBRO Y CORAZON( BHI ) Composicin: infusin de cerebro y corazn, peptona, glucosa, cloruro sdico, fosfato disdico y agua destilada. Es un medio enriquecido. Es un excelente caldo para hemocultivo. CALDO DE TIOGLICOLATO Composicin: casena, extracto de levadura, cloruro sdico, glucosa, tioglicolato sdico, L-cistina, resazurina, agar y agua destilada. Es el caldo de enriquecimiento ms comnmente usado en microbiologa clnica. Este medio lleva agentes reductores (tioglicolato y L-cistina) que disminuyen el cociente de xido-reduccin y favorece el desarrollo de anaerobios. La resazurina acta como indicador (presenta color rosa en estado oxidado).La pequea proporcin de agar (0,75 g/l) que contiene el medio tiene como finalidad evitar que las corrientes de conveccin transporten el oxgeno atmosfrico a toda la masa de caldo.
AGAR DE STUART Composicin: cido tiogliclico, glicerofosfato sdico, cloruro clcico, agar y agua destilada. Es un medio especialmente creado para el transporte de muestras. Va dispuesto en tubos, en estado semislido y con una profundidad adecuada, para conseguir el fin que pretende. AGAR DE MUELLER-HINTON Composicin: infusin de carne, aminocidos, almidn, agar y agua destilada. Es un medio enriquecido, utilizado como medio de eleccin para realizar pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos (antibiograma). AGAR SANGRE Composicin: extracto de carne, peptona, cloruro sdico, sangre, agar y agua destilada. Es un medio enriquecido utilizado para el cultivo de microorganismos exigentes, as como para estudiar la actividad hemoltica. El medio base utilizado con mayor frecuencia para la fabricacin de agar sangre es el TSA (agar tripticasa soja), al que se adiciona sangre desfibrinada de carnero, conejo o caballo en una proporcin del 5-10%.La sangre se aade al agar esterilizado y enfriado a 45-50 C, evitando la formacin de burbujas. La sangre humana procedente de banco tiene el inconveniente de contener citrato, que puede inhibir el crecimiento de algunos microorganismos. AGAR SANGRE PARA ANAEROBIOS Se trata del mismo medio de agar sangre, al que se adicionan antibiticos para el aislamiento selectivo de anaerobios. Los aminoglucsidos y la vancomicina son los ms empleados. El medio toma el nombre del antibitico que lleva incorporado: ejemplo agar kanamicina-vancomicina. Medios enriquecidos muy utilizados son los de Schaedler y Wilkins-Chalgren. AGAR CHOCOLATE Composicin: extracto de carne, peptona, cloruro sdico, sangre, agar y agua destilada. Lleva como base agar nutritivo, al que se agrega sangre desfibrinada cuando el medio est a una temperatura de aproximadamente 80 C. El calentamiento tiene como fin la liberacin de los factores X ( hemina) y V (difosfo-piridn-adennFederacin de Sanidad de las CC.OO.CC. Pgina 202 de 299
nucletido), necesarios para el desarrollo de algunos microorganismos. Est especialmente indicado para Neisseria y Haemophilus. AGAR CLED Composicin: extracto de carne, peptona, triptona, L-cistina, lactosa, azul de bromotimol, agar y agua destilada. Utilizado para el aislamiento y recuento de microorganismos en la orina. La deficiencia en electrolitos logra inhibir la invasin o swarming del gnero Proteus. La lactosa permite diferenciar los microorganismos fermentadores por el viraje del indicador a amarillo. AGAR MAC CONKEY Composicin: peptona, lactosa, cloruro sdico, sales biliares, cristal violeta, rojo neutro, agar y agua destilada. Es el medio primario selectivo y diferencial que se emplea ms a menudo para el aislamiento y diferenciacin de bacilos entricos gram negativos fermentadores y no fermentadores de lactosa. Las sales biliares y el cristal violeta actan como inhibidores de gram positivos. Las bacterias que fermentan la lactosa producen colonias de color rojo que pueden estar rodeadas de una zona opaca debida a la precipitacin de las sales biliares; las no fermentadoras dan colonias incoloras ms o menos transparentes. AGAR DE LEVINE O EOSINA AZUL DE METILENO (EMB) Composicin: peptona, fosfato dipotsico, lactosa, eosina, azul de metileno, agar y agua destilada. Es un medio selectivo y diferencial que se usa para el aislamiento, el cultivo y diferenciacin de bacilos entricos gram negativos. Las colonias fermentadoras de la lactosa presentan un tono violeta ms o menos intenso. AGAR XLD (Xilosa-Lisina-Desoxicolato sdico) Composicin: extracto de levadura, xilosa, lactosa, sacarosa, lisina, desoxicolato sdico, cloruro sdico, tiosulfato sdico, citrato frrico-amnico, rojo fenol, agar y agua destilada. Se considera un medio de selectividad moderada recomendado para el aislamiento de Shigella (colonias transparentes no fermentadoras) y Salmonella (colonias transparentes y negras no fermentadoras). El citrato y tiosulfato permiten la visualizacin de microorganismos productores de sulfhdrico como colonias con centros negros. El desoxicolato sdico acta como agente selectivo.
AGAR DE HEKTOEN Composicin: extracto de levadura, peptona, lactosa, sacarosa, salicina, sales biliares, fucsina cida, cloruro sdico, hiposulfito sdico, citrato frrico-amnico, azul de bromotimol, agar y agua destilada. Es un medio diferencial y altamente selectivo para Salmonellas y Shigellas. Al igual que el agar XLD, no necesita ser esterilizado en el autoclave antes de verterlo en las placas, debido a que son tan pocos los microorganismos que pueden desarrollar en l. AGAR S-S (SALMONELLA-SHIGELLA) Composicin: extracto de carne, peptona, lactosa, sales biliares, citrato sdico, citrato frrico, tiosulfato sdico, verde brillante, rojo neutro, agar y agua destilada. Es un medio diferencial selectivo utilizado para el aislamiento de Salmonellas y Shigella. El desarrollo de otros bacilos gram negativos y de cocos gram positivos est inhibido por el verde brillante, las sales biliares y las elevadas concentraciones de tiosulfato y citrato. CALDO DE SELENITO Composicin: triptona, fosfato disdico, lactosa, selenito sdico y agua destilada. Se utiliza para el enriquecimiento de Salmonella. El selenito presente en el medio inhibe a otras bacterias entricas en las primeras horas de incubacin. CALDO GN Composicin: triptona, glucosa, manitol, citrato sdico, desoxicolato sdico, cloruro sdico, fosfato dipotsico, fosfato monopotsico y agua destilada. Se emplea como caldo de enriquecimiento selectivo para el cultivo de Salmonellas y Shigellas. CALDO DE TETRATIONATO Composicin: peptona de soja, hidrolizado trpsico de casena, cloruro sdico, carbonato clcico, bilis, tiosulfato sdico y agua destilada. Es un medio selectivo utilizado para el enriquecimiento de Salmonella. AGAR CIN Composicin: extracto de levadura, peptona, manitol, sales biliares, cefsulodina, irgasn, novobiocina, rojo neutro, cristal violeta, agar y agua destilada.
Es un medio selectivo para Yersinia. AGAR MANITOL SALADO (CHAPMAN) Composicin: extracto de carne, peptona, cloruro sdico, manitol, rojo fenol, agar y agua destilada. Es un medio selectivo utilizado para el aislamiento de Staphylococcus, basado en la tolerancia que poseen a una alta concentracin de cloruro sdico (7,5%). Sirve tambin como medio diferencial de cepas fermentadoras del manitol. Staphylococcus aureus en condiciones anaerobias es la nica especie del gnero que produce esta fermentacin. AGAR DE THAYER MARTIN Tiene como base el agar chocolate, suplementado por la adicin de extracto de levadura y otros factores de enriquecimiento. Tambin lleva aadidos antibiticos tales como vancomicina, colimicina y nistatina, lo que le confiere un carcter altamente selectivo. El medio de Thayer Martin permite el crecimiento de cepas exigentes de Neisseria, tales como Neisseria gonorrhoeae y Neisseria meningitidis. AGAR NEW YORK CITY(NYC) Es un medio muy similar al anterior, usado con los mismos fines. Adems de los tres antimicrobianos del agar de Thayer-Martin, lleva aadido trimetoprim para hacerlo ms selectivo. AGAR GARDNERELLA Composicin: extracto de carne, peptona, cloruro sdico, sangre humana, tween 80, cido nalidxico, colimicina, anfotericina B, agar y agua destilada. Permite el crecimiento rpido de Gardnerella vaginalis. AGAR GRANADA Composicin: proteosa peptona, almidn, glucosa, piruvato sdico, fosfato disdico, MOPS hemisdico, metotrexato, colimicina, metronidazol, cristal violeta, suero de caballo, agar y agua destilada. Es un medio especial y selectivo para el aislamiento, deteccin e identificacin de Streptococcus agalactiae (grupo B).Para que el medio ofrezca un rendimiento del 100% debe incubarse en anaerobiosis.
AGAR DE BORDET-GENGOU Composicin: infusin de patata, proteosa peptona, cloruro sdico, glicerol sangre, agar. Es un medio enriquecido que se utiliza para el aislamiento de las especies del gnero Bordetella. MEDIO DE LOEFFLER Composicin: suero de buey, caldo glucosado, polvo de huevo. Se utiliza para el cultivo de Corynebacterium y otros microorganismos exigentes. Asimismo en l se pone en evidencia la cromognesis y poder proteoltico de ciertas bacterias. AGAR SABOURAUD Composicin: peptona, glucosa, agar y agua destilada. Este medio se adapta particularmente al cultivo de la mayora de levaduras y hongos patgenos. El medio contiene una cantidad mnima de nutrientes y un pH cido (5,6) que lo hace selectivo. Suele adicionarse de antibiticos (gentamicina, cloranfenicol) para potenciar su selectividad. AGAR DE LOWENSTEIN-JENSEN Composicin: fosfato monopotsico, sulfato magnsico, citrato magnsico, asparagina, fcula de patata, glicerina, verde malaquita, huevo y agua destilada. Es un medio utilizado para el cultivo de Mycobacterium. En este medio tambin pueden crecer y diferenciarse las especies del gnero Nocardia. Se debe esterilizar por tindalizacin. AGAR CAMPYLOBACTER (PRESTON) Composicin: caldo nutritivo, carbn activado, hidrolizado de casena, desoxicolato sdico, sulfato ferroso, piruvato sdico, cefoperazona, agar y agua destilada. Ha sido especialmente preparado para el cultivo y diferenciacin de especies del gnero Campylobacter a partir de muestras fecales. La incubacin a temperatura elevada (42C) limita mucho el crecimiento de la flora acompaante. Otro medio tambin utilizado para el aislamiento de Campylobacter es el agar Skirrow.
AGAR COLUMBIA Composicin: mezcla de peptonas, almidn, cloruro sdico, agar y agua destilada. Es un medio enriquecido que se utiliza para el cultivo de microorganismos exigentes y como base para la preparacin de agar sangre y agar chocolate. AGAR TCBS Composicin: peptona de casena, peptona de carne, extracto de levadura, citrato sdico, tiosulfato sdico, agar y agua destilada. El agar TCBS es un medio selectivo utilizado para el aislamiento de Vibrio. TECNICAS DE AISLAMIENTO EN PLACA O INOCULACION POR ESTRIAS Y RECUENTO DE PATOGENOS Para el aislamiento, por lo general el inculo se extiende sobre la superficie de las placas segn un modelo o patrn estandarizado, de modo que el desarrollo bacteriano pueda ser determinado en forma semicuantitativa o relativa. Un modelo til de estras se presenta en la figura.
Hay otras tcnicas de estriacin, con ligeras modificaciones, que persiguen fines concretos: estriacin de 3/4 de la placa para muestras con alto contenido microbiano, estriacin de varias placas en cadena para muestras con flora mixta difcil de separar (aislamiento por agotamiento), descarga central con estriaciones laterales para muestras con escaso contenido microbiano, estriacin libre, segn las preferencias. Cuando se trabaja con muestras muy espesas, como esputo, y con algunos medios muy selectivos, como los agares para heces, se obtienen mejores aislamientos si se lleva el asa varias veces al rea de inoculacin original durante la etapa de siembra inicial. Consideremos que para la mayora de las muestras no es necesario quemar el asa entre dos reas de siembra, pero puede ser beneficioso cuando el inculo original proviene de una colonia bacteriana en crecimiento.
Para facilitar el recuento de las colonias debe sembrarse la placa con una cantidad medida de inculo con un asa calibrada y siguiendo la tcnica de siembra masiva, como se muestra en la figura.
TEMA 15.- MTODOS DE IDENTIFICACIN BACTERIANA
INTRODUCCIN
En clnica la rpida y correcta identificacin del microorganismo o microorganismos causantes de una infeccin puede ser trascendental para la implantacin del tratamiento adecuado. De ah la importancia de las pruebas que se seleccionen para llegar a dicha identificacin. El mtodo ms extendido para llegar a la identificacin de microorganismos se basa en la realizacin de una batera de pruebas bioqumicas, a travs de las cuales se va a detectar el metabolismo del microorganismo, enzimas que posee, caractersticas de resistencia a determinadas sustancias, etc... La identificacin es tanto mejor cuanto mayor es el nmero de caracteres investigados. Para realizar correctamente las pruebas bioqumicas es fundamental tener colonias perfectamente aisladas, es decir, partir de cultivos puros. Por otro lado, se debe realizar un control peridico de medios y reactivos mediante el empleo de microorganismos positivos y negativos.
CLASIFICACIN DE LAS PRUEBAS BIOQUMICAS

Las pruebas bioqumicas de identificacin bacteriana las podemos clasificar atendiendo a varios criterios: PROCESOS RESPIRATORIOS QUE UTILIZAN LAS BACTERIAS PARA LA OBTENCIN DE ENERGA A) PRUEBA DE LA CATALASA * Fundamento : se investiga la presencia en el microorganismo de la enzima catalasa, capaz de descomponer el perxido de hidrgeno o agua oxigenada (H2O2) en H2O y O2, que se desprende en forma de burbujas en el medio. El H2O2 se forma como un producto terminal oxidativo de la descomposicin aerbica de los azcares; si se acumulara sera txica para la bacteria. * Reactivo: H2O2 de 10 volmenes (3%).
* Tcnica: Con un asa o hilo de inoculacin, recoger el centro de una colonia pura de 18-24 h. y colocarla sobre un portaobjetos limpio. A continuacin agregar una gota de agua oxigenada de 10 volmenes sobre el microorganismo del portaobjetos. No invertir el orden del mtodo pues pueden registrarse falsos positivos especialmente si se utilizan hilos o asas que contengan hierro. Si se estn utilizando asas o hilos de platino tambin se puede caer en este error ya que el platino puede producir un resultado falsamente positivo. El nicrom no ocasiona estos problemas. No es necesaria la mezcla del cultivo y el agua oxigenada con la aguja o el asa de inoculacin. Si el microorganismo es catalasa [+] se observar de inmediato la aparicin de burbujas (liberacin de gas). Tambin se puede realizar esta prueba agregando directamente el agua oxigenada a un cultivo puro de agar en pico de flauta o en placa (sobre colonias aisladas en este caso). * Precauciones: Se debe evitar la utilizacin de agar-sangre como medio de cultivo ya que los eritrocitos contienen la enzima catalasa y podemos obtener falsos positivos. El H2O2 al 30% (100 volmenes ) es una solucin bastante custica. No se deben usar cultivos excesivamente viejos, ya que con el tiempo pueden perder la actividad catalsica, pudindose obtener falsos resultados negativos. No utilizar asas o hilos de platino, ni que contengan vestigios de hierro.
* Inters: diferenciacin de los gneros: - Streptococcus [-], Micrococcus [+] y Staphylococcus [+] - Clostridium [-] y Bacillus [+]. B) PRUEBA DE LA OXIDASA * Fundamento: se investiga la presencia de la enzima citocromooxidasa en el microorganismo, la cual oxida al dimetil-parafenilen-diamina (reactivo incoloro) dando un producto de color. El sistema citocromooxidasa se encuentra, por lo general, en microorganismos aerobios.
* Reactivos: Dimetil-p-fenilendiamina o tetrametil-p-fenilendiamina impregnado sobre tiras o discos de papel de filtro. * Tcnica. Lectura e interpretacin de resultados: 1. Colocar una tira o disco impregnado de reactivo en un porta. 2. Tomar una colonia con el asa y depositarla sobre la tira o disco. 3. La aparicin de un color azul oscuro indica la existencia del enzima citocromooxidasa (prueba positiva). * Precauciones: o Proteger el reactivo de la luz ya que se altera con ella. o Guardar en fro. o Los medios que contienen colorantes pueden interferir la reaccin. o Algunas asas de cultivo metlicas pueden interferir la reaccin. Se ha comprobado que la presencia de un simple vestigio de hierro puede por s solo catalizar la oxidacin del reactivo, dando una falsa reaccin positiva. Por ello deben utilizarse asas desechables o bastoncillos. * Inters: ayuda a la identificacin de los gneros Pseudomonas (por lo general positivo) de las Enterobacterias [-], entre otros. C) PRUEBA DE XIDO-FERMENTACIN * Fundamento: mediante esta prueba se va a determinar si la utilizacin de los hidratos de carbono por parte de un microorganismo se realiza por va oxidativa (proceso aerbico, presencia de oxgeno) o por va fermentativa (proceso anaerbico, ausencia de oxgeno). * Medio de cultivo: Medio de Huhg y Leifson : es un medio semislido en tubo que lleva incorporado el azcar y azul de bromotimol como indicador. Se esteriliza a 112 30 minutos. La concentracin de agar empleado (3 g/l) permite tambin la observacin de la movilidad, adems de la capacidad oxidativa o fermentativa de un microorganismo. La glucosa es el hidrato de carbono ms comnmente empleado en el medio base de O/F. Sin embargo, un microorganismo puede no metabolizar la glucosa y s otros hidratos de carbono. Convendra emplear una batera en la que se incluyeran otros hidratos de carbono como lactosa, sacarosa,...
El azul de bromotimol es un indicador de pH, que a pH cido presenta color amarillo; a pH bsico, color azul y a pH neutro color verde. * Tcnica: se inocula por picadura y por duplicado, cubriendo uno de los tubos con parafina lquida para crear condiciones de anaerobiosis. La positividad se traduce por el viraje amarillo del indicador. Se incuban los tubos durante 3 o 4 das a 37 C, ya que algunos microorganismos producen reacciones lentas o dbiles. La observacin de los resultados ser diaria. * Lectura e interpretacin de resultados : mediante la utilizacin de este medio se pueden apreciar tres caracteres: o Movilidad: +, cuando el microorganismo no limita su crecimiento a la lnea de la siembra. o Produccin de gases: se detecta por la aparicin de burbujas en el medio. o Va oxidativa o fermentativa para la utilizacin del hidrato de carbono:
tubo abierto amarillo amarillo verde
tubo cerrado verde amarillo verde
va utilizada oxidativa fermentativa no utilizan el hidrato de carbono
* Inters: generalmente para diferenciar gneros intestinales no Enterobacterias Gram (-) de las Enterobacterias. Ej.: Enterobacterias fermentan la glucosa; Pseudomonas oxida la glucosa. Esta prueba ayuda tambin a la diferenciacin de los gneros de la familia Micrococcaceae (Micrococcus, por lo general oxida la glucosa; Staphylococcus la fermenta).
Otras pruebas incluidas en este apartado son: D) PRUEBA DE LA REDUCCIN DE NITRATOS (para diferenciar especies de Haemophilus, as como para identificar Enterobacterias, generalmente positivas.
E) TEST DE BRAUM O PRUEBA DEL CIANURO POTSICO (para diferenciacin de Enterobacterias). F) PRUEBA DE LOS CALDOS FECALES ( FK Y SF ), para diferenciar Streptococcus. PRUEBAS BASADAS EN EL METABOLISMO GLUCDICO La mayora de las bacterias son capaces de metabolizar la mayora de los hidratos de carbono, ya sea por va oxidativa o fermentativa. Incluiremos las siguientes pruebas: A) PRUEBA DE LA -GALACTOSIDASA (ONPG) * Fundamento: demostrar la presencia en el microorganismo de la enzima galactosidasa, utilizando el orto-nitro-fenil--D-galacto-piransido (ONPG). Si el microorganismo posee esta enzima, el ONPG que es incoloro, es hidrolizado, producindose orto-nitrofenol que presenta una coloracin amarilla cuando se encuentra en solucin neutra o alcalina; en condiciones cidas es incoloro. Los microorganismos fermentadores de la lactosa poseen dos enzimas: la enzima permeasa (que regula la entrada de la lactosa en la bacteria) y una enzima galactosidasa (que desdobla la lactosa en glucosa ms galactosa). Los microorganismos que fermentan la lactosa poseen las dos enzimas; los no fermentadores carecen de ambas enzimas. Hay microorganismos denominados "fermentadores tardos de la lactosa" que poseen la -galactosidasa pero no la permeasa. Cuando se utiliza una determinada concentracin de lactosa, estos microorganismos producen despus de cierto perodo de tiempo (48 horas a varios das o semanas) algunas clulas mutantes que poseen permeasa, observndose la fermentacin tarda de la lactosa, lo que indica que poseen la enzima galactosidasa. * Medio de cultivo: caldo ONPG: Este caldo se distribuye aspticamente en tubos estriles. El ONPG se puede encontrar comercialmente impregnado en discos.
* Tcnica: Mediante la utilizacin de discos de ONPG: o Realizar una suspensin bacteriana densa del microorganismo objeto de estudio en un tubo que contenga unos 0,5 ml de S.S.F. estril. o Colocar en el tubo un disco de ONPG. o Incubar a 37 C desde 1-24 horas, dependiendo del inculo. * Lectura e interpretacin de resultados: o prueba [+]: aparicin de un color amarillo estable por liberacin del o-nitrofenol. o prueba [-]: incoloro despus de 24 horas. A la hora de hacer la lectura hay que tener en cuenta el pH dada la influencia que tiene en la aparicin del color amarillo. En caso de un aparente resultado negativo se puede alcalinizar ligeramente el medio para comprobar que no se trata de un falso resultado negativo. * Inters: diferenciar los microorganismos fermentadores lentos de la lactosa de los lactosa -. Ej. E.coli +, Citrobacter +, Salmonella -, Proteus -, Shigella -. Algunas especies de Pseudomonas son ONPG [+] y otras [-]. B) PRUEBA DEL ROJO DE METILO * Fundamento : mediante esta prueba se va a comprobar la capacidad de un microorganismo de producir y mantener estables los productos terminales cidos de la fermentacin de la glucosa y vencer la capacidad amortiguadora del sistema. Es una prueba cualitativa para la produccin de cidos y requiere microorganismos que produzcan cidos fuertes (lctico, actico, frmico), a partir de la glucosa, por la va de fermentacin cido mixta. Todos los miembros de las Enterobacteriaceas son, por definicin, fermentadores de la glucosa. En el caldo RM/VP, despus de 18-24 horas de incubacin, la fermentacin resultante da productos secundarios metablicos cidos; por lo tanto inicialmente todas las enterobacterias darn una reaccin RM[+]. Sin embargo, despus de ms tiempo de incubacin, como lo exige la realizacin de la prueba (2-5 das), aquellos microorganismos que son realmente RM[+] continan produciendo ms cidos y dan como resultado un bajo pH terminal, venciendo al sistema amortiguador de fosfato y manteniendo un medio cido (pH 4,2 o menos).
Aquellos microorganismos que presenten la prueba RM [-] continan metabolizando los productos iniciales de la fermentacin, produciendo compuestos neutros, elevando el pH hacia la neutralidad (pH=6 o ms). * Medio de cultivo: Medio de Clark y Lubs (caldo RM/VP).Se reparte en tubos. * Reactivo: se utiliza solucin alcohlica al 0,2% de rojo de metilo. * Tcnica: sembrar con asa el medio lquido con el microorganismo objeto de estudio e incubar a 37 C de 2-5 das. * Lectura e interpretacin de resultados : despus de dos das de incubacin se aaden unas 5 gotas de reactivo al medio, observndose un viraje a rojo si es positivo y una coloracin amarilla si es negativa. Si aparece un color anaranjado indica una reaccin retardada. Tanto si la prueba es negativa como si aparece el color anaranjado se continuar la incubacin hasta 5 das y se repetir la prueba. Si contina color amarillo o anaranjado ser prueba negativa. Se ha desarrollado una microtcnica rpida (mtodo de Barry) que ha permitido disminuir el perodo de incubacin con relacin al mtodo comn (2-5 das). Se ha demostrado que utilizando menores volmenes de caldo para la prueba, los microorganismos en estudio sufran una mejor exposicin al oxgeno atmosfrico, que haca que los microorganismos RM [-] revirtieran al pH neutro inicial con mayor rapidez. * Inters: diferenciacin de Enterobacterias. C) PRUEBA DE VOGES-PROSKAUER * Fundamento : observar si el microorganismo fermenta la glucosa por la va butanodilica. Si es as, se forma un producto intermedio (acetona) que forma un complejo de color rojizo con el a-naftol. * Medio de cultivo: Medio de Clark y Lubs o lo que es lo mismo caldo RM/VP. * Reactivos: o a-naftol al 5% en alcohol absoluto. o KOH al 40%. * Tcnica: sembrar el medio (en tubos) e incubar de 24 a 48 horas a 37 C. * Lectura e interpretacin de resultados: segn el volumen de medio se aade un volumen determinado de la solucin de a-naftol y de la de potasa (0,6 ml y 0,2 ml respectivamente cuando el tubo contiene unos 2 ml de medio). Se agita para exponer el medio al oxgeno atmosfrico para que se de la reaccin:
o Coloracin rosa-rojiza en menos de una hora: VP [+] o Color amarillo en la superficie del medio: VP [-] * Inters: diferenciacin de Enterobacterias. D) PRUEBA CON AGAR HIERRO DE KLIGLER * Fundamento: mediante esta prueba vamos a poder determinar: a. La capacidad de un microorganismo de atacar un hidrato de carbono especfico (en este caso glucosa, lactosa o ambas) incorporado en un medio de crecimiento bsico. b. Produccin o no de gases: CO2 e H2 como productos finales del metabolismo de los hidratos de carbono. c. Produccin de cido sulfhdrico (SH2). El medio de Kligler contiene como hidratos de carbono la glucosa y la lactosa. Existe otro medio, el TSI, que posee un tercer hidrato de carbono, la sacarosa; los fundamentos bioqumicos de ambos son los mismos, por lo que nos vamos a referir solamente al medio de Kligler. * Medio de cultivo: Agar hierro de Kligler. S e esteriliza a 112 durante 30 min. y se deja enfriar en planos inclinados y profundos. La lactosa (incluida en el medio) est presente en una concentracin 10 veces superior a la glucosa. El sulfato de hierro se adiciona al medio para detectar la formacin de SH2 por la bacteria, originndose sulfuro ferroso que es de color negro. El indicador de pH rojo fenol (que lleva el medio) es amarillo a un pH cido, rojo a pH alcalino y anaranjado-rojizo a pH inicial del medio 7,4. * Tcnica: la inoculacin del medio se realiza en picadura hasta unos 0,6 cm. del fondo. Esta distancia se debe respetar a fin de evitar la entrada de aire en la parte profunda y una alteracin en el medio anaerobio. Se retira el hilo por el mismo camino de entrada y, sin volver a cargar el hilo, se siembra en estras la superficie del pico de flauta. Se incuban los tubos inoculados a 35-37 C durante 18-24 h. Es importante respetar estos tiempos de incubacin, ya que lecturas de menor o mayor incubacin pueden dar resultados falsamente positivos o negativos.
* Lectura e interpretacin de los resultados: a) Utilizacin de los hidratos de carbono: Fermentacin de la glucosa y no de la lactosa: pico alcalino (rojo) y fondo cido (amarillo), K/A. Ejemplo de no fermentadores de lactosa y s de glucosa: Shigella, Proteus, Salmonella. Fermentacin tanto de la glucosa como de la lactosa: Pico cido (amarillo), fondo cido (amarillo). A/A. Ejemplos de microorganismos fermentadores de lactosa y glucosa son Escherichia coli, Klebsiella y Enterobacter. No hay fermentacin ni de glucosa ni de lactosa: Pico alcalino (rojo) y fondo alcalino (rojo). K/K. En ausencia de fermentacin de hidratos de carbono no se forman cidos, y la utilizacin de las peptonas con la consiguiente produccin de grupos bsicos hace que todo el medio aparezca de color rojo. Las bacterias que producen este tipo de fermentacin son conocidas como "no fermentadoras" y es una importante indicacin de que el microorganismo no pertenece a las Enterobacterias. Ej.: Pseudomonas aeruginosa (bacilo no Enterobacteriaceae Gram (-)).
b) Produccin de gas: Los gases producidos son el CO2 y el H2 , productos finales del metabolismo de la glucosa. Se pueden apreciar por la aparicin de burbujas en la parte inferior del medio, por la produccin de grietas en su interior o incluso por la elevacin del medio, que se separa del fondo. c) Produccin de cido sulfhdrico (SH2): El sulfhdrico es incoloro y su presencia se detecta a travs de la formacin de sulfuro ferroso, que es negro. Debido a que se requiere un medio cido para que un microorganismo produzca sulfhdrico, un fondo negro debe leerse como cido an cuando el color amarillo est oscurecido por el precipitado negro. Cuando se interpreta un resultado en el medio de Kligler puede observarse la combinacin de cualquiera de las reacciones caractersticas, debiendo anotarse de la siguiente manera: a) Fermentacin de hidratos de carbono: como ya se ha indicado. b) Produccin de gases: se registra con un crculo alrededor del smbolo que indica la acidez o basicidad en la parte inferior del tubo.
c) Produccin de SH2: se indica con una "S" junto al smbolo que indica la acidez o alcalinidad de la parte inferior del tubo. * Inters: Se utiliza primariamente para identificar gneros de Enterobacterias. Reacciones de las Enterobacterias ms frecuentes aisladas en clnica en agar hierro Kligler
Alc/A gas + + + + + -
Alc/A no gas + + + + + -
A/A gas + + + + + -
Alc/A SH2 + + +
A/A SH2 + + E. Coli
Especies
Morganella sp. Providencia sp. Serratia sp. Enterobacter sp. Citrobacter sp. Salmonella sp. Shigella sp. Yersinia sp. Klebsiella sp. Proteus sp.
alc= alcalino o rojo. a= cido o amarillo. Otras pruebas incluidas en este apartado son: E) PRUEBA DE LA FERMENTACIN DE AZCARES (para diferenciacin de Enterobacterias; todas las Enterobacterias fermentan la glucosa. Algunas adems fermenta la lactosa.) F) PRUEBA DE LA HIDRLISIS DE LA ESCULINA (para diferenciar los Estreptococos del grupo D, que tienen esta propiedad, de otros Estreptococos, que no pertenecen a dicho grupo. PRUEBAS BASADAS EN EL METABOLISMO PROTICO Se investiga la presencia en los microorganismos de enzimas con actividad proteoltica. Incluiremos las siguientes pruebas:
A) PRUEBA DE LA COAGULASA * Fundamento: se pretende comprobar la facultad de un microorganismo de coagular el plasma por accin de la enzima coagulasa. La coagulasa se puede encontrar en dos formas: libre y fija o ligada (unida a la pared bacteriana). La coagulasa es una enzima con actividad semejante a la protrombina, capaz de transformar el fibringeno en fibrina, provocando la formacin de un cogulo visible. * Medios y reactivos: No se debe emplear sangre citratada pues los microorganismos que utilizan citrato, como por ej. Streptococcus faecalis, pueden dar una falsa reaccin positiva. * Tcnica: Se pueden seguir dos tipos de tcnicas: 1.- Prueba del portaobjetos: pone de manifiesto la coagulasa ligada: o Colocar una gota de agua destilada o solucin salina fisiolgica estril sobre un portaobjetos. o Emulsionar suavemente una gota de suspensin del microorganismo en estudio de 24 horas en un caldo enriquecido (Ej.: BHI) en la gota de agua, utilizando un asa o una varilla. La prueba puede hacerse tambin partiendo directamente de una colonia obtenida en una placa de aislamiento. o Aadir una gota del plasma y mezclar bien. o Inclinar el portaobjetos hacia uno y otro lado. 2.- Prueba en tubo de hemlisis: pone de manifiesto la coagulasa ligada y la libre: o Aadir aspticamente 0,5 ml de plasma a 0,5 ml de un cultivo puro de 18 a 24 h. en un caldo enriquecido. o Mezclar por rotacin suave del tubo, evitando agitar el contenido. o Incubar a 37 C, preferiblemente en un bao de agua, observando peridicamente el tubo.
* Lectura e interpretacin de resultados: 1.- Prueba en portaobjetos: una reaccin positiva se detecta en 15 a 20 segundos por la formacin de grumos blancos. La prueba se considera negativa si no se observa aglutinacin en 2 a 3 minutos. Todos los resultados negativos deben verificarse mediante la prueba en tubos debido a que algunas cepas de Staphylococcus aureus producen coagulasa libre que no reacciona en la prueba en portaobjetos. 2.- Prueba en tubo: o La reaccin se considera positiva ante cualquier grado de coagulacin visible dentro del tubo. La reaccin se observa mejor inclinando el tubo. Si es positiva, el cogulo permanece en el fondo del tubo. o Reaccin negativa: ausencia de cogulo tras 24-48 horas de incubacin. * Inters: se utiliza de manera especfica para diferenciar Staphylococcus aureus (coagulasa positivo) de otras especies de Staphylococcus. B) PRODUCCIN DE HEMLISIS * Fundamento: los microorganismos, cuando se cultivan "in vitro" sobre medios que contienen sangre, pueden producir alrededor de las colonias unas zonas de hemlisis variables, segn se origine una destruccin parcial o total de los eritrocitos. Las sustancias responsables de estos fenmenos son exotoxinas, liberadas por las bacterias al medio, llamadas hemolisinas. * Medio de cultivo: Agar-sangre, constituido por un medio bsico (Ej.: agar nutritivo o TSA) adicionado de un 5% de sangre desfibrinada de carnero o de caballo, preferentemente la del primero, ya que las hemlisis se visualizan mejor. * Tcnica: inocular siguiendo la tcnica de aislamiento. Incubar durante 24-48 horas a 37 C. * Lectura e interpretacin de resultados: podemos hablar de a, , o ? hemlisis. La a-hemlisis es una hemlisis parcial, en la que los hemates son parcialmente daados. Se observa por una estrecha zona verde alrededor de la colonia. La -hemlisis se caracteriza por una zona clara e incolora que rodea a la colonia, debido a la destruccin total de los glbulos rojos. Es una hemlisis total.
En la ?-hemlisis no se observa ninguna variacin alrededor de las colonias ni actuacin sobre los glbulos rojos. * Inters: esta prueba se emplea fundamentalmente para determinar las diferentes especies de Streptococcus: por ej. S. pyogenes es -hemoltico; S. pneumoniae es a-hemoltico. C. PRUEBA DEL INDOL * Fundamento : se investiga la presencia en el microorganismo de la enzima triptofanasa o triptofanodesaminasa, capaz de desdoblar el triptfano (aminocido) en indol ms alanina. Se detecta la presencia de esta enzima mediante la reaccin del indol producido con el reactivo p-dimetilaminobenzaldehido. * Medio de cultivo: Agua de peptona:
* Reactivo: Reactivo de Kovacs: - Alcohol amlico o isoamlico o butlico... - p-dimetilaminobenzaldehido............... - HCl concentrado............................. * Tcnica : sembrar con asa de platino el medio con el microorganismo objeto de estudio (tubos de hemlisis). Incubar a 37 C durante 24-48 horas. * Lectura e interpretacin de resultados: se agregan unas gotas del reactivo de Kovacs directamente sobre el tubo incubado y se agita. En caso de que la prueba sea positiva, es decir, en caso de que se haya producido indol, ste reaccionar con el p-dimetilaminobenzaldehido, apareciendo un anillo de color rojo en la superficie del tubo. El HCl tiene como funcin bajar algo el pH, favorecindose as la reaccin, y el alcoho l amlico concentra el color en la superficie. Puede tambin utilizarse el reactivo de Erlich para realizar la lectura. C) PRUEBA DE LA FENILALANINA-DESAMINASA * Fundamento: comprobar si el microorganismo posee esta enzima. Si la poseen, estos grmenes transforman la fenilalanina en cido fenilpirvico, el cual forma un complejo de color verde al reaccionar con el tricloruro de hierro. 75 ml 5 mg 25 ml
* Medio de cultivo: medio de fenilalanina. El medio se reparte en tubos, se esteriliza y se deja solidificar en pico de flauta. * Reactivo: Tricloruro de hierro (CL3Fe) al 10% en agua destilada. * Tcnica: sembrar en tubos inclinados e incubar a 37C durante 24-48 h. * Lectura e interpretacin de resultados: aadir 4 o 5 gotas del reactivo sobre la superficie del medio una vez incubado. Hacer rotar suavemente el tubo. En el trmino de 1 a 5 minutos, si la reaccin es positiva aparece un color verde en el pico de flauta as como en el lquido en contacto con l. * Precauciones: la interpretacin de positiva o negativa debe hacerse dentro de los primeros 5 minutos despus de haber aadido el reactivo porque el color verde se desvanece con bastante rapidez. * Inters: para diferenciar los gneros Proteus y Providencia [+] del resto de los gneros de las Enterobacterias [-]. E) PRUEBA DE LA UREASA * Fundamento : mediante esta prueba determinamos la capacidad del microorganismo de desdoblar la urea en CO2 y amonaco por accin de la enzima ureasa. Se visualiza el proceso debido a que la alcalinidad que se produce ori gina un cambio de color en el indicador que lleva incorporado el medio. Esta prueba se puede realizar en tubo con medio slido o sobre discos de papel de filtro. 1.- Prueba en tubo * Medio de cultivo: Medio de Christensen: El medio se esteriliza en el autoclave. Se deja enfriar hasta 50-55C y a esta temperatura se le aaden 100 ml de solucin de urea al 20% en agua destilada, esterilizada por filtracin. Se distribuye el medio aspticamente en tubos estriles y se deja enfriar en posicin inclinada. * Tcnica: sembrar el pico de flauta con un inculo denso e incubar a 35-37C durante 1-6 das, observando las primeras 6 horas y luego cada 24 horas. * Lectura e interpretacin de resultados: Se considera la prueba [+], es decir, el microorganismo ser ureasa [+] si debido a la alcalinizacin del medio, ste toma una coloracin roja-roscea.
* Inters: todas las especies del gnero Proteus dan positiva esta reaccin dentro de las 6 primeras horas, virando la superficie del medio a color rojo-rosceo. Se puede as diferenciar el gnero Proteus de otros microorganismos ureasa [+] retardados como especies de Klebsiella o Enterobacter, as como de microorganismos ureasa [-] como E.coli. 2.- Prueba en discos de papel de filtro * Tcnica: con una solucin de urea se impregna un disco de papel de filtro colocado en una placa de Petri; se toma una colonia del microorganismo a estudiar y se frota sobre el disco hmedo. * Lectura e interpretacin de resultados: Si el disco vira a rosado o rojo en los dos minutos siguientes indica positividad de la prueba. * Inters: todas las especies del gnero Proteus dan positiva esta prueba. F) PRUEBA DE LA DNasa * Fundamento: se basa en la capacidad que poseen ciertas bacterias para hidrolizar enzimticamente el ADN produciendo una mezcla de mono y polinucletidos. * Medio de cultivo: se utiliza el agar-DNA: Preparar el medio, esterilizar en autoclave y distribuir en placas. * Reactivo: cido clorhdrico 1N. * Tcnica: sembrar una colonia del microorganismo a investigar sobre una placa de agar DNA de forma que despus de la investigacin quede una estra superficial o un botn de crecimiento denso. Incubar 24 horas a 37 C. * Lectura e interpretacin de resultados: cubrir la placa con ClH 1N. En caso de que el microorganismo sea productor de DNasa, se observa una zona clara alrededor del crecimiento; en caso negativo, el medio permanece opaco. * Inters: diferenciar S. aureus (DNasa +) de otras especies de Staphylococcus. Otras pruebas incluidas en este apartado: G) PRUEBA DE LA HIDRLISIS DE LA GELATINA (diferencia especies de Staphylococcus, dando positivo S. aureus. H) INVESTIGACIN DE DESCARBOXILASAS (para determinar grupos bacterianos entre las Enterobacterias.)
PRUEBAS BASADAS EN EL METABOLISMO LIPDICO A) PRUEBA DE LA LIPASA Se lleva a cabo por cultivo sobre agar enriquecido con tween 80.La existencia de lipasa se traduce por la aparicin de un halo opaco alrededor de las colonias. Esta prueba se utiliza para diferenciar ciertas Micobacterias. B) PRUEBA DE LA LECITINASA Se realiza por cultivo sobre un medio con yema de huevo (lecitina). Las colonias productoras de lecitinasa, forman una zona opaca a su alrededor. PRUEBAS BASADAS EN CARACTERES DE RESISTENCIA A CIERTAS SUSTANCIAS A) TEST DE LA OPTOQUINA * Fundamento: se determina la sensibilidad de un microorganismo a la optoquina. * Medio de cultivo: agar sangre * Reactivo: discos impregnados de optoquina. * Tcnica: sembrar masivamente una colonia del microorganismo a investigar sobre una placa de agar sangre y colocar en la superficie de la placa los discos de optoquina. Incubar a 37 durante 24 horas. * Lectura e interpretacin de los resultados: en caso de que el microorganismo sea sensible a la optoquina, se observa un halo de inhibicin alrededor del disco. * Inters: diferenciar Streptococcus pneumoniae (sensible) de otras especies de Streptococcus alfahemolticos (resistentes). B) TEST DE LA BACITRACINA * Fundamento: se determina la sensibilidad de un microorganismo a la bacitracina. * Medio de cultivo: placas con agar sangre. * Reactivo: discos impregnados con bacitracina.
* Tcnica: sembrar masivamente una colonia del microorganismo a investigar en una placa de agar sangre y colocar sobre la placa los discos de bacitracina. Incubar a 37 durante 24 horas. * Lectura e interpretacin de los resultados: una zona de inhibicin del crecimiento alrededor del disco, aunque sea pequea, indicar la sensibilidad. * Inters: diferenciar Streptococcus pyogenes (grupo A de Lancefield), sensible a la bacitracina, de otras especies de Streptococcus betahemolticos (grupos B, C, D, F, G) que son resistentes. Tambin podemos incluir en este apartado la prueba de SOLUBILIDAD EN BILIS (para diferenciar Streptococcus Pneumoniae, que tiene esta propiedad, de otras especies de Streptococcus alfahemolticos. INVESTIGACIN DE SUSTANCIAS ENERGTICAS NUTRITIVAS A) PRUEBA DE LA UTILIZACIN DE CITRATOS * Fundamento : mediante esta prueba se determina si el microorganismo es capaz de utilizar el citrato como nica fuente de carbono. El medio incluye citrato de sodio como nica fuente de carbono y fosfato de amonio como nica fuente de nitrgeno. Las bacterias que pueden utilizar citrato como nica fuente de carbono tambin pueden extraer nitrgeno de la sal de amonio, con produccin de amonaco, llevando a la alcalinizacin del medio. El medio lleva un indicador, el azul de bromotimol, que es amarillo a pH cido, verde a pH neutro y azul a pH alcalino.
* Medio de cultivo: Medio de citrato de Simmons. El medio se reparte en tubos de ensayo y una vez estriles se inclinan en pico de flauta. * Tcnica: sembrar en pico de flauta el microorganismo obtenido en medio slido (los caldos pueden aportar elementos nutritivos que pueden falsear los resultados), procurando no tocar con el asa el medio, porque sustancias nutritivas de ste podran igualmente falsear los resultados. Incubar a 37 C de 24-48 horas. * Lectura e interpretacin de resultados: o Prueba positiva: crecimiento con un color azul intenso en el pico de flauta tras 24-48 horas de incubacin.
o Prueba negativa: no se observa crecimiento ni cambio de color (el medio permanece de color verde.) o Si se observa crecimiento sin cambio de color, se confirmar la positividad de la prueba incubando el tubo 24 horas ms, durante las que suele aparecer el color azul. * Inters: esta prueba junto con las de Indol, Rojo de Metilo y Voges Proskauer constituyen el IMViC y sirven, junto con otras pruebas para la diferenciacin de los gneros de las Enterobacteriaceas. La prueba del TUBO DE GERMINACION o TEST DE FILAMENTACION , aunque estrictamente hablando no se trata de una prueba bioqumica, ha de ser nombrada dado el gran valor que posee para la identificacin rpida y presuntiva de Candida Albicans y Candida stellatoidea, que son las dos nicas especies del gnero Candida capaces de producir tubos germinales. Para diferenciar anaerobios, si no se utiliza el mtodo de cromatografa gaslquido o IFI, se debe introducir una batera bioqumica que investigue: indol, urea, gelatina, catalasa, fermentacin de hidratos de carbono, hidrlisis de almidn y esculina, comportamiento en medio de infusin cerebro-corazn con hemina, menadiona y sangre de cordero adicionada de diversas sustancias (como sales biliares, verde brillante o antibiticos), reduccin de nitratos, lipasa y lecitinasa. SISTEMAS MULTIPRUEBAS En los ltimos aos han aparecido en el mercado numerosos sistemas o equipos multipruebas con el fin de facilitar la identificacin de algunas bacterias, sobre todo Enterobacterias, cocos G (+), microorganismos anaerobios y levaduras. Estos sistemas proporcionan mayor comodidad y rapidez, pueden ser ms baratos, pero no carecen de problemas si se manejan de forma incorrecta. Todos exigen unas condiciones muy precisas de concentracin del inculo, de inoculacin, de incubacin y de lectura, que si no se observan pueden dar lugar a importantes errores. Estos sistemas pueden ser manuales y automatizados. SISTEMAS COMERCIALES MANUALES: A) SISTEMA API Se trata de una tarjeta de material plstico dividida en pequeos pocillos que contienen diferentes substratos deshidratados, en los cuales se inocula una suspensin del microorganismo a estudiar. La lectura de los resultados se efecta directamente, interpretando el color de cada reaccin, o tras la adicin de reactivos reveladores. Con los resultados se establece un cdigo numrico que corresponde a una determinada especie reflejada en unas tablas.
Existe disponible para la identificacin de Enterobacterias, Estafilococos, Estreptococos, anaerobios, levaduras y algunas bacterias exigentes. Los resultados presentan una correlacin con las pruebas clsicas superior al 90%.Su principal inconveniente radica en la incapacidad de detectar reacciones dbiles. B) SISTEMA ENTEROTUBE Consiste en un tubo de plstico dividido en compartimentos que contienen sustratos en forma de agar. La inoculacin se realiza directamente a partir de la colonia, por picadura y arrastre a travs de los diferentes sustratos. La lectura e interpretacin no difieren del sistema anterior. Existe comercializado para Enterobacterias y bacterias no fermentadoras. Los problemas de este sistema son ms considerables en cuanto al inculo, que no siempre es uniforme, y a la conservacin de los sustratos. C) OTROS SISTEMAS a) MICRO-ID: consta de 15 cmaras de reaccin en las que hay discos de papel impregnados de sustratos y reactivos correspondientes a cada prueba bioqumica a ensayar. b) MINITEK: es un sistema semejante al anterior. Actualmente hay ms de 30 discos de sustratos diferentes.
SISTEMAS COMERCIALES AUTOMATIZADOS: Estos suponen un importante progreso tcnico, pero no estn libres de problemas. Adems no es aconsejable que estos sistemas utilizados por alguien que no est preparado y que confa ciegamente en el sistema sin adoptar una actitud crtica respecto a los resultados ofrecidos por ste. Suelen consistir en paneles en los que adems de encontrarse los sustratos para el desarrollo de diversas pruebas bioqumicas, se encuentran diversos antimicrobianos a distintas concentraciones, con lo que se realiza simultneamente la identificacin y antibiograma del microorganismo objeto de estudio. Existen distintos paneles para distintos grupos de microorganismos. La inoculacin y la lectura de estos paneles se suele hacer de forma automtica, incorporndose los datos obtenidos en un ordenador, el cual proporciona con un ndice alto de fiabilidad la identificacin del microorganismo. Es obvio que ningn sistema automatizado puede ser mejor que el mtodo de referencia, pues ante cualquier discrepancia este ltimo se supone correcto.
TCNICAS DE HIBRIDACIN DE CIDOS NUCLICOS Una reaccin de hibridacin es el proceso por el que dos monocadenas de ADN, ARN o una de ADN y otra de ARN, de distinto origen y que muestran complementariedad de bases se unen formando una molcula estable, que recibe la denominacin de hbrido. La tcnica de hibridacin se basa en el apareamiento del cido nucleico a estudiar con una molcula de ADN o ARN conocida y llamada sonda. Esta reaccin puede ponerse de manifiesto gracias a la incorporacin de un sistema indicador bien radioactivo o no radioactivo (colorimtrico o fluorimtrico). En la reaccin de hibridacin, la unin sonda-diana se produce gracias a la formacin de puentes de hidrgeno entre bases complementarias (adenina-timina, guanina-citosina.) Hoy da estas tcnicas se estn introduciendo poco a poco en la rutina de los grandes Laboratorios de Microbiologa, utilizndose con relativa frecuencia para la deteccin de patgenos humanos. En estos casos, las muestras se procesan para la inmovilizacin del cido nucleico sobre un soporte slido y posteriormente se realiza la hibridacin con sondas especficas para el microorganismo causal de la infeccin. Adems, la posibilidad de poder construir sondas frente a cualquier regin del genoma de los microorganismos permite el diagnstico diferencial de subtipos. Otra gran aplicacin de la hibridacin es que mediante ella se pueden detectar genes de resistencia a antibiticos directamente en el producto patolgico, ofreciendo una alternativa al antibiograma. Para incrementar an ms la sensibilidad ha aparecido en la actualidad un mtodo que permite incrementar especficamente una secuencia determinada de cidos nucleicos hasta un nmero de copias que pueda ser detectado mediante la hibridacin; es el mtodo de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). Este mtodo permite la deteccin de aquellos microorganismos que se encuentran en pequeo nmero en la muestra y, aunque por el momento est limitado a laboratorios de investigacin debido a su complejidad y alto coste econmico, parece que en un futuro aparecern equipos comerciales que contribuirn a su difusin.
TEMA 16. ANTIBIOGRAMAS. TIPOS.
INTRODUCCIN.
Una vez aislado e identificado un microorganismo como probable agente causal de un proceso infeccioso, se ha de estudiar que susceptibilidad presenta a los agentes antimicrobianos. Se entiende por antibiograma la "tcnica que permite el estudio "in vitro" de la sensibilidad de los microorganismos a los agentes antimicrobianos (antibiticos y quimioterpicos). Tiene por objeto proporcionar datos tiles para el tratamiento de una enfermedad infecciosa, aportando una informacin valiossima para el establecimiento de la teraputica antiinfecciosa, aunque para el mayor rendimiento de sta se deben considerar tambin las caractersticas del antimicrobiano, la clnica del proceso y al propio paciente que lo padece. Independientemente del tipo de antibiograma que se realice, es fundamental partir de cultivos puros para obtener resultados fiables. En general, se debe realizar siempre un aislamiento y trabajar con colonias de un solo tipo de microorganismo. Las tcnicas realizadas a partir de cultivos mixtos casi nunca tienen valor y pueden conducir a errores teraputicos graves.
TIPOS DE ANTIBIOGRAMA.
Existen diversos mtodos siendo los ms importantes los de: Difusin: se realizan en medio slido; habitualmente son cualitativos, clasificando a los microorganismos en sensibles, intermedios o resistentes a un determinado antimicrobiano. Dilucin: son los mtodos de referencia. Se pueden realizar en medio lquido o en medio slido. Proporcionan resultados cuantitativos, destacando la Concentracin Mnima Inhibitoria (CMI), que es la concentracin ms baja de antimicrobiano que inhibe el crecimiento del microorganismo.
Existen algunas tcnicas rpidas para acortar los estudios de eficacia de antimicrobianos, pero si es posible deben evitarse. En caso de infecciones muy peligrosas o si, por examen microscpico del producto patolgico, se sospecha una infeccin monomicrobiana, puede ser conveniente intentar determinar la susceptibilidad relativa del microorganismo directamente en la muestra; pero, realmente, no hay ningn mtodo adecuado que pueda obviar el cultivo de la muestra, la identificacin del posible agente etiolgico y la realizacin de pruebas convencionales de susceptibilidad, aunque se retrase el resultado ms tiempo. Hay dos puntos clave a tener en cuenta a la hora de realizar las pruebas de sensibilidad antimicrobiana. En primer lugar, es muy importante que se realicen de modo estandarizado ya que los resultados pueden variar mucho en funcin de las condiciones de trabajo (inculo, medio de cultivo, concentracin, pH); por
este motivo se deben aplicar las normas publicadas en relacin a este tipo de pruebas. Sin embargo, hay que sealar que estas normas solo se aplican a las bacterias aerobias y anaerobias, no habindose estandarizado mtodos de prueba para hongos, parsitos y virus, y no puede asegurarse la reproductibilidad de los resultados del mismo laboratorio o la comparabilidad con los de laboratorios diferentes. En segundo lugar, los resultados de las pruebas para las bacterias se obtienen en el ambiente del laboratorio, que es muy diferente al medio interno del husped.
ANTIBIOGRAMA AEROBIO.
MEDIO DE CULTIVO. Debe cumplir las siguientes condiciones: Ser de amplio espectro nutritivo, para que permita el crecimiento de la mayora de los microorganismos. En algunas ocasiones ser necesario aadir sangre desfibrinada o achocolatada para microorganismos muy exigentes, pero normalmente no es aconsejable, ya que las protenas que llevan incorporadas ligan a los antimicrobianos, disminuyendo su accin. Ser de pH estable (7,2-7,4): la acidez y la alcalinidad modifican la actividad de determinados antimicrobianos. No debe contener inhibidores de antimicrobianos: Ej.:
o Las sales de Ca y Mg que forman complejos con tetraciclinas y betalactmicos. o Los glcidos, que en medios mal tamponados podran dar lugar a disminucin del pH. o La sangre, ya comentada. o Las peptonas, que inactivan a derivados sulfamdicos. El medio de cultivo que mejor rene las anteriores condiciones y que es apto para cualquier tipo de antibiograma aerobio es el de Meller-Hinton, que se utiliza tanto en caldo como en forma slida. Previamente, antes de sembrar en el medio, hay que hacer la preparacin de inculo.
PREPARACIN DEL INCULO. Se prepara sembrando 4-5 colonias iguales en 5 ml de solucin salina fisiolgica estril o en caldo nutritivo o en TSB, e incubando de 2-6 horas a 35-37C, hasta que el crecimiento produzca una turbidez semejante a la del estandar nmero 0,5 de la escala de MacFarland, el cual se prepara adicionando 0,05 ml de Cl2Ba 0,048M (1% P/V; 1,175% P/V de Cl2Ba.2H2O) a 9,95 ml de H2SO4 0,36N (1% V/V). Si la turbidez fuera mayor que la del estndar, se diluye con solucin salina fisiolgica estril o con el caldo y si fuera menor se deja ms tiempo incubando. Cuando se consigue esta turbidez, equivale a una concentracin de microorganismos de aproximadamente 1,5 x 108 microorganismos/ml. Si las circunstancias lo precisan tambin se puede obtener el inculo deseado suspendiendo directamente en 5 ml de solucin salina fisiolgica estril algunas colonias procedentes de un cultivo joven, homogeneizando bien y ajustando despus la turbidez. ANTIMICROBIANOS A ELEGIR. Se utilizan productos de calidad con una actividad perfectamente conocida (en microgramos o UI/ml). Los antimicrobianos utilizados en cada prueba de sensibilidad se seleccionan segn el tipo de microorganismo aislado o que se sospeche y el inters teraputico; se recomienda elegir un solo representante de los antibiticos con estructura qumica similar y resistencia cruzada. A continuacin se expone una relacin donde se indican los antimicrobianos a elegir segn el tipo de microorganismo, incluyendo los indicados para microorganismos anaerobios. Cada laboratorio seleccionar dentro de esos grupos los que considere ms apropiados. Antibiograma de Staphylococcus. Amicacina Ampicilina o Amoxicilina Ampicilina-sulbactam o Amoxicilina-clavulnico Cefalosporina de primera generacin (Cefalotina) Cefalosporina de tercera generacin (Cefotaxima) Clindamicina Cloxacilina (en Meller-Hinton salino) Cotrimoxazol (Sulfametoxazol-trimetoprim) Eritromicina Fosfomicina Nitrofurantona (en infecciones urinarias) Norfloxacina o Ciprofloxacina (en infecciones urinarias) Tetraciclina Tobramicina
Vancomicina o Teicoplanina Antibiograma de Enterobacterias Amicacina Ampicilina o Amoxicilina Ampicilina-sulbactam o Amoxicilina-clavulnico Cefotaxima Cefoxitina Ceftazidima Cefuroxima Ciprofloxazina Cloranfenicol (para Salmonella) Colistina (con fines taxonmicos) Cotrimoxazol Fosfomicina Imipenem Nitrofurantona (en infecciones urinarias) Norfloxacina (en infecciones urinarias) Piperacilina Tobramicina Ticarcilina Antibiograma de Pseudomonas y afines. Amicacina Azlocilina Aztreonam Cefotaxima Ceftazidima Ceftriaxona Ciprofloxacina Colistina Fosfomicina Imipenem Gentamicina Ofloxacina Norfloxacina (en infecciones urinarias) Piperacidina Ticarcilina Tobramicina
Antibiograma de Streptococcus y otros microorganismos delicados. Ampicilina Cefalotina Cefotaxima o Ceftriaxona Ciprofloxacina Cloranfenicol Cotrimoxazol Eritromicina Fosfomicina Imipenem Tetraciclina Vancomicina
Antibiograma de anaerobios Cefoxitina o Cefmetazol Clindamicina Cloranfenicol Eritromicina Imipenem Metronidazol Penicilina
INCUBACIN: Para todos los antibiogramas aerobios, 35-37 C durante 18-24 horas. La lectura e interpretacin de resultados se vern en cada tipo de antibiograma. CONTROL DE CALIDAD. Debido al gran nmero de variables que pueden afectar los resultados, es muy importante realizar un riguroso control de calidad peridicamente con cepas patrn de sensibilidad conocida. ANTIBIOGRAMA POR DIFUSIN EN MEDIO SLIDO (MTODO DE BAUERKIRBY). Se trata de un mtodo de fcil ejecucin, exacta reproduccin, facilidad de lectura y fiabilidad de resultados. Por todo ello es el que se realiza rutinariamente en la mayor parte de los pequeos laboratorios, recurrindose tambin a l, en los grandes laboratorios, cuando los resultados obtenidos por el mtodo de dilucin en microplacas no son de total fiabilidad. Para ello se requiere que todos los detalles del procedimiento estn cuidadosamente controlados y sean uniformes. Existen distintas tcnicas que aplican el mtodo de difusin en medio slido, siendo una de las ms utilizadas la de Bauer-Kirby.
Este mtodo consiste en inocular una placa de agar Meller-Hinton con el microorganismo problema y colocar sobre la superficie del medio unos discos que contengan concentraciones determinadas de los antimicrobianos a ensayar. El antimicrobiano difunde por el medio, produciendo un gradiente de concentracin. Esta difusin se puede pensar como una serie de anillos concntricos, donde la concentracin del antimicrobiano disminuye a medida que aumenta la distancia al centro del disco. Despus de la incubacin, el microorganismo se desarrolla en toda la placa excepto alrededor de los discos cuyas concentraciones son inhibitorias. La distancia en la que se inhibe el crecimiento del microorganismo inoculado en el medio se denomina halo de inhibicin, se mide en milmetros y es inversamente proporcional a la CMI. MEDIO DE CULTIVO. Se emplea el agar Meller-Hinton, repartido en placas de modo que el medio alcance en la placa un espesor uniforme de 4 mm; si es ms fino, los antimicrobianos tienden a difundir ms en direccin lateral, aumentando el tamao de las zonas de inhibicin; si el agar es de ms de 4 mm. de espesor, se produce una mayor difusin hacia abajo, con tendencia a estrechar artificialmente las zonas de inhibicin. Antes de utilizar las placas se debe comprobar que no posean agua de condensacin y se deben dejar a temperatura ambiente hasta que alcancen la del laboratorio. INCULO. La densidad del inculo es uno de los factores que ms influye en el dimetro del halo de inhibicin, existiendo una relacin inversa entre la concentracin del inculo bacteriano y dicho halo. Por esto se debe estandarizar su preparacin, lo cual se consigue ajustando la turbidez al 0,5 de la escala de MacFarland, tal y como ya se ha descrito. SIEMBRA. La inoculacin se debe hacer dentro de los primeros 15 minutos despus de preparado el inculo. Existen varios mtodos de inoculacin; el de Bauer-Kirby consiste en introducir un escobilln en el inculo ajustado, eliminar el exceso presionando suavemente sobre las paredes del tubo y sembrar la placa por estriacin masiva en superficie, lo ms homognea posible. Antes de colocar los discos se deja secar la superficie. No debe transcurrir ms de 10 minutos entre la siembra y la colocacin de los discos.
COLOCACIN DE LOS DISCOS. Los discos utilizados son de papel de filtro estriles de 6 mm de dimetro y contienen diferentes antimicrobianos desecados a la concentracin convenientemente expresada (expresada en g/ml o en UI, atendiendo a las normas de la OMS). Se suelen comercializar en tubos de 50 unidades, algunos de los cuales llevan un dispositivo que ayuda a la dispensacin de los discos. De todas formas, suele ser ms cmodo y seguro colocar los discos sobre la placa con pinzas estriles y fras (se mantienen en alcohol y se flamean y enfran antes de su uso), presionando un poco sin tocar con las pinzas el medio de cultivo. Antes de su uso se sacan del frigorfico y se dejan a temperatura ambiente unos 30 minutos. Una vez colocados en la placa, los discos deben quedar a unos 15 mm de distancia entre si y del borde de la placa para que no se interfieran los halos de inhibicin. En las placas de 9 centmetros de dimetro se colocaran 6-8 discos y en las placas de 14 cm 12 discos; para microorganismos que suelan dar halos de inhibicin muy grandes, como Haemophilus sp., se deben colocar menos discos por placa. Se debe evitar que los discos rueden por el medio al colocarlos, ya que el antimicrobiano difundira incontroladamente. Existen dispensadores automticos de discos, que llevan acoplado un tipo especial de cartucho y que permiten la dispensacin de tantos discos a la vez como cartuchos sea capaz de albergar. Antes de incubar las placas se deben dejar reposar a temperatura ambiente unos 10 minutos para que los antimicrobianos hagan una predifusin. A continuacin se incuban a 35-37C durante 18-24 horas. LECTURA E INTERPRETACIN DE RESULTADOS. Despus del perodo de incubacin aparecen los halos de inhibicin alrededor de los discos que contienen antimicrobianos a los cuales es sensible el microorganismo en estudio. Utilizando una regla, se medir el dimetro del halo de inhibicin en mm. Con la medida obtenida nos vamos a unas tablas que nos van a indicar si el microorganismo es "sensible", "moderadamente sensible" o "resistente". Para la interpretacin de los resultados ha de tenerse en cuenta la concentracin del disco, el microorganismo en cuestin y el medio de cultivo empleado, entre otros factores. La categora "sensible" indica que la cepa estudiada es afectada por concentraciones normales de antimicrobianos, alcanzadas en el organismo administrando dosis habituales.
La categora de "sensibilidad intermedia" indica que para actuar sobre el microorganismo se debe forzar la dosis, lo cual no siempre es posible, debido a los efectos txicos. La categora de "resistente" indica que la concentracin mxima de antimicrobiano que se puede conseguir en el lugar de la infeccin no es suficiente para afectarle. La tendencia actual es a hacer una interpretacin binaria, clasificando los microorganismos en sensibles o resistentes, segn el dimetro de la zona de inhibicin sea mayor o menor que el establecido. Las respuestas intermedias quedan incluidas dentro de las resistentes para no inducir a errores teraputicos. A la hora de realizar la lectura hay que tener una serie de precauciones en casos concretos: Con algunos antibiticos, como las sulfamidas, aparecen bordes borrosos del halo de inhibicin y se debe medir el dimetro teniendo en cuenta la parte exterior de dicho borde. En los Proteus se puede presentar invasin de la zona interior del halo de inhibicin, observndose sin embargo un borde neto. Esta invasin no hay que tenerla en cuenta en las lecturas y el dimetro se mide considerando dicho borde neto. Staphylococcus aureus presenta resistencia cruzada a todos los betalactmicos; esta resistencia se estudia mediante discos de oxacilina de 1 g o de meticilina de 5 g, con incubacin a 30C, o sobre Meller-Hinton salino; las cepas resistentes a estos antibiticos deben considerarse resistentes al grupo.
LIMITACIONES DEL MTODO y CAUSAS DE ERROR. Pueden clasificarse en dependientes de: * Medio: mal estado, sin ajuste de pH, volumen inadecuado de la placa. * Antimicrobianos: Para los antimicrobianos que difunden lentamente en el agar los resultados pueden no ser fidedignos y se deben usar controles, an cuando se utilicen discos de elevado contenido para contrarrestar en cierta medida la difusibilidad lenta. Causas de error: mala conservacin de los discos (deben conservarse en frigorfico, en recipientes hermticamente cerrados y con desecador), caducidad de los mismos y tiempo de demora al inocularlos. * Microorganismos: Las tcnicas de difusin no son aplicables a microorganismos de desarrollo lento; si se requiere una incubacin prolongada para lograr suficiente desarrollo y obtener una zona de inhibicin detectable, el antibitico puede llegar a deteriorarse hasta el punto de producir lecturas imprecisas.
Estas tcnicas tampoco dan buenos resultados con microorganismos muy exigentes. Los mtodos de difusin no son aplicables a la determinacin de susceptibilidad de anaerobios. El largo perodo de incubacin necesario para la recuperacin de muchos anaerobios ha hecho difcil establecer esquemas interpretativos fiables. Causas de error: lo ms habitual es el exceso de inculo. Tambin puede conducir a errores la utilizacin de cultivos viejos, la inoculacin de ms de un microorganismo (colonias distintas o cultivos contaminados), la excesiva demora en la siembra y las condiciones de incubacin. * Observador: errores de lectura o excesiva demora en la misma y errores de trascripcin o interpretacin de resultados. ANTIBIOGRAMA POR DILUCIN. Como ya hemos dicho, se pueden realizar en medio lquido o en medio slido. Mediante este tipo de antibiograma se determina la "CMI": menor concentracin de antimicrobiano capaz de inhibir totalmente el crecimiento bacteriano "in vitro". EN MEDIO LQUIDO. Consiste en preparar una batera de tubos con distintas diluciones (concentraciones crecientes) del antimicrobiano, depositar en cada tubo un inculo de densidad celular conocida y, tras incubacin, ver en que tubos hay crecimiento y en cuales no. El tubo cuya concentracin de antimicrobiano sea menor y en el que no haya crecimiento corresponde a la CMI.
A) MEDIO DE CULTIVO : se utiliza el caldo de Meller-Hinton o el de tripticasa soja
para aquellos microorganismos que no pueden crecer en Meller-Hinton.

B) TCNICA:
Preparar el inculo correspondiente al 0,5 de la escala de Mac Farland. Realizar una dilucin 1/100 del inculo, lo que equivale a 105 microorganismos/ml aproximadamente. Aadir 1 ml de este inculo a una batera de tubos que contengan 1 ml de caldo de Meller- Hinton que lleva incorporado el antimicrobiano a concentraciones crecientes. Incubar a 37 C durante 18-24 horas. El tubo cuya concentracin de antimicrobiano sea menor y no presente crecimiento, corresponde a la CMI.
Se debe inocular un tubo de Meller-Hinton que se guardar en frigorfico a 4 C como control de siembra.
C) LECTURA E INTERPRETACIN DE RESULTADOS: se considera concentracin
mnima inhibitoria (CMI) la del tubo con menor concentracin (mayor dilucin) de
antimicrobiano que no presente aumento de turbidez respecto al tubo testigo guardado en el frigorfico. MICROTCNICA DE DILUCIN EN CALDO.
Hoy da, en los laboratorios con un alto volumen de trabajo, se suele utilizar la microtcnica de dilucin en caldo, cuyo fundamento es el mismo que el del mtodo que acabamos de describir, diferencindose en que la sensibilidad de los microorganismos a distintos antimicrobianos se prueba en una serie de "pocillos" moldeados en una placa de plstico. Cada placa puede contener 80 o ms pocillos segn el nmero de hileras horizontales y verticales. Ej.: una microplaca que contenga 80 concavidades dispuestas en 10 hileras verticales y 8 horizontales, permite el estudio de 10 antimicrobianos diferentes, cada uno a 8 diluciones seriadas. La microplaca se prepara colocando el volumen adecuado de las distintas diluciones de antimicrobianos en los pocillos, si bien existen ya en el mercado microplacas con los antimicrobianos liofilizados, preparadas para su uso inmediato
D I
E J
128 g/ml 64 g/ml 32 g/ml 16 g/ml 8 g/ml 4 g/ml 2 g/ml 1 g/ml
Una vez preparadas dichas microplacas e incubadas se observar el crecimiento bacteriano como un botn en el fondo del pocillo. Estudiaremos a continuacin el ejemplo de la pgina anterior: Cada hilera vertical corresponde a un antimicrobiano distinto. Las hileras horizontales corresponden a diferentes diluciones del antimicrobiano.
Observamos que en la hilera "A" con un antimicrobiano determinado [A] hay crecimiento bacteriano en todas las concavidades. Esto significa que el microorganismo en estudio es resistente al antimicrobiano [A] en todas las concentraciones ensayadas, o bien, que la CMI es superior a 128 g/ml. Observamos que en la hilera "B" hay crecimiento bacteriano en las seis ltimas concavidades. Esto significa que la CMI del antimicrobiano [B] para el microorganismo en estudio es 64 g/ml.
EN MEDIO SLIDO. Este mtodo permite tambin la investigacin de la CMI. Tiene la ventaja de ser de ms fcil y mejor manipulacin que la tcnica en medio lquido. Adems permite realizar el estudio de varias cepas distintas por placa y descubre mejor una contaminacin. Este mtodo implica el uso de una serie de placas de agar Meller-Hinton, cada una con una diferente concentracin del antimicrobiano a probar. Las diluciones de antimicrobiano suelen oscilar entre unos lmites establecidos, que van desde 0,25 g/ml hasta 128 g/ml, para la mayora de los antimicrobianos, sin excepciones. El antimicrobiano se aadir al medio de cultivo despus de esterilizarlo y una vez que se haya enfriado hasta aproximadamente 50 C, en proporcin 1/10 (V/V).Se procurar una distribucin lo ms homognea posible, evitando la formacin de burbujas. Paralelamente se preparan placas control sin antimicrobiano. Las placas solidificadas se guardan refrigeradas y deben utilizarse antes de una semana.
A) MEDIO DE CULTIVO : agar Meller-Hinton suplementado con un 5% de sangre
en caso necesario.
B) TCNICA:
Preparar las placas de agar Meller-Hinton con las distintas diluciones de antimicrobiano. Preparar el inculo ajustndolo al 0,5 de la escala de MacFarland y diluyndolo al 1/10. Inocular: la inoculacin se realiza en "gota" (sin extender) mediante un asa calibrada que dispense 1 o 2 microlitros o con un dispositivo multidispensador que deposite este volumen de muestra, del tipo del replicador de Steers. En ambos casos, una gota de 5-8 mm de dimetro contiene la misma concentracin microbiana. Se comienza inoculando las placas de menor concentracin, dejando las placas control las ltimas con el fin de comprobar que hubo microorganismos viables en todo el procedimiento y ausencia de contaminacin. La posible invasin de Proteus se evita presionando un cilindro de vidrio en el agar que rodea la gota.
Las placas inoculadas se dejan reposar hasta que las gotas del inculo se absorben completamente, y luego se incuban a 35-37C durante 18-24 horas.
C) LECTURA E INTERPRETACIN DE RESULTADOS: la CMI viene dada por la
placa con menor concentracin de antimicrobiano que evite el crecimiento de la cepa investigada.
La interpretacin clnica de estos resultados se traduce en que se debe lograr alcanzar en el lugar de la infeccin una concentracin de antimicrobiano al menos igual a la C.M.I..
SISTEMAS AUTOMATIZADOS PARA PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD.

Estos sistemas aportan un resultado que se puede clasificar en susceptible, intermedio o resistente o en una concentracin mnima inhibitoria. Algunos sistemas se limitan a hacer automticos mtodos tradicionales, mientras que otros pueden dar lecturas tras pocas horas de incubacin. La mayora utilizan un procedimiento mecanizado de inoculacin de caldo sobre las diferentes concentraFederacin de Sanidad de las CC.OO.CC. Pgina 242 de 299
ciones de atimicrobiano, congelado o liofilizado, y una fase de lectura y procesamiento de resultados; otros sistemas inoculan placas de agar con diferentes diluciones de antimicrobiano, de forma similar a la que se utiliza con el replicador de Steers. La mayora de los sistemas se basan en la comparacin del crecimiento microbiano despus de un determinado tiempo de incubacin en presencia del antimicrobiano y el obtenido durante el mismo tiempo en su ausencia. La cantidad de crecimiento puede determinarse utilizando transmisin o dispersin de la luz, efectundose los clculos por ordenador. Para la determinacin de la CMI se emplean diferentes concentraciones del antimicrobiano.
ANTIBIOGRAMA ANAEROBIO.
Los estudios de sensibilidad frente a los grmenes anaerobios no tienen una eficacia y reproductibilidad igual que los destinados a los grmenes aerobios (los vistos hasta ahora). Por este motivo hay investigadores que recomiendan la no utilizacin sistemtica de estos mtodos y que el tratamiento se establezca segn criterios teraputicos previamente establecidos, basados en el conocimiento de los patrones de sensibilidad de los distintos grupos de anaerobios, y en la probable etiologa segn el tipo y lugar de la infeccin. Hay ocasiones, sin embargo en las que la gravedad del proceso o su larga duracin aconsejan su realizacin. Se sigue una metodologa similar a la descrita para los microorganismos aerobios, siendo de eleccin el mtodo de dilucin, tanto en medio lquido como en slido, utilizando un medio de cultivo enriquecido en incubando en condiciones anaerobias durante 24-72 horas. Como ya se ha comentado anteriormente, el mtodo de Bauer-Kirby no presenta la utilidad que tiene en ambiente aerobio ya que las condiciones de este mtodo no son totalmente reproducibles en ausencia de oxgeno; as, el medio de Meller-Hinton no sirve para el crecimiento de muchos anaerobios, y tiene que utilizarse suplementado con sangre de cordero o de caballo, falseando esta inclusin el dimetro del halo de inhibicin producido por algunos antibiticos. Adems, no existe una estricta correlacin entre los citados halos y las CMIs. Otra dificultad que presenta el mtodo es que slo es vlido para microorganismos de crecimiento rpido y la mayora de los anaerobios no lo son. Sealaremos, a continuacin, una serie de factores a tener en cuenta antes de efectuar estudios de sensibilidad para microorganismos anaerobios:
MEDIO DE CULTIVO. Para los antibiogramas anaerobios en caldo se puede utilizar el caldo infusin cerebro corazn, el caldo Schaedler, el caldo Brucella o el tioglicolato, siendo probablemente este ltimo el que mejores resultados da. Estos medios deben ir suplementados con hemina y vitamina K1 (factores de crecimiento para Bacteroides fragilis). Tambin se les puede adicionar extracto de levadura, que aportar vitaminas, purinas y pirimidinas. Para las tcnicas en medios slidos se suelen utilizar, adems de los ya citados previa adicin de agar, el Eugn agar, el Meller-Hinton agar suplementado con un 5% de sangre de cordero o de caballo o el medio de Wilkins y Chalgren, especficamente recomendado para la prueba de dilucin en agar. ATMSFERA DE INCUBACIN: La ms recomendable es la que est compuesta por un 5% de CO2, 10% de H2 y 85% de N2. La cantidad de CO2 no debe exceder del 10%, pues puede disminuir la accin de algunos antibiticos como lincomicina, macrlidos y aminoglicsidos. Adems, en los medios slidos influye rebajando el pH superficial, con la consecuente alteracin del efecto de betalactmicos y aminsidos. INCULO. Es prcticamente imposible precisar la cifra ideal de microorganismos para el inculo del antibiograma anaerobio. Sin embargo, con el fin de estandarizar, se considera el inculo ms apropiado el que presenta una turbidez igual a la mitad del 1 de la escala de MacFarland. En la prctica se llega a la citada turbidez suspendiendo directamente un cultivo joven, con menos de 72 horas, en caldo recientemente regenerado. A continuacin se diluye al 1/200, con el fin de obtener una concentracin bacteriana situada entre 105 y 106 UFC/ml (unidades formadoras de colonias /ml). La manipulacin puede hacerse en condiciones aerobias dentro de la primera media hora, sin que el germen anaerobio pierda viabilidad.
PRUEBAS ESPECIALES.
Ocasionalmente una determinada situacin clnica puede justificar la solicitud al laboratorio de una prueba no habitual respecto a frmacos antimicrobianos. A continuacin se describen las pruebas no habituales que se solicitan con ms frecuencia. DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN MNIMA BACTERICIDA. A partir de la tcnica de antibiograma por dilucin en medio lquido (macro y microtcnica) se puede calcular la "CMB" (Concentracin Mnima Bactericida) que se define como la "menor concentracin de antimicrobiano que mata por lo
menos el 99,9% del inculo original". Se pone de manifiesto sembrando con asa masivamente en una placa de agar Meller-Hinton los tubos que no hayan presentado turbidez e incubando a 37C durante 18-24 horas. En la prctica la CMB vendr dada por la concentracin del tubo con menor concentracin de antimicrobiano que impida el crecimiento sobre el medio slido. La determinacin de la CMB est especialmente indicada en casos en que las defensas del enfermo estn seriamente comprometidas, prefirindose administrar drogas bactericidas o fungicidas. La endocarditis ha sido y sigue siendo una de las principales indicaciones para estas pruebas. La determinacin de la CMB es tambin una prueba frecuentemente solicitada para pacientes de trasplante y quimioterapia del cncer. PRUEBA DE LA BETALACTAMASA. El grupo de frmacos betalactmicos engloba las penicilinas y cefalosporinas. El mecanismo de resistencia ms frecuente frente a este tipo de frmacos es la produccin de una enzima bacteriana (betalactamasa) que inactiva el frmaco al romper el anillo betalactmico. La prueba de la betalactamasa constituye un mtodo rpido de establecer si un germen que se ha aislado produce betalactamasa. En la prctica diaria se realiza de forma rutinaria in vitro para investigar, de forma ms rpida que con el antibiograma, la produccin de betalactamasa por Staphylococcus aureus, Haemophilus influenza y Neisseria gonorrhoeae. Sin embargo, hay que recordar que a veces las bacterias son resistentes a los frmacos betalactmicos por mecanismos que no tienen nada que ver con la produccin de betalactamasa. Por lo tanto, un resultado positivo indica una resistencia, mientras que un resultado negativo no garantiza la sensibilidad. La prueba se realiza exponiendo un substrato de prueba batalactmico al germen durante un perodo que oscila, dependiendo del microorganismo y el mtodo de prueba, entre los 10 segundos y los 60 minutos. Existen tres mtodos de uso general: el mtodo acidomtrico, el mtodo yodomtrico y el mtodo de la cefalosporina cromgena, pudiendo realizarse tanto con un substrato lquido como con papeles de filtro impregnados. Quizs de estos tres mtodos el ms utilizado sea el de la cefalosporina cromgena; la prueba se lleva a cabo aadiendo una suspensin concentrada del germen en estudio a un substrato cromgeno amortiguado (en esta prueba, una cefalosporina cromognica como la nitrocefina), incubndolo durante diez minutos a temperatura ambiente y observando si se produce cambio de color, que se originara por la ruptura de los anillos betalactmicos de la cefalosporina cromognica. ESTUDIO DE SECUENCIAS DE ADN PORTADORAS DE LA RESISTENCIA ANTIMICROBIANA: Mediante el estudio del ADN, por sondas y actualmente mediante tratamiento previo con la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), puede identificarse la presencia de secuencias responsables de resistencia a
distintos antimicrobianos; por ejemplo, la secuencia TEM-1 es responsable de la resistencia frente a penicilinas y cefalosporinas. PRUEBAS DE SINERGIA ANTIMICROBIANA. Cuando se administran dos o ms frmacos antimicrobianos a un paciente, el efecto de la combinacin puede ser: Aditivo: cuando la actividad antimicrobiana de la combinacin es la que cabra prever sumando las actividades que presentan los frmacos por separado. Antagnico: cuando la actividad de la combinacin es notablemente inferior a la suma de las actividades individuales. Sinrgico: cuando la actividad de la combinacin es considerablemente superior a la suma de las actividades individuales.
En la mayor parte de los casos la administracin de frmacos de forma combinada se realiza sobre la base de la experiencia descrita anteriormente. Solo en casos muy concretos, cuando un resultado sea esencial para el tratamiento de un paciente, es aconsejable estudiar el efecto de una combinacin frente al germen aislado en el propio paciente. ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DEL SUERO. En la actualidad el estudio de la actividad antibacteriana del suero es una prueba que se realiza en pacientes con septicemia, endocarditis, osteomielitis y meningitis para conocer la validez de la terapia establecida y modificarla en el caso de que los niveles sanguneos (sricos) sean bajos. El propsito de esta tcnica es determinar el ttulo de actividad antimicrobiana de la combinacin suero-antibitico contra el microorganismo aislado del proceso infeccioso en el paciente estudiado. La prueba bactericida del suero se realiza con muestras de suero obtenidas inmediatamente antes de la administracin del antimicrobiano (muestra en el mnimo) y 30-90 minutos de despus de la misma (segn la va de administracin y el frmaco de que se trate) (muestra en el mximo). Se diluyen los sueros utilizando como diluyente medio de cultivo lquido (BHI, caldo de Meller-Hinton suplementado con Ca++ y Mg++) o preferiblemente suero humano acumulado carente de antimicrobianos ya que permite mantener una concentracin constante de las protenas sricas en cada tubo. A continuacin se aade una suspensin de turbidez estandarizada del germen aislado en el paciente a cada tubo de dilucin de suero y a un tubo control que no contiene actividad antimicrobiana.
La densidad de microorganismos en cada tubo debe ser de aproximadamente 5x105 UFC/ml. Los tubos se incuban a 35C durante 20 horas en una atmsfera apropiada para el germen, se agitan para exponer a los microorganismos a la
actividad antimicrobiana que pueda haber escapado a la exposicin previa al adherirse a las paredes del tubo, y se vuelven a incubar otras cuatro horas. En este punto se determina el ttulo inhibitorio del suero, identificando la dilucin mxima del suero que inhibe el crecimiento visible del microorganismo. Los tubos que no presentan crecimiento visible se subcultivan en agar sangre o agar chocolate y se incuban durante 24 horas. Se cuenta el nmero de colonias de cada subcultivo y se determina el ttulo bactericida del suero, identificando la mxima dilucin del suero que provoca la muerte de al menos el 99,9% del inculo original. Actualmente, de forma general, se considera adecuada una dosificacin de antibitico que de un ttulo bactericida mximo 32 y mnimo 8. DETERMINACIN DE LAS CONCENTRACIONES DE ANTIMICROBIANOS EN LOS LQUIDOS DEL ORGANISMO. La determinacin del nivel de antimicrobiano en el suero u otro lquido corporal est indicada en los siguientes casos: Frmacos antimicrobianos (ej.: aminoglucsidos, cloranfenicol) que tienen unos mrgenes de concentraciones teraputicas-txicas estrechos o se acumulan rpidamente hasta alcanzar concentraciones txicas en los pacientes con disfunciones renales o hepticas. Pacientes donde no se ha demostrado el efecto clnico previsto; el fracaso del tratamiento podra deberse a comportamiento particular del antimicrobiano en ese paciente o a efectos del paciente, microorganismo o antimicrobiano que pueden desviar o anular la accin del antimicrobiano. Tratamiento de infecciones locales severas. Situaciones donde la enfermedad subyacente del paciente es tal que puede suponerse que el antibitico debe hacer algo ms que eliminar rutinariamente el microorganismo.
La mayora de las determinaciones de los niveles de antimicrobianos se realizan con inmunoensayos instrumentados rpidos. Los inmunoensayos desarrollados para el control de las drogas son mucho ms especficos que los bioensayos y adems tienen la ventaja de proporcionar los resultados en unas pocas horas, sin requerir una incubacin hasta el da siguiente.
DIMETRO ESTANDAR Y CORRELACIN APROXIMADA CON LA CMI

ANTIMICROBIANO Carga Dimetro en milmetros
R A. nadilxico y pipemdico Amicacina Ampicilina (Enterobacterias) Ampicilina para enterococos Ampicilina para estafilococos Ampicilina para estreptococos Ampicilina para haemophilus Azlocilina Aztreonan Cafaclor para haemophilus Cefalosporinas Ciprofloxacina Clindamicina Cloranfenicol Cloranfenicol (haemophilus) Colistina Cotrimoxazol Eritromicina Fostomicina Gentamicina Imipenem Meticilina Netilmicina Nitrofurantona Norfloxacina Ofloxacina Oxacilina Oxacilina para neumococos Penicilina para estafilococos Penicilina para estreptococos Piperacilina (Enterobacterias) Piperacilina para pseudomonas Rifampicina Tetraciclina Ticarcilina para enterobacterias Ticarcilina para pseudomonas Tobramicina Vancomicina 30 mcg 30 mcg 10 mcg 10 mcg 10 mcg 10 mcg 10 mcg 75 mcg 30 mcg 30 mcg 30 mcg 5 mcg 2 mcg 30 mcg 30 mcg 10 mcg 25 mcg 15 mcg 50 mcg 10 mcg 10 mcg 5 mcg 30 mcg 300mcg 10 mcg 5 mcg 1 mcg 1 mcg 10 UI 10 UI 100mcg 100mcg 5 mcg 30 mcg 75 mcg 75 mcg 10 mcg 30 mcg 13 14 11 16 28 21 19 14 17 18 14 16 14 12 25 8 10 13 11 12 14 9 12 14 14 14 10 19 28 19 14 17 16 14 14 14 12 9 MS 14-18 15-16 12-13 22-29 15-17 19-23 15-17 17-20 15-16 13-17 26-28 9-10 11-15 14-17 12-14 13-14 10-13 13-14 15-16 11-12 20-27 15-17 17-19 15-18 15-19 13-14 10-11 S 19 17 14 17 29 30 20 18 26 24 18 21 17 18 29 11 200 18 15 15 16 14 15 17 17 16 13 20 29 28 18 18 20 19 20 15 15 12 Correlacin con CMI
en mcg/ml
R 32 32 32 16 lactamasa 4 4 256 32 32 32 4 2 25 8 4 35 8 8 16 32 100 16 8 lactamasa 4 256 128 4 16 128 128 8 2 6 4 3 8 25 4 2 1 0,06 0,1 0,1 64 64 1 4 16 64 6 5 S 12 12 8 4 0,2 0,1 2 64 8 8 8 1 1 12 4 -
TEMA 17.- CONTROLES DE CALIDAD INTERNOS Y EVALUACIN EXTERNA DE LA CALIDAD.
INTRODUCCIN
En un sentido amplio, el control de calidad en los laboratorios debe hacerse siempre extensivo a cualquiera de sus aspectos clnico y de laboratorio, ya que en la prctica resulta difcil considerarlos de forma aislada o independiente. Debe procurarse ante todo una correcta recogida de los especmenes de sangre, su adecuada manipulacin y el empleo de los mtodos ms fiables. Ello obliga, por tanto, al mantenimiento peridico de los instrumentos analticos y a una verificacin sistemtica de la calidad de las tcnicas y sus correspondientes reactivos mediante la ayuda de especmenes y muestras control adecuados y de procedencia garantizada. Finalmente, el laboratorio debe tambin velar por la claridad y correccin en la forma de expresar los resultados al objeto de facilitar en todo momento su interpretacin clnica. En los laboratorios, el empleo cada vez ms extendido de autoanalizadores ha contribuido de manera decisiva no slo a incrementar la rapidez en la obtencin de los anlisis, sino fundamentalmente a mejorar la exactitud y precisin de los resultados. Asimismo, la posibilidad de obtener de forma sistemtica parmetros que, por el carcter engorroso de su determinacin manual, slo se suministraban espordicamente ha significado una gran mejora en el diagnstico diferencial de numerosas situaciones patolgicas. Como contrapartida, tales instrumentos precisan una atencin tcnica permanente, por cuanto un fallo en su calibracin o pequeas variaciones intrnsecas del sistema pueden repercutir de manera decisiva sobre un nmero muy elevado de resultados. El control de calidad en los laboratorios tiene especial importancia para todas aquellas tcnicas fundamentales en el diagnstico clnico en general. Aunque estos parmetros, hoy da, son determinados de forma sistemtica por diversos autoanalizadores, alguno de ellos a partir de una misma muestra de sangre, los laboratorios con reducido volumen asistencial continan empleando los mtodos convencionales o manuales donde el colormetro, la centrfuga y el microscopio ocupan an un lugar destacado. Este instrumental, aunque simple y reducido, precisa, al igual que los autoanali zadores, un control de calidad peridico, por lo que en modo alguno debe confundirse control de calidad con automatizacin.
CONCEPTOS BSICOS La realizacin de controles de calidad en el laboratorio clnico presupone el conocimiento de una terminologa bsica sin la cual resulta difcil interpretar el significado de los resultados obtenidos. Exactitud. Es la aproximacin de una medida a su valor real. Un mtodo exacto es, por tanto, aquel que suministra una medida correcta o real del parmetro analizado. Lo contrario es la inexactitud. El valor real de una medida se obtiene cuando se emplean mtodos de referencia seleccionados por su calidad en comparacin con otros, de acuerdo con unos criterios emitidos por organismos internacionales y reactivos de calidad garantizada. Precisin. Se define como la aproximacin del valor de una medida a s mismo, cuando se realizan varias determinaciones de la misma empleando el mismo mtodo. Para conocer la precisin de una medida no es necesario conocer su valor real, ya que lo nico que interesa es el grado de variacin obtenido despus de realizar varias determinaciones de la misma (reproductibilidad de la medida). Error. Es la desviacin de una medida con respecto a los criterios de exactitud y precisin. La inexactitud no debe acompaarse forzosamente de imprecisin y viceversa. As, un mtodo puede ser exacto pero impreciso, o preciso pero inexacto o ambas cosas a la vez (Figura 1). El error puede ser de dos tipos: aleatorio o sistemtico. El error aleatorio obedece a causas difciles de determinar, que casi siempre surgen de forma espordica (fallo tcnico al tomar una medida). Por el contrario, el error sistemtico suele obedecer a causas fciles de identificar, por cuanto se repite siempre de la misma manera (deficiente calibracin de los instrumentos analticos, errores sistemticos en la preparacin de reactivos y otros). Dispersin. Corresponde a la variabilidad de una medida alrededor de su valor medio. La dispersin de una medida se determina mediante dos parmetros: media aritmtica ( X ) y desviacin estndar (DE). La media aritmtica es el cociente entre la suma de todos los valores individuales (X) y el nmero total de los mismos (N). Ejemplo: Si para una medida se obtienen 10 valores diferentes, 5, 8, 6, 6, 7, 8, 7, 7, 9 y 7, la media aritmtica de la misma ser: 5+8+6+6+7+8+7+7+9+7 X= 10 =7
Exactitud y precisin Situacin ideal
Inexactitud y precisin Error sistemtico
Exactitud e imprecisin Error aleatorio
Inexactitud e imprecisin Error aleatorio
El valor de X se conoce simplemente como media o valor medio de un conjunto de valores y debe diferenciarse de la moda y la mediana. La moda corresponde al valor de conjunto que se repite con mayor frecuencia. En el ejemplo anterior la moda es 7. La mediana es el valor situado en medio de una serie de valores ordenados numricamente. En el ejemplo anterior, las cifras ordenadas numricamente son 5, 6, 7, 8 y 9, por lo tanto la mediana es 7. Cuando, como en el ejemplo citado, la media aritmtica, la moda y la mediana tienen el mismo valor, se dice que la poblacin estudiada presenta una distribucin normal o gaussiana. La desviacin estndar (DE) es la raz cuadrada de la varianza (V), siendo sta el cociente entre la suma de los cuadrados de las diferencias entre cada valor individual (Xi) y la media aritmtica y los grados de libertad (nmero de observaciones menos uno).
As, en el ejemplo anterior, el valor de la DE sera de 1,15, y el de la varianza (V) de 1,33: (Xi-X)2 4 1 1 1 0 1 0 0 4 0 ?(Xi-X)2= 12
Prueba 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 N = 10
Xi 5 8 6 6 7 8 7 7 9 7 ?Xi = 70
Xi-X -2 +1 -1 -1 0 +1 0 0 +2 0
70 X= 10 ?(Xi-X)2 V= N1 = 9 12 = 1,33 =7
DE =
1 , 33
= 1,15
Coeficiente de variacin. Corresponde al valor de la desviacin estndar (DE) expresada en tanto por ciento de la media. DE x 100 CV (%) = X En el ejemplo anterior, el valor de CV sera: 1,15 x 100 CV = 7 Histograma. Es la representacin grfica del nmero de valores obtenidos para un determinado parmetro y proporciona una imagen de la distribucin de fre= 16,4 %
cuencias (Figura 2). Cuando el nmero de valores es muy elevado, el histograma se transforma en una curva continua (curva de distribucin).
80 70 60 Frecuencia (%) 50 40 30 20 10 0 10 30 50 Actividad Enzimtica 70 90
Figura 2. Histograma.
Intervalo de confianza. El intervalo de confianza se define como un conjunto de valores dentro de los cuales est situada la media verdadera. En general, el intervalo de confianza mnimo corresponde al 95 %, es decir, la probabilidad de que el valor medio sea el verdadero es del 95 % o uno de cada veinte valores obtenidos puede hallarse fuera de los lmites de confianza. En una distribucin normal el lmite de confianza mnimo corresponde a todos los valores incluidos dentro de las dos desviaciones estndar de la media (2 DE). Patrones, muestra de referencia y controles. Un patrn es una sustancia cuyas caractersticas han sido analizadas mediante procedimientos fsicos o qumicos y a la cual se le ha asignado un determinado valor. Los patrones pueden ser de dos tipos: a) nacionales y b) internacionales. Los patrones internacionales son elaborados nicamente por la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) o el Comit Internacional de Estandarizacin en Hematologa (ICSH). La finalidad de los patrones internacionales es suministrar un valor de referencia, con el cual se contrasta el valor de los patrones elaborados por las diferentes organizaciones nacionales de control de calidad (patrones nacionales).
Una muestra de referencia es una sustancia estable elaborada de acuerdo con las caractersticas de un patrn nacional o internacional y que normalmente es utilizada para controlar la exactitud de una determinada tcnica. Cuando la muestra de referencia se emplea para calibrar un instrumento analtico o para ajustar una medida a su valor verdadero, recibe el nombre de calibrador. Un control es una muestra con caractersticas similares a los especmenes problemas que se emplean para verificar la precisin o reproductibilidad de un mtodo o tcnica y ocasionalmente pueden servir para calibrar instrumentos, si se conoce el valor verdadero de la medida que se quiere controlar. En hematologa es muy comn el empleo de controles constituidos por suspensiones de clulas sanguneas (humanas o de animales) para la calibracin de los analizadores destinados a la determinacin de los parmetros bsicos (recuentos, hemoglobina, hematocrito e ndices eritrocitarios secundarios). En general, dichas suspensiones celulares tienen propiedades fsicas similares a los especmenes de sangre total humana y son preparadas por diferentes firmas comerciales, que las recomiendan para la calibracin de sus propios instrumentos. Dado que estas muestras control comerciales vienen convenientemente valoradas, es decir, se conoce el valor de los parmetros que hay que controlar, son normalmente utilizadas para verificar no slo la precisin, sino tambin la exactitud de los autoanalizadores (calibracin). Esta funcin hace que normalmente se las conozca tambin como calibradores, aunque en realidad tal denominacin sea incorrecta debido a la inexistencia de un patrn de referencia internacional de sangre total estabilizada. SISTEMTICA DE CONTROL DE CALIDAD EN LOS LABORATORIOS El control de calidad en un laboratorio clnico debe considerar siempre la doble vertiente: interna y externa. El control de calidad interno ser realiza diariamente en cada laboratorio mediante empleo de especmenes control propios o comerciales y tiene como finalidad asegurar la fiabilidad de los mtodos e instrumentos. El control de calidad externo se realiza peridicamente (en general cada mes) y en l participan otros muchos laboratorios, que al analizar un mismo espcimen controlan as la exactitud de los mtodos que emplean en la realizacin de las tcnicas. CONTROL DE CALIDAD INTERNO El control de calidad interno tiene como finalidad verificar la exactitud y precisin de los diferentes mtodos o tcnicas diagnsticas empleadas. Para ello es necesario el uso de controles y patrones. Debe hacerse extensivo no slo a la metodologa empleada en la realizacin de las diferentes tcnicas, sino tambin a todo el proceso que se extiende desde la preparacin del material que hay que utilizar y la extraccin y manipulacin de
las muestras de sangre hasta su procesamiento y entrega de resultados. Asimismo, debe incluir el control peridico de los reactivos, recipientes e instrumentos que se emplean tanto para las tcnicas manuales como para las automatizadas. Para controlar la fiabilidad de las tcnicas utilizadas para determinar los parmetros bsicos, se suelen emplear muestras control comerciales. Este tipo de controles son en la actualidad ampliamente utilizados para la calibracin de autoanalizadores, por lo que se denominan tambin calibradores. Con todo, los controles comerciales, pese a su indudable utilidad, presentan diversos inconvenientes: No controlan la metdica utilizada en la extraccin y preparacin de los especmenes de sangre que hay que utilizar. Son fcilmente reconocidos por el personal tcnico del laboratorio, por lo que suelen recibir un tratamiento especial y, por tanto, distinto al de los restantes especmenes del da. Son relativamente caros, lo que hace difcil su adquisicin para determinados laboratorios.
Por todo lo mencionado, los controles comerciales pueden ser sustituidos por muestras control elaboradas en el mismo laboratorio. En este caso, el valor verdadero de los parmetros que hay que controlar debe determinarse previamente mediante los llamados mtodos de referencia. En general, el control de calidad interno de parmetros bsicos se consigue mediante el empleo combinado de muestras control comerciales y especmenes propios que se utilizan como controles. Los primeros son utilizados para verificar la calibracin de los autoanalizadores y la exactitud de los valores suministrados por los mismos mtodos u otros a lo largo del da. Los especmenes control propios deben ser elegidos al azar y se utilizan para verificar la reproductibilidad de los resultados correspondientes. Si tales especmenes no han de ser utilizados para verificar la exactitud de los mtodos, no es indispensable la determinacin del valor real de los parmetros que hay que controlar. CONTROL DE CALIDAD EXTERNO Gracias a la labor de diferentes organismos internacionales, la prctica de controles de calidad interlaboratorios o externos mejoran la exactitud de los resultado suministrados por los diferentes laboratorios. En Europa existen varios programas de control de calidad externo que se aplican a nivel local, regional y nacional, permitiendo apreciar de una manera mucho ms precisa las posibilidades o limitaciones de cada laboratorio participante en relacin a los restantes que intervienen en el mismo programa y comprobar su propio nivel metodolgico dentro del conjunto.
La complejidad de estos programas de control de calidad viene dada por la multiplicidad de tcnicas e instrumentos que pueden emplearse en la determinacin de un mismo parmetro y por el nmero de parmetros evaluados.
TEMA 18.- RECOGIDA DE LA MUESTRA. MTODOS DE IDENTIFICACIN.
Como requisitos mnimos la muestra que llega al laboratorio deber contener la siguiente informacin: * Nombre y apellidos * Fecha de nacimiento * Nmero de identificacin de la muestra, o del paciente o de la hoja de peticin * Nmero de la sala (remitente, nombre del mdico peticionario) * Fecha y hora de la toma de la muestra (da, hora, min.) Todas las personas involucradas en los procedimientos diagnsticos son conscientes del problema de la identificacin de las muestras. La confusin en los nombres, peticiones, muestras o resultados de las pruebas de los pacientes puede tener serios efectos sobre el tratamiento del paciente y podra, por lo ta nto, considerarse como una mala praxis. Este captulo resume brevemente la situacin actual en la identificacin de muestras y pacientes durante la fase preanaltica.
Nombre o nmero?
Cuando un paciente es admitido en un hospital, tiene que ser identificado por mucha gente, incluyendo enfermeras, facultativos, tcnicos y otras personas. Lo mismo ha de ser vlido para cualquier muestra tomada del paciente y trasladada al laboratorio del propio hospital u otro laboratorio externo. La comunicacin entre todas las partes del proceso diagnstico requiere la transferencia de esta identificacin del paciente. El uso del nombre y apellidos para identificar un individuo ha demostrado ser insuficiente para asegurar la transferencia correcta de la identidad. El nombre, apellidos y la fecha de nacimiento es la combinacin de informacin usada ms frecuentemente para la identificacin. A fin de reducir la cantidad de informacin manejada, en muchos hospitales se destina al paciente un nmero. Este nmero no puede ser utilizado para ningn otro individuo. Idealmente, este nmero se imprime junto con el nombre sobre cualquier pedido, muestra e informe. Los nmeros de la sala, habitacin y cama pueden ser una ayuda adicional. Esto es especialmente til si la extraccin de muestras no se hace por la misma persona que pide los exmenes de laboratorio clnico.
Alternativamente, un paquete de etiquetas autoadhesivas preimpresas con la identificacin del paciente pueden facilitarse en el momento de la admisin al hospital.
Los mtodos de identificacin

A la llegada al laboratorio, el paciente ha de ser identificado a partir de la informacin facilitada. Esto puede hacerse visualmente leyendo el nombre y sala de la etiqueta y de la hoja de peticin, transfiriendo esta informacin a las planillas de laboratorio y a todas las alcuotas de la muestra. La fase siguiente requiere la generacin de un sistema de subnumeracin que vincule al individuo y el da de la obtencin de las muestras (comnmente no ms largo de tres de dgitos). Muchas instituciones, sin embargo, usan medios electrnicos para transferir datos de identificacin: esto puede hacerse en lnea usando el sistema informtico del hospital, que transfiere los datos bsicos del paciente junto con la peticin directamente al sistema informtico del laboratorio. En este caso, las muestras que llegan al laboratorio tienen que estar vinculadas a una hoja de peticin determinada por el cdigo de barras o un sistema de cdigo alternativo fijado a las muestras. Recientemente, se han sugerido sistemas ms sofisticados que se utilizarn ampliamente en el futuro: un cdigo de barras bidimensional, cdigo de puntos o chips fijados a la muestra que pueden contener toda la informacin necesaria incluyendo la peticin y la informacin sobre el paciente.
Identificacin de la muestra en el laboratorio, forma directa respecto a la indirecta

La identidad del paciente se vincula inequvocamente al recipiente de la muestra en el punto de extraccin o recoleccin de la misma, siempre que la muestra primaria se mantenga a lo largo de todo el proceso analtico. Esto necesita separadores suero/plasma para mantener la muestra de trabajo (plasma o suero) en el tubo de muestra primario (sangre) y de esta forma ser identificado directamente por el lector del analizador. Si el lector no est disponible o se hacen alcuotas la muestra original, puede usarse un dispositivo que automticamente defina las posiciones de cada muestreo en cada uno de los analizadores utilizados. Este tipo de identificacin se llama identificacin indirecta (por localizacin). Mientras que los mecanismos directos de identificacin permiten identificar la muestra en cualquier momento y posicin, la identificacin indirecta por la posicin puede hacerse nicamente con la ayuda de una lista numerada de posiciones o un sistema informtico de laboratorio. Adems, cualquier porcin alcuota tiene el peligro inherente de una confusin adicional entre muestras.
Recomendacin: Cualquier muestra deber identificarse inequvocamente antes de ser procesada. Los procedimientos de identificacin directa de muestras primarias deberan usarse preferentemente a la identificacin indirecta y subdivisin de la muestra en alcuotas, para reducir los errores en la identificacin. Cualquier muestra cuya identidad y origen no est suficientemente documentada deber separarse a una forma estable (suero, plasma), guardarla en el refrigerador y completar la informacin omitida antes de procesarla.
TEMA 19.- TRANSPORTE DE MUESTRAS. EFECTOS DEL TIEMPO Y TEMPERATURA DURANTE EL TRANSPORTE.
Los efectos del tiempo y temperatura durante el transporte

El traslado de muestras al laboratorio clnico puede realizarse de diferentes maneras. Normalmente, los tiempos de traslado son cortos cuando el laboratorio se ubica cerca, o en las mismas instalaciones clnicas y no representa ningn problema.
Figura 1 Efecto del tiempo y la temperatura de almacenamiento sobre la concentracin de diversos componentes del suero de sangre coagulada sin anticoagulante.
() 4 C, () 23 C, () 30 C
Sin embargo, el tiempo transcurrido desde la extraccin de la sangre a la centrifugacin, no debera exceder de una hora. Algunos procedimientos de medida requieren aditivos especiales tales como fluoruro de sodio/oxalato para medir la concentracin de lactato o borato de sodio serina EDTA para medir la concentracin de amonio. La medicin de la concentracin de hemoglobina en el plasma requiere la manipulacin cuidadosa de la muestra de con EDTA. El traslado al laboratorio puede realizarse bien mediante un mensajero, o bien mediante un sistema de reparto por tubo neumtico. Los adelantos actuales en los sistemas de este ltimo tipo aseguran un traslado cuidadoso con el fin de evitar la hemlisis. Tales muestras pueden usarse para medir magnitudes bioqumicas, hematolgicas o para la realizacin de gasometras. Si por alguna razn tcnica se requiere un traslado de la muestra a larga distancia (p. ej. por correo o mensajeros de laboratorio), debera evitarse hacerlo con las muestras de sangre. La Figura 1 muestra la influencia de la temperatura y duracin del almacenamiento de muestras de sangre coagulada sobre algunas magnitudes La liberacin de in potasio desde los eritrocitos es mnima a temperatura ambiente debido a la actividad de la ATPasa intercambiadora de Na+/K+ dependiente de la temperatura. Este efecto aumenta tanto a 4 C como por encima de 30 C. Las concentraciones de glucosa disminuyen con el aumento de temperatura, mientras que con el fosfato se observa el fenmeno opuesto, ya que las fosfatasas del plasma y los eritrocitos aumentan la concentracin de este compuesto. Como se ha demostrado en la Figura 1, la duracin del almacenamiento a una temperatura determinada es un factor importante. Si una muestra de sangre se almacena durante 2 h a 23 C, las concentraciones de glucosa disminuyen aproximadamente un 10 por ciento. En las muestras patolgicas los efectos de tiempo y temperatura comnmente observados pueden presentar desviaciones. La disminucin dependiente del tiempo de la concentracin de glucosa en las muestras de sangre es mayor en las leucocitosis. Del mismo modo, el aumento de la concentracin de amonio dependiente del tiempo est ms acentuado en muestras con la concentracin cataltica de ? glutamiltransferasa elevada. Los anticuerpos pueden alterar las concentraciones de las clulas sanguneas en funcin de la dependencia de la temperatura que tengan dichos anticuerpos. Las concentraciones de muchos componentes bioqumicos tales como electrlitos, sustratos o enzimas no resultan afectados por un tiempo de transporte de envo de hasta cuatro das.
Las concentraciones de hemoglobina y de eritrocitos son tambin estables. Se observan diferencias importantes en la fraccin de volumen de los eritrocitos en la sangre (hematocrito), el volumen enttico de los eritrocitos (VCM) y la concentracin de bilirrubina en el plasma. Un examen fiable de los distintos leucocitos requiere que la preparacin de la extensin de sangre se realice dentro de las 3 horas siguientes a la toma de la muestra.
Transporte de muestras
Cuando es necesario enviar sangre u otros fluidos corporales humanos a un laboratorio distante, se han de cumplir ciertas normas de seguridad. Adems, tiene que conservarse la integridad de la muestra para asegurar su correcto examen. Las muestras deben enviarse en recipientes que sean resistentes a la filtracin, golpes y cambios de presin, y otras condiciones que puedan incidir en la manipulacin ordinaria que se realiza en el transporte. La Asociacin Internacional de Transporte Areo (IATA) requiere que en el exterior de paquete se escriba Muestras diagnsticas. En los Estados Unidos, las regulaciones de la Occupational Safety and Health Administration (OSHA) (Administracin de Salud y Seguridad Laboral) requieren que se adhiera al paquete una etiqueta de biorriesgo. Las muestras debern empaquetarse de una manera tal que puedan resistir las condiciones ambientales (temperatura y presin) a que puedan ser sometidas durante el transporte.
Debe evitarse la exposicin de muestras a la luz directa con el fin de proteger a los componentes sensibles a la luz, tal como la bilirrubina. Idealmente, deberan llevar varias capas de embalaje, con un recipiente primario con cierre que debera introducirse en un recipiente secundario que a su vez debera ponerse dentro un recipiente exterior, como se representa en la Figura 2. Debe ponerse siempre un material absorbente entre los recipientes primario y secundario para asegurar que se absorba cualquier derrame durante el transporte. Se debe utilizar una bolsa impermeable para asegurar que los documentos que acompaen esa muestra no sern daados por cualquier filtracin o derrame de la misma. Las muestras de sangre seca sobre papel de filtro debern enviarse en una envoltura de papel recio introducido en un sobre con precinto sellado para asegurar que los manipuladores del envo estn protegidos de la exposicin a la sangre seca, adems de asegurar la integridad de la muestra durante el transporte.
Figura 2. Empaquetado de muestras para el transporte
Para enviar muestras congeladas y refrigeradas, son adecuados materiales aislantes tales como un recipiente de poliestireno. Para la congelacin puede utilizarse hielo seco. LEAKAGE, NOTIFY Deben tomarse precauciones para asegurar que el recipiente empaquetado con hielo seco sea capaz de liberar el dixido de carbono gaseoso para evitar una sobrepresin que podra ocasionar el estallido del paquete.
TEMA 20.- EL ALMACENAMIENTO DE MUESTRAS EN EL LABORATORIO. SISTEMAS DE CONSERVACIN.
10 reglas y algunas recomendaciones

1. El procedimiento est regido por la estabilidad de los componentes de la muestra. Las causas ms importantes que pueden ocasionar alteraciones en la calidad de la muestra son: Metabolismo de las clulas sanguneas Evaporacin o sublimacin Reacciones qumicas Descomposicin microbiolgica Procesos osmticos Efecto de la luz Difusin de gases
2. Un transporte rpido y un corto tiempo de almacenamiento mejoran la fiabilidad de los resultados de laboratorio. 3. Las muestras se conservan ms tiempo almacenadas en frigorfico (pero hay notables excepciones!). 4. Las muestras deberan almacenarse siempre en recipientes cerrados (evaporacin!). 5. El peligro de evaporacin tambin existe en los refrigeradores (condensacin de humedad sobre los elementos de enfriamiento). 6. Los problemas de almacenamiento se reducen si se usan sistemas desechables de tomar muestras. 7. Los agentes de separacin (p. ej. Geles separadores) mejoran los rendimientos de suero o plasma y permiten que estos puedan mantenerse en los tubos originales encima de la sangre (89). 8. Evite sacudir los recipientes de muestra (sistemas de distribucin de tubo neumtico!): riesgo de hemlisis. 9. Almacenar siempre verticalmente los recipientes de muestra que contienen sangre; el proceso de la coagulacin se acelera. 10. Etiquete el material infeccioso y manjelo con especial cuidado.
8 reglas especiales y algunas recomendaciones ms tiles

1. Evite el almacenamiento de la sangre. Las muestras de sangre deberan llegar al laboratorio dentro de los 45 min siguientes a su recoleccin, a fin de asegurar que la centrifugacin y separacin de la muestra se efecta dentro de la primera hora. 2. Evite la gliclisis para mantener estables las concentraciones de glucosa y de lactato y el pH. La gliclisis puede evitarse por la adicin de un inhibidor junto con un anticoagulante. 3. Evite el efecto de la luz de otra manera habr una disminucin en las concentraciones de bilirrubina, ascorbato, porfirinas, creatinacinasa y folatos. 4. Reduzca el contacto con el aire tanto como sea posible. Si no se hace esto, la evaporacin o la sublimacin darn como resultado un aumento aparente en la concentracin de todos los componentes no voltiles. Este es particularmente el caso cuando el volumen de la muestra es relativamente pequeo y el rea de superficie es relativamente grande. 5. La sangre no debera almacenarse en el refrigerador. Cuando la orina se enfra, las sales pueden precipitar (fosfato de magnesio y calcio, urato). 6. Para ciertos componentes, las muestras no deberan congelarse. Esta congelacin puede redundar en resultados errneos para los siguientes componentes: Ejemplos de componentes de la sangre y la orina que no deben almacenarse congelados Muestra Suero o plasma: Componentes Lipoprotenas (fracciones electroforticas Lipoprotena X Apolipoprotena A-I y B Colesterol de LDL (prevenida por la adicin de glicerol) Monmeros de fibrina en el plasma Clulas sanguneas IgG Sedimento Urato (precipitaciones!)
Sangre con EDTA Orina
7. Una descongelacin adecuada. La homogeneizacin inadecuada de las muestras congeladas despus de la descongelacin es una fuente muy comn de error. Durante la descongelacin se producen gradientes de concentracin que van desplazndose desde las soluciones concentradas
que primero funden haca las capas inferiores por las paredes del recipiente. Por tanto, despus de la descongelacin, la muestra deber invertirse varias veces, evitando la formacin de espuma. Con especial atencin sobre los materiales no disueltos, disolvindolos por calentamiento suave si fuera necesario. 8. El almacenamiento de las muestras despus de su examen se debe realizar de tal manera que permita la confirmacin de los resultados, la comprobacin de la identidad de las muestras o la realizacin de exmenes adicionales por razones mdicas o legales.
Tiempo y condiciones de almacenamiento recomendadas para muestras tras ser examinadas Muestra para Tiempo almacenaTemperatura miento Bioqumica: 1 semana Refrigerador Inmunologa: 1 semana Refrigerador Hematologa: 2 das Temperatura ambiente Coagulacin: 1 da Refrigerador Toxicologa: 6 semanas Refrigerador Grupo sanguneo: 1 semana Refrigerador
TEMA 21.- PREPARACIN DE LAS MUESTRAS. PROCESADO Y CENTRIFUGACIN.
Qu ha de hacerse a la llegada de una muestra?

Centrifugacin
La centrifugacin de la sangre coagulada para obtener suero debera realizarse despus de haberse asegurado de que la sangre ha coagulado. Normalmente, el tiempo de espera para que la sangre coagule es aproximadamente de 30 min. Sin embargo, los pacientes que estn con una terapia anticoagulante, o aquellos con deficiencias en la coagulacin tendrn una coagulacin retrasada. La centrifugacin de sangre coagulada para obtener suero o de sangre anticoagulada para obtener plasma se realiza tpicamente entre 1000 y 1200 g durante 10 a 15 min. En las pruebas de coagulacin, la sangre citratada debera centrifugarse a 2000 g durante 15 min. La centrifugacin se realiza comnmente entre 20 y 22 C. Sin embargo, para algunos componentes que son lbiles durante la centrifugacin a temperatura ambiente, especialmente si durante la centrifugacin aumenta la temperatura, las muestras deberan centrifugarse a temperatura refrigerada (4 C). Sin embargo, la refrigeracin puede conducir a la filtracin de in potasio desde la clula, aumentado el valor de su concentracin en el plasma. Las muestras no debern volverse a centrifugar despus de la obtencin de suero o plasma. La alteracin de la relacin entre el agua plasmtica y la celular puede afectar la concentracin de los componentes, y as, introducir errores. Las muestras con una barrera de gel nunca deben volverse a centrifugar. El tiempo y la fuerza centrfuga aplicada al sedimento de sangre heparinizada debera ser tal que no deje plaquetas en la capa de plasma. Un fracaso al conseguir la sedimentacin completa de plaquetas producir aumentos inadecuados en la
Figura 1
concentracin de in potasio, lactato-deshidrogenasa, fosfatasa cida y fosfato procedentes de las plaquetas remanentes en el plasma (Figura 1) de la muestra. La Figura 2 muestra el control visual del plasma despus de la centrifugacin a diversas velocidades. Los tubos de micromuestra con o sin anticoagulantes pueden centrifugarse para obtener suero o plasma en una microcentrfuga con un adaptador que acepte estos tubos. La centrifugacin de tales tubos de recoleccin de micromuestras se realiza a velocidades que van desde las 6000 a las 15000 g durante un mnimo de 90 s.
Figura 2
TEMA 22.- ASPECTOS DE SEGURIDAD EN EL MANEJO DE MUESTRAS BIOLGICAS.
Los pasos para garantizar la seguridad son primordiales para la proteccin de la salud pblica de los trabajadores. En este captulo, se discute especficamente la eliminacin de muestras, agujas, tubos, y productos qumicos.
Eliminacin de agujas y otros objetos cortantes

La eliminacin de todos los objetos cortantes y punzantes tales como agujas se realiza mediante su colocacin en recipientes hermticos, resistentes a la puncin, con las etiquetas y el cdigo de color apropiados.
Deber evitarse reenfundar los objetos punzantes, as como doblar y romper las agujas. Sin embargo, si fuese necesario el reencapuchar, deber usarse o bien una esptula de un solo uso, o preferentemente, un dispositivo para reencapuchar. Estn disponibles dispositivos simples de reencapuchar, que permiten al flebotomista reenfundar la aguja con un riesgo mnimo de dao por puncin.
Eliminacin de tubos y muestras

Los tubos de recoleccin de la muestra que contienen sangre y que son destinados a su eliminacin debern colocarse en bolsas de biorriesgo que puedan resistir procesos de esterilizacin en autoclave. Estas bolsas deberan ponerse en recipientes a prueba de fugas que luego deben cerrarse de forma hermtica. Los fluidos corporales voluminosos tales como orina, vmitos, heces y otros fluidos corporales pueden ser eliminados por vertido al inodoro. Los recipientes de fluidos, tales como bolsas de sangre, debern incinerarse despus de colocarlos en recipientes de desechos biopeligrosos.
Productos Qumicos
Los residuos qumicos pueden ser inflamables, corrosivos, reactivos y txicos. Ejemplos de residuos qumicos inflamables incluyen lquidos voltiles combustibles tales como solventes orgnicos (p. ej., etanoles, acetona, xileno, tolueno, etc.), oxidantes tales como perxidos y sales de nitrato y gases combustibles tales como butano, silano e hidrgeno. Estos materiales deben marcarse con las etiquetas apropiadas de txicos y peligrosos.
No est recomendada la eliminacin de disolventes combustibles a travs de un fregadero o el inodoro. Si tales solventes son fcilmente solubles en agua, podran, ser eliminados en pequeas cantidades por vertido a un desage, seguido por grandes cantidades de agua. Lo mejor es recoger los disolventes inflamables en bidones de seguridad y almacenarlos en una cabina de almacenamiento previo a la recoleccin por un gestor de residuos autorizado. El ter y los disolve ntes clorados se debern recoger en latas separadas. Los otros disolventes pueden combinarse en una sola. Ejemplos de disolventes corrosivos son los cidos fuertes tales como cido sulfrico, clorhdrico, y fosfrico y bases tales como hidrxido de amonio.
No deben usarse productos qumicos txicos, corrosivos e inflamables como conservantes en la fase preanaltica. Nunca se ha de agregar orina a cidos concentrados. Dichos cidos debern ser diluidos aadindolos lentamente, dejndolos resbalar por las paredes del contenedor de orina. La eliminacin de cidos fuertes y materiales corrosivos deber hacerse preferentemente por vertido al fregadero, dejando correr el agua fra del grifo, a continuacin, en cantidades abundantes contaminacin para la capa de agua. Para estar bien informado sobre los productos qumicos peligrosos, cada laboratorio deber tener un archivo de hojas de datos de seguridad del material que enumere las propiedades peligrosas de cada producto qumico, y que pueden consultarse fcilmente en casos de emergencia o cuando haya duda con respecto a la naturaleza del riesgo.
TEMA 23. GESTIN DE RESIDUOS SANITARIOS. CLASIFICACIN, TRANSPORTE, ELIMINACIN Y TRATAMIENTO.

Los avances tecnolgicos en el campo de la atencin al paciente, tiene como contrapunto un incremento notable del volumen y diversidad de residuos sanitarios. La clasificacin, transporte, eliminacin y tratamiento y su gestin han pla nteado a nuestras organizaciones sanitarias numerosos problemas. Hoy, los centros sanitarios gestionan de forma diversa y con desigual oportunidad los residuos clnicos y no cabe duda de que una parte considerable de forma poco justificada (normativas legales escasas, contradictorias y confusas).
Qu situacin tiene nuestro pas respecto a los Residuos sanitarios?

En Espaa carecemos en el mbito estatal de un marco legal actualizado que regule la eliminacin de residuos sanitarios. As la Ley 42/75 sobre desechos y residuos slidos indica que los residuos generados como consecuencia de las actividades sanitarias en hospitales, clnicas y ambulatorios deben ser consideradas como residuos slidos urbanos; por tanto, su recogida y su tratamiento son competencia de los Ayuntamientos, dejando a cada administracin local la decisin de los reglamentos, clasificacin y el tratamiento de los residuos generados. En 1986, esta ley fue modificada por el Real Decreto legislativo 1163/1986 para adaptarse a la Directiva Comunitaria 75/442/CEE de 1975. Posteriormente el Real Decreto 833/88 por el que se aprueba el Reglamento para la ejecucin de la Ley 20/86 de residuos txicos y peligrosos, complet la mencionada ley 42/75. En Espaa, desde los aos 90, se ha realizado un gran esfuerzo, al menos legislativo, en la regulacin de los residuos sanitarios. Hoy 12 de las 17 Comunidades Autnomas, han preparado decretos especficos referentes a ellos. Debe tambin mencionarse, aunque son anteriores, los intentos llevados a cabo por diferentes Ayuntamientos como Madrid, Barcelona, Burgos, etc. con sus Ordena nzas Municipales, y los realizados por el SAS con sus Manual de Gestin Interna de Residuos Sanitarios, as como proyectos llevados acabo por la iniciativa privada (Proyecto Clinhos, Instituto Cerd), para organizar y tratar de dar una coherencia a la gestin de estos residuos, por lo que podemos afirmar que, an faltando una legislacin nacional, se ha tratado de regularizar este tipo de residuos.
Riesgos de los Residuos Sanitarios

La aproximacin al hipottico riesgo infeccioso de los residuos sanitarios, exige, al menos, la consideracin acerca de los de los factores necesarios para produFederacin de Sanidad de las CC.OO.CC. Pgina 274 de 299
cir la enfermedad entre los que se encuentran: carga microbiana, la resistencia del husped, la puerta de entrada del agente patgeno y la virulencia o la capacidad real del patgeno de producir una enfermedad. Los riesgos de transmisin de enfermedades infecciosas a travs de los residuos procedente de estos enfermos infecciosos, requieren buscar las evidencias epidemiolgicas de tal riesgo. Los riesgos son remotos.
Evidencias epidemiolgicas
El riesgo para el profesional sanitario que usa equipos o instrumental en el campo de la atencin al paciente y el riesgo para el personal que manipula el residuo sanitario, es decir ese material ya desechado, es distinto. Existen datos en la literatura cientfica que confirman la existencia de casos de transmisin ocupacional, principalmente Hepatitis B, C y VIH/ SIDA, adquiridos por TAS (Trabajador de Atencin a la Salud - enfermera, mdicos, tcnicos de laboratorio, etc.) como consecuencia de un accidente durante la atencin medica a un paciente fuente positiva de tales enfermedades.
Tabla. Casos definidos de transmisin ocupacional de VIH/SIDA declarados a nivel mundial.
Pas E.E.U.U Francia Espaa Italia Reino Unido Alemania Blgica Confederacin Helvtica Otros pases TOTAL
Nmero 49 10 5 4 4 2 2 1 7 84
% 58,34 11,90 5,95 4,76 4,76 2,38 2,38 1,19 8,34 100,0
Tomada y adaptada de: De Andrs R y Njera R: Algunos aspectos de la exposicin ocupacional a VIH en la atencin de salud en el mundo. 1996
De igual forma, se conocen, las diferentes categoras profesionales, el tipo de exposicin y los instrumentos que han intervenido en la transmisin ocupacional de esta enfermedad. Los pinchazos con agujas son los mas frecuentes (91,4%); cortes con escalpelo o bistur representan el 4,3%, cortes con vidrio (material de laboratorio) el 2,9%, siendo en un caso desconocido.
Tabla. Casos definidos de infeccin por VIH-1 adquirida ocupacionalmente. Distribucin por tipo de ocupacin o categora profesional.
Categora Profesional u Ocupacin Personal de enfermera Mdico clnico (no cirujano) Mdico cirujano Tcnico de laboratorio clnico Tcnico de laboratorio no clnico Tcnico de ciruga (instrumentista) Tcnico de dilisis Terapeuta respiratorio Auxiliar de enfermera/auxiliar de salud Gobernanta/personal de lavandera/mozo/personal de mantenimiento Otros, sin especificar TOTAL
N 40 7 1 17 3 2 1 1 1 3 8 84
(%) 46,62 8,34 1,19 20,24 3,57 2,38 1,19 1,19 1,19 3,57 9,52 100,00
Fuente: De Andrs R y Njera R: Algunos aspectos de la exposicin ocupacional a VIH en la atencin de salud en el mundo. 1996
Tabla Instrumentos de Transmisin Ocupacional de VIH. EE.UU.(*) y EUROPA (Abril 1996)**
INSTRUMENTO Agujas Escalpelo Vidrio Desconocido?
EE.UU. 39 1 2 1
EUROPA 25 (Pinchazo) 1 (Corte con objeto agudo) -
*Cardo, D. Comunicacin Personal. Mayo 1996. (Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta. Georgia) ** De Andrs R y Njera R: Algunos aspectos de la exposicin ocupacional a VIH en la atencin de salud en el mundo.
As, podemos concluir que: La transmisin de la enfermedad no se ha producido por contacto con objetos no punzantes o cortantes (sbanas, guantes, etc.).
No existe ningn caso en la literatura cientfica de infeccin VIH/SIDA adquirida por manipulacin de residuos sanitarios. Es muy importante resaltarse el hecho de que ms del 95% de los portadores de VIH/SIDA no estn hospitalizados y que el material potencialmente contaminado procedente de estos pacientes (jeringuillas, agujas, etc.), se elimina sin proteccin, incluidos en los residuos slidos urbanos, comportando pues, mayor riesgo de transmitir VIH/SIDA y cualquier otra enfermedad ya que por lo general el nmero de portadores (personas sin la enfermedad clnica pero con la misma capacidad infectiva que un enfermo y por lo tanto ms peligrosos desde el punto de vista sanitario), es mayor que el de enfermos, llegando a veces a la relacin 10/1 (10 portadores por 1 enfermo) e incluso mayor. No conocemos en la literatura cientfica ninguna evidencia o caso publicado de infeccin asociada a la manipulacin de residuos entre los trabajadores de las empresas externas que se dedican a la gestin de este tipo de residuos.
Un segundo aspecto relacionado en la bsqueda de la evidencia de los riesgos de los residuos sanitarios lo aportan los distintos estudios microbiolgicos de carga microbiana en los residuos sanitarios versus residuos domsticos: Diferentes estudios cientficos, en los que se han estudiado las cargas bacterianas o recuentos de bacterias totales, han puesto en evidencia que en los residuos sanitarios procedentes de hospitales grandes y pequeos, recogidos en diferentes unidades de hospitalizacin, as como en clnicas privadas, comparados con los residuos domsticos, dan como resultado que la carga bacteriana, (concentracin de bacterias), es mayor en los residuos domsticos que en los hospitalarios, con independencia de su procedencia. Media aritmtica de la concentracin total por tipo de hospital y consulta privada en residuos sanitarios y residuos domsticos. (colonias / gramo de residuo)
FUENTE
Microorganismos Totales
HOSPITAL GRANDE: C.I. Quirrgicos Hospitalizacin Quirrgica Hospitalizacin Mdica Pediatra Quirfano HOSPITAL PEQUEO: C.I.Quirrgicos Hospitalizacin Quirrgica Hospitalizacin Mdica Quirfano CONSULTAS PRIVADAS: Mdico General Dermatologa Pediatra Dentista RESIDUO DOMSTICO O URBANO 1,3 x 106 1,9 x 107 1,0 x 107 1,5 x 104 3,0 x 108 7,4 x 105 1,8 x 107 2,7 x 106 2,9 x 104 1,5 x 106 6,3 x 106 8,5 x 106 5,9 x 106 6,3 x 105
Esta mayor concentracin de bacterias en los residuos domsticos se mantena incluso cuando se diferenciaban los diferentes grupos de bacterias que componan los residuos en: aerobios, coliformes, E. Coli, Gram positivos, estreptococos grupo D y anaerobios facultativos.
Tabla. Media aritmtica de la concentracin total y por tipo de microorganis mos en residuos sanitarios y residuos domsticos. (colonias / gramo de residuo)
Grmenes Totales
Bacterias Gram Negativas
Estreptococos Grupo D
Hongos Y Levaduras
HOSPITAL GRANDE C.I. Quirrgicos Hospitalizacin Quirrgica Hospitalizacin Mdica Pediatra Quirfano HOSPITAL PEQUEO C.I. Quirrgicos Hospitalizacin Quirrgica Hospitalizacin Mdica Quirfano RESIDUO DOMESTICO O URBANO 7,4 x 105 1,8 x 107 2,7 x 106 2,9 x 104 3,0 x 108 2,4 x 104 1,7 x 104 1,4 x 104 8,5 x 104 6,3 x 107 1,5 x 104 6,1 x 105 5,5 x 104 2,8 x 102 6,9 x 106 4,0 x 102 8,3 x 103 7,9 x 103 2,5 x 103 6,5 x 105 1,5 x 106 6,3 x 106 8,5 x 106 5,9 x 106 6,3 x 105 1,5 x 105 1,8 x 106 1,2 x 106 6,9 x 106 1,3 x 104 4,4 x 103 2,9 x105 8,3 x 104 1,3 x 106 6,9 x 103 2,3 x 103 2,8 x103 1,2 x 102 1,8 x 103 8,1 x 102
Por lo tanto puede concluirse que: Los casos documentados transmisin profesional se han producido dentro de los centros sanitarios, como consecuencia de la atencin sanitaria directa a pacientes. No existe ningn caso documentado de VIH/SIDA se ha debido a la manipulacin de residuos sanitarios. Los casos de infeccin recogidos en la literatura cientfica se han producido por material punzante.
El riesgo de infeccin por residuos sanitarios, sin objetos punzantes, es prcticamente inexistente. La carga bacteriana, por tanto el potencial patgeno, de los residuos sanitarios es menor que el de los residuos domsticos. No existe ninguna evidencia de que los residuos sanitarios sean una amenaza para la salud pblica en general. El mayor riesgo proviene de la utilizacin privada de jeringuillas (ADVP, diabticos, asistencia domiciliaria, etc.). En la literatura cientfica no hay evidencias de casos de infeccin por manipulacin de residuos sanitarios entre los trabajadores de empresas externas que se dedican a la gestin de los mismos.
Por lo tanto. La mejora de la gestin los residuos sanitarios, exige: 1. Homogeneizar la denominacin, clasificacin y definicin de los residuos sanitarios. 2. Facilitar la segregacin, envasado, almacenamiento y transporte interno. 3. Unificar los criterios de gestin extracentro: (transporte y eliminacin o tratamiento). 4. Establecer un plan de gestin de los residuos en los centros sanitarios y no sanitarios. A cada una de estas propuestas que reflejan los aspectos prioritarios a tener en cuenta a la hora de gestionar este tipo de residuos.
CLASIFICACIN Y DEFINICIN DE LOS RESIDUOS SANITARIOS.

Residuo sanitario es el que se genera como resultado o a consecuencia de una actividad sanitaria bien mdica, farmacutica o veterinaria en cualquiera de sus mbitos: asistenciales, docentes o investigadores. Se consideran incluidos, entre otros, hospitales, centros de especialidades, centros de salud, clnicas pblicas y/o privadas, consultorios, consultas, centros universitarios y / o de formacin, farmacias, laboratorios clnicos (biolgicos, anatomopatolgicos, microbiolgicos), laboratorios farmacuticos, laboratorios industriales y cualquier centro en el que se realice actividad sanitaria mdica, farmacutica o veterinaria. CLASIFICACION Definicin: Grupo I o Clase A) Residuos Generales o Urbanos. Sin ningn tipo de contaminacin especfica, estn regulados por la Ley 42/75 sobre desechos y residuos slidos urbanos y el RD 1163/86 que la adapta a la
directiva Comunitaria 75/422/CEE. Son pues aquellos generados en donde no se realiza actividad propiamente sanitaria, tales como oficinas, comedores, cocina, cafetera, salas de espera, almacenes etc. Incluyen papel, cartn, vidrio, restos de comida, restos de jardinera, mobiliario, metales etc. Grupo II o Clase B) Residuos Biosanitarios Asimilables a Urbanos (RBU) Son aquellos que no pueden eliminarse mediante sistemas propios de los residuos slidos urbanos, sino con tratamiento de incineracin o desinfeccin. Incluye a todos aquellos que no estn definidos en el Grupo biosanitarios especiales o Especficos. Est constituido por residuos tales como material de curas, yesos, filtros de hemodilisis, vendajes, gasas, tabuladuras, guantes y otros desechables quirrgicos, bolsas de sangre vacas etc. Grupo III o Clase C) Residuos Biosanitarios especiales (RBE) Son los productos biolgicos y todo material de contacto con estos productos, con excepcin de las aguas residuales. En esta clase se incluyen aquellos residuos con capacidad potencial de producir contagio y/o toxicidad para los trabajadores sanitarios o por razones de tica y esttica. Estn constituidos por residuos de pacientes con infecciones altamente virulentas y erradicadas, Residuos de pacientes con infecciones de transmisin oral-fecal, Residuos de pacientes con infecciones de transmisin por aerosoles, filtros de dilisis de pacientes infecciosos, residuos punzantes o cortante, independientemente de su origen, cultivos y reservas de agentes infeccioso, residuos de animales infecciosos de experimentacin, cantidades importantes de lquidos corporales, especialmente sangre humana, residuos anatmicos humanos reconocibles Grupo IV o Clase D) Residuos Qumicos Residuos tipificados en normativas especiales: Residuos Qumicos aquellos contemplados en la Ley 20/1.986 Bsica de Residuos Txicos Peligrosos. Es el material de desecho contaminado con productos qumicos que le confieren el carcter de residuo txico y peligroso. Se gestin queda regulada por el RD 833/1988. Los ms importantes estn constituidos por los Citotxicos o cistostticos en los que importante recordar que debe ser diferenciada su eliminacin final y por su importancia cuantitativa y su especificidad sanitaria. Tambin se sitan en este grupo el formaldehido, compuestos de revelado, disolventes, mercurio, medicamentos caducados, reactivos de laboratorio y un amplio grupo como son: compuesto oxidante, desinfectante, pilas, gases de anestesia, aceites lubricantes, pinturas, lmparas fluorescentes, pesticidas, fibras de amianto, estabilizadores de material mdico, etc.
Grupo V o Clase E) Residuos Radiactivos Son residuos Radiactivos aquellos contaminados por sustancias radiactivas cuya eliminacin es competencia exclusiva de la Empresa Nacional de Residuos Radiactivos (ENRESA), de acuerdo con el Real Decreto 1522/84. Grupo VI o Clase F) Restos anatmicos y humanos de entidad Los cadveres y los restos humanos de entidad suficiente, procedentes de abortos, mutilaciones y operaciones quirrgicas. Su gestin queda regulada por el RD 2263/1974 sobre Polica Sanitaria Mortuoria Grupo VII o Clase G) Aguas Residuales Son lquidos que por su composicin pueden ser vertidos a la red de saneamiento. Las ordenanzas municipales establecen las condiciones que deben reunir las aguas que se vierten a la red de saneamiento. SEGREGACION, ENVASADO, ALMACENAMIENTO Y TRANSPORTE INTERNO El criterio que debe priorizarse es el de la correcta separacin-segregacin en los centros, que se realizar sobre la base de la clasificacin de los grupos definidos. Residuos Grupos Urbanos y Biosanitarios asimilables a urbanos: pueden acum ularse en un mismo envase ambos tipos de residuos. Debern separarse de todas las dems clases de residuos. Los envases para estos residuos deben cumplir las especificaciones oportunas (Normas Europeas): Bolsas con opacidad, impermeabilidad, resistencia etc. Si se utilizan bolsas de plstico sern de galga mnima 200, volumen no superior a 70 litros. Color negro. (Iguales que las utilizadas para la recogida domstica). Estos residuos se podrn compactar etc. Los residuos Biosanitarios Especiales: Acumulacin separada de todas las dems Clases o Grupos y en envases o contenedores rgidos exclusivos de un solo uso de color amarillo y sin posibilidad de apertura una vez cerrados, etiquetados con el Pictograma BIORIESGO. Los Residuos Grupo Qumicos Para Citostticos utilizar envases similares de color rojo y que contengan nicamente este tipo de residuos (Citostticos), por tanto deben separarse del resto de los residuos de este tipo III, etiquetados con el Pictograma CITOTXICO), deben prepararse en un local destinado a tal efecto y con las medidas de seguridad adecuadas. Otras caractersticas de los envases: Cumplir con las Normas Europeas, volumen mximo 60 litros de capacidad, estanqueidad, opacidad, resistencia etc. Para contener agujas, bisturs, objetos
cortantes etc, podrn tener diferentes volmenes de capacidad en funcin de las necesidades de cada rea. Transporte Interno Cada centro productor establecer dentro de su programa de gestin los circuitos ms acordes con sus necesidades, as como las caractersticas de los carros de transporte, su limpieza peridica, horarios de recogida etc., minimizando el riesgo para la salud de los pacientes, personal y de los visitantes. Almacenamiento En un local adecuado de fcil limpieza, ventilacin adecuada, estanco, sealizado, con capacidad suficiente de acuerdo al volumen de produccin, la frecuencia, caractersticas y condiciones de la recogida. GESTIN EXTRACENTRO ( TRANSPORTE Y ELIMINACIN O TRATAMIENTO) Corresponde a la Consejera de Medio Ambiente de cada comunidad autnoma que debe regular, autorizar y supervisar el correcto cumplimiento de las normas establecidas para cada una de las operaciones que forman parte de la gestin en el exterior de los centros sanitarios. A.- Transporte Externo de los Residuos Biosanitarios Asimilables a Urbanos La recogida y el transporte externo de los Residuos Urbanos y Biosanitarios asimilables a urbanos, podrn acumularse juntos, deber efectuarse, como mnimo, con las mismas precauciones que son de aplicacin a los residuos slidos urbanos. Los Ayuntamientos estn obligados a su recogida, transporte y eliminacin externa, en las condiciones que estipula la Ley 42 / 1.975 de Desechos y Residuos Slidos Urbanos. B.- Transporte Externo de los Residuos Biosanitarios Especiales En vehculos autorizados que cumplan la normativa vigente sobre transporte de mercancas por carretera. Los gestores de estos residuos deben tener la/s autorizaciones correspondientes para su transporte segn la normativa del Ministerio de Medio Ambiente y las que cada Comunidad Autnoma establezca como propias.
C.- Tratamiento y Eliminacin Grupo o Clases Residuos Generales y Residuos Biosanitarios Asimilables a Urbanos. Su tratamiento y eliminacin deber respetar, como mnimo, los mismos requisitos tcnicos, operativos y de seguridad que la normativa vigente exija con carcter general para los Residuos urbanos. Grupo o Clase Residuos Biosanitarios Especiales Dada la particularidad de este tipo de residuos, sera oportuno que su tratamiento y eliminacin cumpla con los siguientes criterios: Que no se incluyan en ningn programa de reciclado, neutralizacin o valorizacin. Debern ser obligatoriamente incinerados, esterilizados o desinfectados. Las modernas tecnologas que aparezcan y que garanticen la correcta eliminacin de estos residuos, debern estar validadas y autorizadas por los organismos competentes. La incineracin de los Residuos Biosanitarios Especiales deber cumplir la normativa vigente sobre la incineracin de este tipo de residuos. En su defecto deber cumplir los siguientes requisitos mnimos: o La carga del horno se realizar sin que exista ninguna manipulacin directa de los residuos por parte de los operarios, y sin que se produzca la rotura de los envases que contienen los residuos, de forma que no exista contacto directo de los residuos con ningn elemento mecnico exterior al horno. Deben introducirse directamente en la tolva de la carga del horno, sin pasar por la fosa de recepcin. o Debern cumplirse todas las especificaciones tcnicas y operativas establecidas en la normativa vigente sobre incineracin de residuos slidos urbanos en instalaciones de ms de tres toneladas por hora de capacidad. o Ser de funcionamiento continuo. o Tener una capacidad superior a tres toneladas por hora. o El contenido de inquemados en las escorias propias de la incineracin de residuos slidos urbanos no debe ser superior al 3 por 100. o La carga de los residuos biosanitarios especiales debe hacerse durante el funcionamiento normal del horno. Deben excluirse, por ta nto, las fases de encendido en enfriamiento del horno. o Para los citotxicos se alcanzarn temperaturas de 1.200 C. o El funcionamiento de estas plantas de incineracin ser autorizado por el rgano autonmico competente.
Se entiende por desinfeccin de residuos sanitarios especiales aquella tecnologa que garantice: la eliminacin de las formas vegetativas de bacterias, mico-
bacterias, hongos y esporas de hongos que elimine los virus y que elimine las esporas del Bacillus Antracis. La tecnologa aplicada en todo proceso de desinfeccin cumplir los objetivos definidos en este apartado. Ser autorizado por el rgano autonmico competente. Al menos, trimestralmente deben ser realizadas pruebas de control microbiolgico para comprobar el grado o eficacia de la desinfeccin y de la esterilizacin en toda la masa del residuo segn normas UNE. Los resultados de estos anlisis debern quedar reflejados en un documento de control y seguimiento y siempre disponible a requerimiento de las autoridades competentes. Grupo o Clase Residuos Qumicos Citotxicos Dado el problema que plantea la neutralizacin qumica y el riesgo que para los manipuladores externos y el medio ambiente, acompaa a este tipo de residuos, como ya he comentado, se propone la incineracin como forma obligada de eliminacin en las condiciones descritas en el apartado anterior sobre incineracin de Residuos Sanitarios Especficos. Grupo o Clase Restos Anatmicos y Cadveres Este tipo de restos sern gestionados segn lo establecido en el Reglamento de la Polica Sanitaria Mortuoria en el Decreto 2263/1974 y segn las normativas autonmicas existentes al respecto de restos anatmicos y cadveres. Sin perjuicio de lo establecido por la legislacin especial vigente sobre obtencin de piezas anatmicas por trasplante y utilizacin de cadveres para fines cientficos y de enseanza, el destino final de todo cadver ser uno de los tres siguientes: Enterramiento en lugar autorizado. Incineracin. Inmersin en alta mar.
Tambin tendrn uno de los destinos expresados en el prrafo anterior, los restos humanos de entidad suficiente y procedente de abortos, mutilaciones y operaciones quirrgicas, sin otro requisito en el orden sanitario, que el certificado facultativo en que se acredite la causa y procedencia de tales restos. Cuando el mdico que lo extienda deduzca la existencia de posibles riesgos de contagio, lo pondr inmediatamente en conocimiento de la Direccin Provincial de Sanidad de la Consejera de Salud correspondiente, que adoptar las medidas oportunas.
PLAN DE GESTIN DE LOS RESIDUOS EN LOS CENTROS SANITARIOS (Y NO SANITARIOS): Todo Centro Sanitario debe disponer de: A.- Plan General de minimizacin en el que se definan los tipos de residuos, su clasificacin, separacin, acondicionamiento, circuito de transporte interno, almacenamiento y tratamiento si lo realiza individualizado, as como acciones a tomar para implantar esta minimizacin. El trmino reduccin en muchas ocasiones se utiliza como minimizacin y aunque la ms simple y eficaz medida para reducir el volumen de residuos es introducir una clasificacin o definicin de los mismos que sea clara y fcil de entender as como establecer y aplicar criterios comunes referidos especialmente a aquellos residuos que por sus especiales caractersticas requieran un envasado, transporte y tratamiento diferenciado, en nuestra opinin la minimizacin de residuos es prioritaria e inaplazable ya que la poltica de Residuos de la Unin Europea lo contempla en la Directiva 75/442, el 5 Programa de Medio Ambiente, la Directiva 91/C 190/ 01 relativa a los Envases y sus residuos, as como la Directiva 94/62, DOCE L, 365. La minimizacin debe entenderse en el concepto ms amplio de prevenir la generacin de residuos y este nuevo enfoque, para los residuos sanitarios, incluye actuaciones a llevar a efecto por el hospital, por los proveedores o fabricantes y por el Estado o Comunidad Autnoma. B.- Plan de Contingencia y medidas de prevencin de riesgos para todo el personal (manipulador y no manipulador) Se deber contemplar un Plan de Contingencia y Medidas de Prevencin de Riesgos, segn los establecido mediante la Ley 31/95 del 8 de Noviembre de Prevencin de Riesgos Laborales. La Ley de Prevencin de Riesgos Laborales tiene por objeto promover la seguridad y la salud de los trabajadores mediante la aplicacin de medidas y el desarrollo de las actividades necesarias para la prevencin de riesgos derivados del trabajo. Esta Ley establece los principios generales relativos a la prevencin de los riesgos profesionales para la proteccin de la seguridad y de la salud, la eliminacin o disminucin de los riesgos derivados del trabajo, la informacin, la consulta, la participacin equilibrada y la formacin de los trabajadores en materia preventiva. La Ley de Prevencin de Riesgos Laborales regula las actuaciones a desarrollar por las Administraciones Pblicas, as como por los empresarios, los trabajadores y sus respectivas organizaciones representativas.
Por tanto debe existir una normativa acorde con lo establecido en la Ley de prevencin de Riesgos Laborales y con este Plan en donde estn recogidas y escritas las medidas que han de ponerse en prctica ante determinadas circunstancias, (Roturas, salpicaduras, inoculaciones etc.), y otras tales como actuacin inmediata en suelos y superficies, registros, protocolos de control y seguimiento, profilaxis etc. del trabajador que sufra algn accidente o incidente con este tipo de residuos, as como la dotacin y equipamiento para la proteccin individual y las vacunaciones obligatorias de este personal que, al menos deberan ser, frente a ttanos y hepatitis B. C.- Se deber contemplar un Plan de Gestin de Envases y Residuos de Envases Farmacuticos, clnicos y hospitalarios. Atendiendo al objeto y mbito de aplicacin de la Ley de envases y residuos de envases (BOE N 99 de 25/4/97), hay que tener en cuenta que hay que prevenir y reducir el impacto sobre el medio ambiente de los envases y la gestin de los residuos de envases a lo largo de todo su ciclo de vida. Para alcanzar los anteriores objetivos se establecen medidas destinadas, como primera prioridad, a la prevencin de la produccin de residuos de envases, y en segundo lugar, a la reutilizacin de los envases, al reciclado y dems formas de valorizacin de residuos de envases, con la finalidad de evitar o reducir su eliminacin. Quedan dentro del mbito de aplicacin de la Ley de envases y residuos de envases a aquellos puestos en el mercado y generados, respectivamente, en el territorio del Estado. Lo establecido en la Ley de envases y residuos de envases lo ser sin perjuicio de las disposiciones de carcter especial referentes a seguridad, proteccin de la salud e higiene de los productos envasados, medicamentos, transportes y residuos peligrosos. D.- Participacin del personal en el Plan Propuesto Los profesionales sanitarios, y en general todos los empleados, son los miembros del Hospital que estn ms en contacto con los residuos y emisiones que ste genera y su manera de trabajar puede influir en su generacin, por lo que ocupan una posicin privilegiada para identificar problemas y plantear posibles soluciones. Es importante que comprendan los motivos del plan que se desea implantar, que se familiaricen con los cambios que se propongan y se sientan parte importante del programa en marcha, lo que puede lograrse mediante la formacin y el reconocimiento de sus aportaciones. La formacin puede proporcionarse organizando seminarios donde incluyan medios audiovisuales que pueden servir para presentar ejemplos prcticos de situaFederacin de Sanidad de las CC.OO.CC. Pgina 287 de 299
ciones que aparezcan en las plantas: manipulaciones incorrectas, clasificaciones diferentes, etc. Mediante reuniones del equipo responsable del Plan de minimizacin hospitalaria con los operarios, es posible informarles de los objetivos del Plan y de las mejoras que se espera alcanzar por la gestin del hospital y la de los propios trabajadores. Estas reuniones permiten resolver las dudas que los operarios pueden tener y conseguir que comenten los problemas que hayan identificado. En estas reuniones se debe prestar especial atencin al personal implicado en acciones con impacto directo en la generacin de residuos y emisiones y que pueden identificar oportunidades de minimizacin: DUE/ATS, Facultativos mdicos, auxiliares, personal interno, mantenimiento, etc. La formacin de los operarios debe mantenerse mientras dure la elaboracin e implantacin del Plan, pues siempre hay nuevos empleados que desconocen las tcnicas de minimizacin. Adems sirve para mantener el inters de todos los trabajadores y para informarles sobre los resultados del programa en marcha. En los grandes hospitales puede hacerse con ayuda de un boletn interno o utiliza ndo planes de anuncios instalados en las zonas de paso; en los pequeos hospitales o clnicas mediante reuniones peridicas. El procedimiento de las aportaciones de los operarios se logra por medio de una poltica diseada al efecto, que puede incluir regalos y primas por las ideas de minimizacin que proporcionan buenos resultados, premios y nominaciones a las mejoras ideas. E.- Sistema de Evaluacin y Registro. Es necesario estar en constante evaluacin de los objetivos planteados en este plan para continuar con el mismo, si los objetivos se alcanzan, o para corregir las anomalas o desviaciones que se detecten. Para finalizar consideramos que la promulgacin de una normativa estatal no debe obligar a la creacin de normativas especficas por parte de las Comunidades Autnomas que carezcan de ella. Sin embargo, la promulgacin de una normativa estatal debera establecer los requisitos mnimos que todas las Comunidades Autnomas deberan considerar en la gestin de los residuos sanitarios, homogeneizando todos los aspectos aqu considerados.
CUESTIONARIO DEL CURSO DE ANLISIS CLNICOS

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PREGUNTA
1 El 97% del oxgeno presente en sangre se transporta en combinacin con la hemoglobina, solo el 3% del oxgeno sanguneo se transporta en el plasma y en el citoplasma del eritrocito 2 La curva de disociacin de la oxihemoglobina en sangre presenta forma sigmoidal. Si la curva es modificada hacia la derecha, la hemoglobina gana afinidad por el oxgeno y necesita una mayor pO2 para llegar a saturarse. 3 Si la curva se modifica hacia la izquierda, la afinidad de la hemoglobina por el oxgeno est aumentada y se llega a la saturacin con una mayor pO2. 4 La cantidad de oxgeno unido a la Hb, no slo depende de la pO2, sino de otros muchos factores entre los que destacan, la pCO2, el pH, los fosfatos, y la altura. 5 La sangre transporta dixido de carbono en las siguientes formas: 70 % en forma de anin bicarbonato, 7 % disuelto en plasma, 23 % en forma de carbamilo-hemoglobina unido a protenas plasmticas. 6 La sangre venosa, ms fcil de obtener, puede dar valores correctos de pH aunque los dar incorrectos para la pCO2 alveolar y la saturacin de oxgeno arterial. 7 La sangre capilar arterializada, como la obtenida del dedo se puede emplear para determinar pH, pCO2 y pO2. 8 Una vez, extrada la sangre, la jeringa es el recipiente definitivo. Para cerrarla hermticamente, se suele pinchar en un corcho. No se debe doblar la aguja, ya que presenta un riesgo innecesario y no se asegura el cierre hermtico, (se le deben eliminar las burbujas de aire, previamente). 9 La muestra de sangre arterial no necesita ninguna manipulacin, el estudio de gases se realiza en sangre completa, una conservacin larga no modifica los gases disueltos. 10 La cantidad de oxgeno presente en sangre, al igual que la de CO2, suele expresarse en unidades de presin parcial. 11 La pO2 mide la cantidad de oxgeno que pasa del pulmn a la sangre. 12 Anoxia es el trmino general para la oxigenacin insuficiente, hipoxemia es la oxigenacin deficiente de la sangre y anoxemia u anoxihemia es la disminucin del oxgeno en sangre. 13 El CO2 es transportado desde los tejidos hasta los pulmo nes, donde es expulsado a travs de la respiracin. Con la pCO2 se refleja la eficacia de la excrecin pulmonar y la cantidad de CO2 generado por el metabolismo. Los valores normales de pCO2 en sangre arterial son de 6 a 15 mm de Hg. 14 HIPOCAPNIA: Es la disminucin de O2 en sangre por debajo de los valores normales. 15 La relacin entre los gases presentes en el pulmn por ventilacin y los que existen en sangre se representa por V/Q y recibe el nombre de cociente de ventilacin-perfusin. Federacin de Sanidad de las CC.OO.CC. Pgina 289 de 299
PREGUNTA
16 Para medir la pCO2 se emplea el electrodo de Mobius. 17 Para determinar la pCO2 se emplea el mtodo del electrodo polarigrfico de Clark para el oxgeno. 18 La gasometra arterial puede indicar ciertas anomalas y su grado de anormalidad. 19 Los cidos voltiles como el H2CO3, pueden ser eliminados por el pulmn en forma de CO2, pero los cidos no voltiles, no pueden ser eliminados por el pulmn, y deben excretarse a travs de la orina. 20 El principal tampn extracelular es el Sodio. 21 ACIDOSIS: Se produce cuando existe disminucin del pH sanguneo. 22 ALCALOSIS: Ocurre cuando el pH sanguneo es superior a 7.45. 23 Para medir el pH sanguneo es conveniente utilizar oxalatos como anticoagulantes. 24 Un ionograma es la determinacin y el registro de la concentracin de los diversos aniones y cationes de un lquido corporal. 25 Los dos constituyentes el LEC (plasma y lquido intersticial), presentan una composicin muy distinta de electrolitos 26 El sodio se excreta en orina cuando sus valores en sangre superan los 110 mmol/l. Se excreta de 30 a 280 mmol/da. 27 El potasio excretado en orina es de unos 240-320 mmol/da. 28 La funcin biolgica ms importante del sodio y el potasio, es la de regular la presin osmtica, y asegurar la integridad celular. 29 Existen diversas tcnicas para determinar el sodio y el potasio en sangre. La ms rpida y simple de ellas es la electroforesis. 30 El principal anin extracelular es el cloruro. El exceso de Cl- es excretado con la orina. 31 El mximo valor diagnstico en el infarto de miocardio lo representan las elevaciones de ciertas enzimas, como la GOT, CPK y LDH. 32 La experiencia confirma que las determinaciones de CPK y sus isoenzimas y de LDH y sus isoenzimas son los indicadores menos fiables para el diagnstico de laboratorio de necrosis miocrdica. 33 En casos de infarto de miocardio, la LDH1 aumenta antes que la LDH total, y puede incluso aumentar sin que se note todava ningn cambio de LDH total. 34 Creatinfosfoquinasa (CPK): es la enzima que ms precozmente se eleva en el infarto de miocardio, ya que hay niveles altos a las cuatro o seis horas. 35 La isoenzima MB (CPK-MB) resulta especfica del fallo renal; su curva de elevacin es similar a la de la CPK total, pero algo ms precoz. 36 Reciben el nombre de MARCADORES TUMORALES aquellas sustancias presentes en sangre, orina u otros lquidos corporales procedentes de la clula neoplsica. 37 La caracterstica principal de la clula tumoral con respecto a las clulas normales es fundamentalmente la prdida de control en los procesos de crec imiento y divisin.
PREGUNTA
38 En el cncer aparecen protenas anmalas que dotan a las clulas neoplsicas de una gran respuesta a factores que determinan su crecimiento y multiplic acin. Cabe resaltar la deteccin de la llamada "protena P" que dota a las c lulas de gran vulnerabilidad a las drogas neoplsicas utilizadas en quimioterapia. 39 Los antgenos inespecficos no estn asociados al tumor y comprenden diversas enzimas y protenas que aparecen en sangre. 40 La determinacin basal y la cuantificacin peridica de los marcadores tumorales es indicativa de la sensibilidad de la clula a una determinada terapia (marcadores teraputicos) e indicativa igualmente de la evolucin de la enfermedad y de la utilidad de la terapia elegida (marcadores de evolucin). 41 Sensibilidad de un marcador: es la probabilidad de encontrar un valor positivo en una poblacin de sanos. 42 Un marcador se puede emplear como prueba de screening en una poblacin para detectar un determinado cncer cuando el VPP sea bajo. 43 ndice tumoral de sntesis: es la relacin entre el nmero de clulas productoras del marcador utilizado en el seguimiento y el nmero total de clulas sanas. 44 Los marcadores tumora les pueden ser detectados en tejidos tumorales pero no en lquidos biolgicos. 45 La deteccin en tejidos tumorales se realiza mediante tcnicas inmunocitoqumicas. 46 En distintas neoplasias se emplean asociaciones de varios m arcadores para el diagnstico, seguimiento y deteccin precoz de recidivas. 47 Los antgenos oncofecales se detectan en sangre fetal y prcticamente despus del parto se reducen a niveles no detectables. 48 Muchas hormonas son producidas por los tumores: cuando el tejido no endocrino es responsable de la produccin de hormonas se habla de produccin hormonal atpica. 49 El CEA puede aparecer aumentado es especial en procesos malignos del aparato digestivo, pncreas, pulmn y mama. 50 En aproximadamente dos tercios de los pacientes, la produccin ectpica de la hormona adrenocorticotrpica (ACTH) se asocia con carcinoma gstrico. 51 Los tumores responsables de la produccin de hormona antidiurtica (ADH) son los pulmonares y pancreticos. 52 La tirocalcitonina srica (TCT) aparece aumentada en ciertos pacientes con carcinoma pulmonar, colnico, mamario, pancretico y gstrico. 53 Filamentos intermedios: son un componente importante del ncleo celular cuya funcin primordial es mantener la forma celular y la organizacin espacial de los orgnulos citoplasmticos. 54 El LCR, es el lquido seroso contenido en los ventrculos cerebrales, espacio subaracnoideo y conducto medular. 55 El LCR contiene muchas protenas en relacin al plasm a (14-45 mg/100 ml). 56 Un aumento en la concentracin de protenas del LCR puede estar causada por una meningitis purulenta. Federacin de Sanidad de las CC.OO.CC. Pgina 291 de 299
PREGUNTA
57 La determinacin de la glucosa en LCR se puede hacer por los mtodos de tincin de Folin Wu, Glucosa-oxidasa y Ortotoluidina. 58 La LDH aumenta en LCR en la leucemia. 59 En las meningitis purulentas disminuye el nmero de neutrfilos segmentados. 60 El lquido sinovial puede conservarse a -4 C, para analizar inmediatamente y a -70 C para serologa. 61 El aspecto normal del lquido sinovial es transparente y de color amarillo plido. La turbidez sugiere inflamacin, aunque no necesariamente. 62 Las protenas presentes en lquido sinovial dependen de las presentes en plasma. Si aumenta el nivel de protenas en plasma, tambin lo hace en el lquido sinovial. 63 La concentracin de una protena especfica se expresa normalmente como cociente lquido sinovial/plasma. 64 El examen del sedimento urinario comprende la investigacin e interpretacin de una serie de estructuras del mismo origen y composicin. 65 El examen del sedimento urinario es ms seguro cuando la orina est diluida. 66 No debe considerarse patolgica la aparicin de 2/3 hemates por campo, en el estudio del sedimento. 67 Clulas epiteliales escamosas. Proceden de la porcin proximal del tracto urinario inferior y del tracto genital femenino. 68 La orina normal fresca contiene microorganismos. 69 Las levaduras se diferencian de los hemates en que no se pueden teir con eosina. 70 Normalmente el sedimento urinario no contiene cilindros, su deteccin indica la existencia de una patologa renal. 71 Los cristales de fosfato triple (amnico, magnsico y clcico) son incoloros y presentan forma tpica de atad. Se encuentran en orinas alcalinas. 72 Los fosfatos amorfos aparecen como granulaciones que confieren al sedime nto una coloracin blanquecina. Pueden aparecer tras la ingestin de frutas. 73 Las heces se recogen en un frasco limpio con cierre hermtico, no es necesaria la esterilidad. 74 Para el examen macroscpico de las heces se tritura ligeramente en un mo rtero con agua una cantidad de heces del tamao de una nuez. Luego se pasa a una placa de Petri y colocamos esta sobre una cartulina blanca y negra. 75 La presencia de fibras musculares mal digeridas se llama ESTEATORREA. Se puede deber a una insuficiencia gstrica o pancretica. 76 La presencia de almidn no digerido en las heces se llama AMILORREA. 77 En el estudio de las grasas en heces pueden inducirnos a error los supositorios, los enemas oleosos y los portaobjetos y cubreobjetos mal desengrasados.
PREGUNTA
78 La mayora de las pruebas para detectar hemorragias ocultas en heces se basan en la determinacin de cido glutmico como indicativo del contenido de hemoglobina. 79 Trombopenia; recibe este nombre la disminucin del nmero de plaquetas por debajo de los valores normales, es decir, valores inferiores a 150000/ mm3. 80 Si en la tcnica manual, el recuento de leucocitos nos da valores inferiores a 3000/mm3, hay que volver a repetir el contaje, pero en vez de diluir 1:50, como es habitual, la dilucin se har 1:30. 81 Microcitosis; hemates con tamao <6 micras (anemia perniciosa). 82 Policromasa; anormal coloracin (azul, gris, rosa) indica inmadurez por produccin acelerada. 83 Satelitismo plaquetario; fenmeno en el que se presentan varias plaquetas rodeando a los segmentados. Se da a veces al utilizar EDTA como anticoagulante. 84 Los siderocitos son hemates que contienen grnulos de hemosiderina. Estos hemates son normales en las clulas precursoras de los hemates de mdula sea y en sangre perifrica. 85 Cuando aumenta el nmero de clulas con ncleos polilobulados se habla de una desviacin a la derecha, mientras que cuando aumentan las formas en cayado, metamielocitos o incluso estadios anteriores, se habla de una desviacin a la izquierda. 86 La funcin principal de los neutrfilos es la defensa del organismo contra las infecciones mediante el fenmeno de reaccin bioqumica. 87 El papel biolgico de los eosinfilos es el de modular las reacciones anafilcticas y las reacciones antgeno-anticuerpo en el proceso alrgico. 88 La funcin de los basfilos es inhibir las respuestas inflamatorias. 89 Los linfocitos son las principales clulas implicadas en la respuesta inmunitaria, reconociendo por sus receptores de membrana los determinantes antignicos con la colaboracin de otras clulas, como los macrfagos. 90 La funcin principal de los monocitos y macrfagos es la fagocitosis, que realizan de manera semejante a los neutrfilos. 91 Se entiende por frotis o extensin sangunea la formacin de una fina pelcula de sangre sobre una superficie, generalmente un portaobjetos, de forma que pueda ser observada al microscopio sin que las clulas se superpongan entre s. 92 En el anlisis digital de imagen los leucocitos son clasificados en tres categoras: linfocitos, monocitos y polinucleares. 93 Junto a la frmula leucocitaria, muchos contadores proporcionan adems informacin sobre morfologa de glbulos rojos y cuantificacin de plaquetas. 94 La tecnologa VCS modifica la morfologa de los hemates para facilitar su lectura. 95 En el analizador NE-800 se sustituye el haz de luz por una corriente elctrica, bien directa o de radiofrecuencia.
PREGUNTA
96 La hemostasia es el proceso encargado de prevenir la extravasacin sangunea espontnea, evita la hemorragia excesiva a nivel de los vasos lesionados y mantiene la fluidez de la sangre circulante. 97 En la coagulacin sangunea se pueden distinguir tres grandes etapas: a) activacin de la trombina; b) formacin del fibringeno y c) formacin de la costra. 98 Una vez que el trombo de fibrina ha cumplido su funcin hemosttica, es destruido mediante la fibrinolisis, proceso fisiolgico que se realiza gracias a la amilasa. 99 La exploracin de la coagulacin sangunea se basa en la realizacin de dos pruebas globales: el tiempo de protrombina (TP) y el tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA), que se complementan con una valoracin de la fibrinoformacin mediante la determinacin funcional del fibringeno o la realizacin del tiempo de trombina (TT). 100 El tiempo de Quick o de protrombina (TP) es el tiempo necesario para la coagulacin de un plasma recalcificado en presencia de un defecto de tromboplastina hstica. 101 El ndice Internacional de Sensibilidad (ISI) es el valor de la recta de regresin de los tiempos de protrombina de pacientes anticoagulados obtenidos con la tromboplastina comercial y con la tromboplastina de referencia internacional. 102 El tiempo de cefalina o TTP es el tiempo necesario para la coagulacin de un PPP recalcificado en presencia de cefalina (mezcla de fosfolpidos). 103 Tiempo de trombina es el tiempo que tarda en coagular un PPP citratado al aadir un exceso de trombina. El valor normal oscila entre 12 y 16 minutos. 104 El tiempo de reptilase permite diferenciar si el alargamiento del tiempo de trombina se debe a un trastorno en la formacin de fibrina o a la presencia de sodio en exceso. 105 El sistema ABO est formado por los antgenos A y B. 106 Las sustancias A y B empiezan a formarse en las primeras semanas del desarrollo fetal, donde adquieren toda su potencia inmunolgica. 107 Los antgenos que componen el sistema ABO y el sistema Lewis proceden de sustancias precursoras muy distintas, que son las del tipo I y tipo II, 108 Los genes que controlan el sistema ABO son el H, A, B y Se. Los genes A y B son codominantes entre s y dominantes sobre el O. 109 Los ttulos de anticuerpos naturales anti-A o anti-B nunca varan a lo largo de la vida. 110 Cuando los hemates tipificados como A, B o AB se transfunden a otra persona que no posea algunos de estos antgenos, el sistema inmunocompetente de sta se estimula formando anticuerpos contra el antgeno desconocido. 111 Para diferenciar los grupos A1, A2, A1B y A2B se utiliza principalmente el suero anti-A2B. 112 El 85% de los individuos caucasoides expresan el antgeno D y se les denomina Rh negativos.
PREGUNTA
113 Los antgenos del sistema Rh son protenas que forman parte integrante de la membrana de los eritrocitos nicamente. 114 Los anticuerpos del sistema Rh son casi siempre IgG, siendo estimulada su produccin por transfusin o por embarazo (Enfermedad hemoltica del recin nacido). 115 La prueba de Coombs sirve para poner de manifiesto los anticuerpos incompletos. 116 La prueba de Coombs est indicada siempre que exista sospecha clnica o biolgica de infeccin bacteriana. 117 La inmunohematologa es la parte de la hematologa que estudia los procesos inmunitarios que tienen lugar en el organismo en relacin con los elementos sanguneos. 118 Prueba cruzada mayor: Consiste en enfrentar suero del paciente c on hemates de una muestra poblacional. 119 Albmina: La adicin de albmina a los hemates suspendidos en medio salino normal disminuye la tasa de sensibilizacin, permitiendo un tiempo de incubacin ms corto. 120 Los anticuerpos solamente sern detectados mediante la prueba cruzada si los hemates del donante poseen el ant icuerpo correspondiente. 121 Un factor que puede confundir las pruebas cruzadas es el fenmeno "ro uleaux", donde los hemates aparecen formando como pilas de monedas. 122 Cada vez que un paciente es transfundido existe la posibilidad de que los hemates produzcan una estimulacin secundaria. Por ello, tras 24 horas de la transfusin, si se precisa otra, se debe extraer una nueva muestra de sangre del receptor y realizar una nueva prueba cruzada. 123 Inmunidad es la resistencia del organismo a las agresiones que pueda sufrir, sean de microorganismos, venenos, etc. 124 Las tcnicas inmunolgicas se basan, casi todas, en las reacciones cido-base y en las manifestaciones que de dicha reaccin se derivan. 125 Los antgenos particulados, como virus, bacterias o hemates extraos, son escasamente inmunognicos. 126 Una caracterstica de la reaccin Ag.-Ac. es la especificidad. Cuando un Ac. slo es capaz de reaccionar contra un Ag., se dice que ese Ac. es poco especfico. 127 INMUNOFLUORESCENCIA (I.F.) Son pruebas que utilizan sustancias fluorescentes (fluorocromos) unidas al Ac o al Ag. para demostrar que ha tenido lugar la reaccin Ag.- Ac., es decir para demostrar que existe el Ac. o el Ag. buscado. 128 Los fluorocromos son sustancias que sometidas a una fuente luminosa desprenden luz a una determinada longitud de onda y absorben luz a una longitud de onda mayor. 129 ENZIMOINMUNOANALISIS (ELISA) Son pruebas que se basan en la deteccin de la reaccin Ag.-Ac. mediante el empleo de Ags. o Acs. marcados con una enzima. La presencia de la enzima en el inmunocomplejo es detectada por una reaccin coloreada que se produce al aadir un sustrato.
PREGUNTA
130 REACCIONES DE PRECIPITACION. Son unos mtodos serolgicos que se basan en detectar la reaccin Ag.-Ac. por la formacin de un precipitado visible e irreversible. 131 Electroforesis: Separacin de los diferentes componentes (Ags.) de una muestra a estudiar, por su migracin diferencial cuando se somete la muestra a un campo elctrico. 132 El inmunoblotting tiene una gran aplicacin como tcnica para confirmar la infeccin por VIH (SIDA), ya que a una buena sensibilidad, comparable al ELISA, une una gran especificidad, eliminndose de esta forma los falsos positivos. 133 Dentro de las clulas el ADN sufre un proceso de plegamiento y empaquetamiento dando lugar a los genes. 134 La molcula de ADN tiene una escasa estabilidad lo que dificulta su transporte y almacenamiento. 135 En Microbiologa se utilizan sobre todo colorantes bsicos o nucleares debido a la gran basofilia del citoplasma bacteriano, rico en ARN. 136 TINCIN DE GRAM. Se estudia con esta coloracin la morfologa de los virus. 137 Las bacterias gram positivas se observan de color azul violeta y las gram negativas de color rosa. 138 La microscopa electrnica permite efectuar el diagnstico directo presuntivo de diversas infecciones vricas, en particular las gastroenteritis e infecciones por herpes simple. 139 Para estudiar las reacciones metablicas de las bacterias es necesario cultivarlas en medios de cultivo, que son mezclas de sustancias que proporcionan en forma asimilable todos los elementos necesarios para su crecimiento y multiplicacin. 140 Los medios de cultivo deben incluir los elementos indispensables para la vida bacteriana. 141 Los medios de cultivo se comercializan desecados, en forma de polvo, para su disolucin y esterilizacin. Actualmente se pueden adquirir tambin m edios slidos ya preparados, dispuestos en frascos, que se licuan mediante ebullicin y se dispensan en placas; medios en tubos y medios slidos en placa, listos para su inoculacin. 142 Los microorganismos aerobios y anaerobios facultativos no pueden ser incubados en una concentracin de aire ambiental. 143 El sistema ms comnmente usado para crear una atm sfera especfica anaerobia o capnfila es la jarra anaerobia. 144 Las bacterias se desarrollan habitualmente a pH muy cido. 145 Debido a la composicin de la pared celular bacteriana, las bacterias se adaptan bien a las variaciones de la presin osmtica; sin embargo, "in vitro", los medios de cultivo se preparan en condiciones de isotona. 146 PRUEBA DE LA OXIDASA. se investiga la presencia de la enzima citocromo oxidasa en el microorganismo, la cual oxida al dimetil-parafenilen-diamina (reactivo incoloro) dando un producto de color.
PREGUNTA
147 PRUEBA DE XIDO-FERMENTACIN. mediante esta prueba se va a determinar si la utilizacin de los hidratos de carbono por parte de un microorganismo se realiza por va oxidativa (proceso aerbico, presencia de oxgeno) o por va fermentativa (proceso anaerbico, ausencia de oxgeno). 148 PRUEBA DE LA DNasa. se basa en la capacidad que poseen ciertas bacterias para hidrolizar enzimticamente el ARN produciendo una mezcla de mono y polinucletidos. 149 SISTEMA API. Se usa para la identificacin de Enterobacterias, Estafilococos, Estreptococos, anaerobios, levaduras y algunas bacterias exigentes. 150 Se entiende por antibiograma la tcnica que permite el estudio "in vitro" de la sensibilidad de los microorganismos a los agentes antimicrobianos (antibiticos y quimioterpicos). Tiene por objeto proporcionar datos tiles para el tratamiento de una enfermedad infecciosa, aportando una informacin valiossima para el establecimiento de la teraputica antiinfecciosa, aunque para el mayor rendimiento de sta se deben considerar tambin las caractersticas del antimicrobiano, la clnica del proceso y al propio paciente que lo padece. 151 Independientemente del tipo de antibiograma que se realice, es fundamental partir de cultivos puros para obtener resultados fiables. En general, se debe realizar siempre un aislamiento y trabajar con colonias de muchos tipos de microorganismo. 152 INCUBACIN: Para todos los antibiogramas aerobios, 35 37 C durante 18 24 horas. 153 Staphylococcus aureus presenta resistencia cruzada a pocos betalactmicos. 154 La prueba bactericida del suero se realiza con muestras de suero obtenidas inmediatamente antes de la administracin del antimicrobiano (muestra en el mnimo) y 30-90 minutos de despus de la misma (segn la va de administracin y el frmaco de que se trate) (muestra en el mximo). 155 El valor real de una medida se obtiene cuando se emplean mtodos de referencia seleccionados por su calidad en comparacin con otros, de acuerdo con unos criterios emitidos por organismos internacionales y reactivos de calidad garantizada. 156 Para conocer la precisin de una medida es necesario conocer su valor real. 157 Error. Es la desviacin de una medida con respecto a los criterios de exactitud y precisin. 158 Histograma. Es la representacin grfica del nmero de valores obtenidos para un determinado parmetro y proporciona una imagen de la distribucin de frecuencias. 159 Intervalo de confianza. El intervalo de c onfianza se define como un conjunto de valores dentro de los cuales no se sita la media verdadera. 160 Un patrn es una sustancia cuyas caractersticas han sido analizadas mediante procedimientos fsicos o qumicos y a la cual se le ha asignado un determinado valor. Los patrones pueden ser de dos tipos: a) analticos y b) sintt icos. 161 Los patrones internacionales son elaborados nicamente por la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) o el Comit Internacional de Estandarizacin en Hematologa (ICSH).
PREGUNTA
162 Cuando la muestra de referencia se emplea para calibrar un instrumento analtico o para ajustar una medida a su valor verdadero, recibe el nombre de calibrador. 163 Un control es una muestra con caractersticas similares a los especmenes problemas que se emplean para verificar la precisin o reproductibilidad de un mtodo o tcnica y ocasionalmente pueden servir para calibrar instrume ntos, si se conoce el valor verdadero de la medida que se quiere controlar. 164 El control de calidad interno tiene como finalidad verificar el contenido de las muestras 165 Las concentraciones de glucosa se incrementan con el aumento de temperatura. 166 Para enviar muestras congeladas y refrigeradas, son adecuados materiales aislantes tales como un recipiente de poliestireno. Para la congelacin puede utilizarse hielo seco. 167 Deben tomarse precauciones para asegurar que el recipiente empaquetado con hielo seco no libere el dixido de carbono gaseoso. 168 El almacenamiento de las muestras despus de su examen se debe realizar de tal manera que permita la confirmacin de los resultados, la comprobacin de la identidad de las muestras o la realizacin de exmenes adicionales por razones mdicas o legales. 169 La centrifugacin de la sangre coagulada para obtener suero debera realizarse antes de que la sangre coagule. 170 La centrifugacin de sangre coagulada para obtener suero o de sangre anticoagulada para obtener plasma se realiza tpicamente entre 1000 y 1200 g durante 10 a 15 min. 171 Las muestras no debern volverse a centrifugar despus de la obtencin de suero o plasma. La alteracin de la relacin entre el agua plasmtica y la c elular puede afectar la concentracin de los componentes, y as, introducir errores. 172 Los tubos de micromuestra con o sin anticoagulantes no deben nunca centrifugarse. 173 Los tubos de recoleccin de la muestra que contienen sangre y que son destinados a su eliminacin debern colocarse en bolsas de biorriesgo que puedan resistir procesos de esterilizacin en autoclave. 174 Los fluidos corporales voluminosos tales como orina, vmitos, heces y otros fluidos corporales nunca deben eliminarse por vertido al inodoro. 175 No existe ningn caso en la literatura cientfica de infeccin VIH/SIDA adquirida por manipulacin de residuos sanitarios.
CUESTIONARIO DEL CURSO DE ANLISIS CLNICOS Nombre y Apellidos: DNI:

Escribir si Verdadero (V) o falso (F) en cada pregunta de la tabla siguiente:
V 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35
F 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70
F 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105
F 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140
F 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175

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CURSO DE ANLISIS CLNICOS

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TEMA 1.- GASES SANGUNEOS

BASES FISIOLGICAS BSICAS

TRANSPORTE DE GASES POR LA SANGRE.

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RECOGIDA DEL ESPCIMEN

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Para individuos de edad avanzada 70 mm de Hg. es el lmite inferior.

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MTODOS ANALTICOS DE MEDIDA DEL pH

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TEMA 2. IONOGRAMA. ESTUDIO ANALTICO

Lo que distingue a unos lquidos de otros, es simplemente la composicin de electrolitos.

Lquido extracelular 95-98% Na (142 mEq /l) >Ca

Lquido intracelular 2-5% K (161 mEq /l )>Mg>Ca

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Lquido intracelular Aniones orgnicos (protenas) * 4 veces ms protenas. 7.0

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Uso de electrodos especficos de este in.

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TEMA 3.- BIOQUMICA CARDIACA

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TEMA 4. PRINCIPALES MARCADORES TUMORALES E IMPLICACIN PRCTICA.

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ANTGENO CARCINOEMBRIONARIO (CEA)

TIPO MARCADOR Antgenos on- CEA cofetales AFP

TUMOR ASOCIADO Mama, colon Hgado, tumores germinales

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Receptores hormonales Marcadores celulares Poliaminas Hormonas

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TEMA 5. LQUIDOS BIOLGICOS: CITOLOGA Y BIOQUMICA.

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b) Espectrofotometra ultravioleta a 210 nm despus de: Cromatografa en columna. Ultra centrifugacin.

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c) Mtodo de Lowry utilizando el reactivo de Folin-ciocalteau. Con blanco. Sin blanco.

d) Procedimientos modificados del Biuret con medicin a 330 nm.

e) Fijacin de colorante. Ponceau. Otros colorantes.

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Tubo 1, para serologa: De 5-10 ml sin anticoagulante. Centrifugar y usar sobrenadante.

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Protenas Albmina Alfa-globulina Beta-globulina Gamma-globulina Glucosa PH

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TEMA 6. ANLISIS CUALITATIVO DEL SEDIMENTO URINARIO

IDENTIFICACIN DE ELEMENTOS ESPECFICOS EN EL SEDIMENTO