ASIGNATURA: ANLISIS INSTRUMENTAL

GUA DE TRABAJOS PRCTICOS

Autor: Lic. Susana Dieguez

TRABAJO PRCTICO N1

Buenas Prcticas de Laboratorio

Basndose en los conceptos recibidos en clase y en el anexo I de esta gua: Gua de Buenas Prcticas de Laboratorio , contestar el siguiente cuestionario 1) a.- Qu interpreta usted que es la seguridad en el laboratorio?? b.- Cul es la importancia segn usted de conocer las buenas prcticas en el laboratorio? 2) Indique cules de estas aseveraciones no son correctas

Trabajar solos fuera del horario de prcticos Seguir las instrucciones y consultar siempre al docente Comer y beber en el laboratorio cuando no se est haciendo ninguna prctica Usar propipeta para cargar agua .. No usar guardapolvo si no se va a trabajar en el laboratorio 3) Mencione al menos tres elementos de proteccin personal o indumentaria para ingresar al laboratorio.

TRABAJO PRCTICO N 2

Aplicaciones de Volumetras de Neutralizacin, Precipitacin, Complejacin y Oxidorreduccin.

1. Determinacin de acidez titulable en alimentos mediante una valoracin cido-base 1.1. Introduccin: Los cidos orgnicos presentes en los alimentos influyen en el sabor, color y estabilidad de los mismos. Los valores de acidez pueden ser muy variables; por ejemplo, en el caso de las frutas, varan desde 0,2 - 0,3 % en manzanas de poca acidez hasta un 6 % en el limn. Los cidos predominantes en frutas son: ctrico (citrus y frutas tropicales), mlico (manzana), tartrico (uvas, tamarindo) y ascrbico. Los productos pesqueros, aves y productos crnicos son de acidez muy baja y el cido predominante es el lctico. La determinacin de acidez es importante en alimentos y se realiza con diferentes fines segn el caso, tales como conocer grado de deterioro, establecer un ndice de madurez, detectar fraudes, etc. En el procedimiento usual para determinar la concentracin total de cidos, una alcuota de la solucin muestra se titula con una solucin estndar de lcali hasta el punto en el cual ha sido aadida una cantidad equivalente de la base. Este punto final puede detectarse mediante indicadores cido-base (cambio de color) o electromtricamente (pHmetro). Objetivo: Determinar la acidez de una muestra de vinagre 1.3. Materiales y reactivos Bureta Erlenmeyer matraz aforado Solucin de NaOH 0,1N Biftalato de potasio Solucin de fenolftalena Procedimiento Para la titulacin de la muestra se utiliza una solucin de NaOH como titulante. La misma debe ser normalizada antes de su utilizacin. Pesar exactamente entre 0.2 y 0.4 g de biftalato de potasio. Disolver en aproximadamente 25ml de agua destilada libre de CO2, agregar 3 o 4 gotas de solucin de fenolftalena. Titular desde una bureta con

1.2.

1.4.

1.4.1. Valoracin del titulante

la solucin de NaOH que se desea valorar hasta la aparicin de color rosa plido persistente. Calcular el ttulo de la solucin de NaOH. Porqu es importante realizar este paso?

Cules son las condiciones que debe cumplir un patrn

primario?

1.4.2. Valoracin de la muestra problema Tomar 1mL de muestra y agregar aproximadamente 25mL de agua destilada libre de CO2 y 3 o 4 gotas de fenolftalena. Titular desde una bureta con la solucin de NaOH valorada hasta la aparicin de color rosa plido persistente Porqu es necesario que el agua destilada agregada a la

muestra se encuentre libre de CO2?

Es importante que sea exacto el volumen de agua agregado a

la muestra? Porque se realiza este paso?

 En qu consiste el error de titulacin en este caso?

Qu concentracin de NaOH tendra que utilizar si se quieren

titular 5 mL de vinagre, gastando aproximadamente 10 mL de titulante?

1.5.

Resultados Concentracin de la solucin de NaOH utilizada como valorante

Acidez de la muestra de vinagre expresada en % de cido

actico

2. Determinacin de cloruros mediante volumetra de precipitacin (Mtodo de Mohr) 2.1. Introduccin Los cloruros constituyen las principales sales presentes en el agua, produciendo en la misma, sabor salado. La intensidad de este sabor depende de la composicin qumica del agua, y puede percibirse cuando los cloruros se encuentran en forma de NaCl por encima de 250 ppm. Segn el CAA el valor mximo de cloruros que puede estar presente en agua potable es de 350 ppm. Muchas de las actividades humanas, como agricultura y ganadera intensiva, produccin de petrleo, curtiembres, por nombrar algunas, generan altas concentraciones de cloruros. Por ese motivo, este in es utilizado como indicador de contaminacin antrpica en estudios ambientales. Por otra parte es importante realizar este anlisis en la evaluacin de agua para riego, ya que un alto contenido de cloruros interfiere con el desarrollo vegetal. As mismo, altas concentraciones de in cloruro en aguas utilizadas en la industria resulta corrosivo para caeras y superficies metlicas. En el mtodo de Mohr el in cloruro, en presencia de AgNO3 precipita como AgCl (precipitado blanco). En la titulacin se utiliza K2CrO4 como indicador, de color amarillo en solucin, que forma con el exceso de titulante, un precipitado color rojo ladrillo. 2.2. Objetivo: Determinar la concentracin de cloruros en una muestra de agua de consumo 2.3. Materiales y Reactivos Bureta Erlenmeyer matraz aforado Solucin de NaCl patrn(para valoracin del AgNO3): Pesar en balanza analtica alrededor de 1,65 g de NaCl p.a. seco y completar a volumen hasta 1L. Calcular su normalidad. La valoracin de la solucin de AgNO3 es realizada

previamente por el docente

Solucin de AgNO36,25mM (previamente valorada) Solucin de K2CrO4 al 5 % p/v en agua destilada

2.4. Procedimiento Medir 100 mL de la muestra de agua. Si el pH es menor de 7, aadir aproximadamente 1 g de NaHCO3. Agregar 1 mL de solucin de K2CrO4 y valorar, agregando de a gotas, versus solucin de AgNO3 hasta coloracin rojiza apenas perceptible. Se resta 0,2 mL al volumen empleado (correccin por blanco).
Escriba las reacciones qumicas que ocurren durante la titulacin

Qu importancia tiene realizar una correccin por blanco

Qu resultados espera encontrar si compara el volumen de valorante gastado

para la determinacin de cloruros en agua mineral, agua de canilla y agua destilada?

2.5. Resultados
Concentracin de cloruros en la muestra expresada en ppm:

3. Determinacin de iones Ca+2 y Mg+2 por volumetra de formacin de complejos 3.1. Introduccin

La dureza en agua est dada principalmente por iones Ca+2 y Mg+2. Existen otros cationes divalentes que pueden contribuir a la dureza (como Sr, Fe, Mn, etc.), aunque se encuentran en muy baja concentracin. La concentracin de iones en el agua y la formacin de sales se debe a la disolucin de minerales del suelo, por ejemplo el calcio, que puede encontrarse como CaCO3 o CaSO4. La cantidad de sales presentes en el agua es un parmetro significativo de la calidad de la misma; afecta la capacidad de formar espumas con jabones y adems genera problemas de formacin de incrustaciones en caeras y equipos industriales y domsticos.Por otra parte promueven la formacin de biofilms La presente volumetra se basa en la propiedad del EDTA de formar complejos estables con cationes divalentes, utilizando el NET como indicador. En este mtodo se determinan conjuntamente los iones Ca+2 y Mg+2. Las reacciones que ocurren durante la titulacin son las siguientes: Ca+2 / Mg+2 + NET NET-Ca / NET-Mg
(azul)

(azul)

NET-Ca / NET-Mg

(rojo)

(rojo)

+EDTA

EDTA-Ca / EDTA-Mg

+ NET

La reaccin se realiza a pH 10. La dureza total se expresa como mg/L de CaCO3 3.2. Objetivo Determinar la dureza en una muestra de agua de consumo 3.3. Materiales y Reactivos Bureta Erlenmeyer matraz aforado

Solucin reguladora pH 10: Se mezclan 35 ml de NH4OH (25% de NH3) con una solucin que contiene 5,4 g de NH4Cl en 50 mL de agua destilada y se completa a 100 mL con agua destilada. Se conserva en heladera.(Esta

solucin es preparada previamente por los docentes).

Solucin del indicador: Disolver 0,4 g de negro de eriocromo T (NET) en 100 mL de alcohol 96 (preferentemente metanol), adicionando suficiente NH4OH para llevar la solucin a un color azul intenso. (Esta solucin es

preparada previamente por los docentes).

Solucin de cido etilndiamino tetra actico (EDTA), sal disdicadihidratado. Disolver 4 g de EDTA en aproximadamente 800 mL de agua destilada, adicionar 1,5 g de NaOH y completar volumen a 1000 mL.

(Esta solucin es preparada previamente por los docentes).

Solucin patrn de CaCO3 (para normalizacin del EDTA): Disolver 1,000 g de la sal en el menor volumen posible de HCl diluido, neutralizar con NH4OH y completar a 1000 mL con agua destilada. Un mL de esta solucin equivale a 1 mg de CaCO3 a 0,40008 mg de Ca.

Explique porqu 1mL de la solucin de EDTA equivale a 1mg de CaCO3

3.4.

Procedimiento

3.4.1. Determinacin del ttulo de la solucin de EDTA: Se miden exactamente 50 mL de la solucin patrn de CaCO3 y se colocan en un erlenmeyer de 250 mL, se agregan 10 mL de solucin reguladora y 4 gotas de NET. Se valora desde bureta con la solucin de EDTA hasta viraje del rojo vinoso al azul neto. El ttulo de la solucin de EDTA se calcula como: 50/ V, donde V es el volumen de titulante gastado(Este paso es realizado por los docentes). 3.4.2. Valoracin de la muestra: Se toman 100 mL de la muestra de agua exactamente medidos y se vierten en un erlenmeyer de 250 mL. Se agrega 1 mL de solucin reguladora NH4Cl-NH3 pH 10 y 4 gotas de NET. Se titula con la solucin de EDTA valorada (para la cual, 1 mL equivale a 1 mg de CaCO3) siempre agitando vigorosamente hasta viraje de la solucin de rojo vinoso a azul neto (sin rastros de coloracin rojiza). Qu tipo de error se comete en esta titulacin?

3.5.

Resultados Calcular dureza expresada como ppm de CaCO3.

4. Determinacin de H2O2 por permanganimetra 4.1. Introduccin El permanganato de potasio, KMnO4 , debido a su alto potencial redox, se utiliza como agente oxidante potente en numerosas aplicaciones volumtricas de oxidorreduccin. La hemirreaccin de reduccin del mismo en medio cido fuerte es la siguiente: 5. MnO4+ 8 H+ + 5 e Mn2+ + 4 H 2O

El cido que se utiliza para dar el medio necesario de reaccin es el sulfrico, ya que el mismo es indiferente al proceso de oxidorreduccin. El peso equivalente del KMnO4 en medio cido fuerte es la quinta parte de su peso molecular. 4.2. Objetivo: Titulacin de una solucin de agua oxigenada comercial con una solucin normalizada de KMnO4 4.3. Materiales y reactivos Bureta Erlenmeyer Matraz aforado Solucin KMnO40,1N:
Indique cuntos gramos de KMnO4 tendr que pesar para preparar 100

mL de esta solucin

4.4. Procedimiento 4.4.1.Normalizacin solucin de KMnO4 El KMnO4 no es patrn primario. Como patrn primario para su normalizacin puede emplearse, entre otros, el oxalato de sodio (C2O4Na2). Pesar exactamente tres muestras de 200-250 mg de C2O4Na2 (la sal debe secarse previamente a 105 C durante 2 h) y colocarlas en sendos erlenmeyers de 250 mL, agregar 100 mL de agua destilada a cada uno de ellos y 10 mL de cido sulfrico 1:5. Agitar hasta disolucin completa del oxalato. Calentar hasta 80 C y agregar gota a gota desde una bureta enrasada con la solucin de KMnO4 a normalizar. Se observar que, al agregar las primeras gotas, el contenido del erlenmeyer permanece rosado y slo luego de unos instantes se decolora. Esto ocurre slo al comienzo y al avanzar en la valoracin la oxidacin ocurre rpidamente. Agitar en forma continua hasta obtener un color rosado tenue persistente por 30 s. La temperatura durante la valoracin no debe ser inferior a 60 C. Reacciones: + 8 H+ + 5 e- Mn2+ + 4 H2O) 25 (C2O4 2 CO2 + 2 e ) ________________________________________________________________ _____ 2 MnO4 + 5 C2O42- + 16 H+ 2 Mn2+ + 8 H2O + 10 CO2 2 Registrar el volumen de solucin de KMnO4 consumido en el punto final y realizar los clculos correspondientes de normalidad. Obtener un promedio de las tres determinaciones. Recordar que la reaccin ocurre equivalente a equivalente, o sea, un equivalente de KMnO4 (PM/5) reacciona con un equivalente de C2O4Na2 (PM/2). Guardar la solucin en frasco color caramelo debidamente etiquetado, en lugar oscuro y fresco. Esta solucin se debe renormalizar cada 30 das. (Este paso es realizado por los docentes). 4.4.2.Valoracin de perxido de hidrgeno comercial (agua oxigenada, H2O2) Se utilizar H2O2 comercial de 10 volmenes (es decir al 3 % p/v). Se realizar una dilucin 1:50 de la misma, usando matraz aforado. Medir con una pipeta de doble aforo una alcuota de 10,00 mL de muestra diluida, transferir a un Erlenmeyer de 250 ml, aadir 100 mL de agua destilada y 5 mL de cido sulfrico 1:5, y titular adicionando desde la bureta la solucin de KMnO4 normalizada hasta aparicin de color rosado persistente durante 30 s. Registrar el volumen de permanganato gastado en la titulacin. (MnO4-

Reacciones: 2 (MnO4+ 8 H+ + 5 e Mn2+ + 4 H2O)

5 ( H2O2 O2 + 2 H+ + 2 e-) ________________________________________________________________ _____ + 2 MnO4 + 5 H 2 O2 + 6 H 2 Mn2+ + 8 H2O + 5 O2

4.5. Resultados
A partir de la estequiometra de la reaccin de titulacin, calcular el %

p/v de agua oxigenada de la muestra.

TRABAJO PRCTICO N 3

Determinacin de pH y Acidez por Titulacin con Punto Final Electromtrico

1. Determinacin de pH en muestras de alimentos 1.1 Introduccin La determinacin del pH es de gran importancia en las industrias de alimentos. El pH de un alimento ser el resultado de los sistemas amortiguadores o buffers naturales que predominen en el mismo. Estos sistemas estn constituidos por mezclas de cidos (o bases) dbiles y sus sales. Los valores de pH determinan la utilizacin y control de microorganismos y enzimas; permiten controlar procesos como la clarificacin y estabilizacin de jugos de frutas y vegetales, como as tambin de productos fermentados derivados de frutas y cereales y la gelificacin en jaleas. Resulta particularmente importante en lo que se refiere a rigurosidad del tratamiento trmico (tiempo y temperatura de procesamiento). En general, la velocidad de destruccin trmica de las bacterias, particularmente las anaerobias formadoras de esporas, se incrementa marcadamente cuando aumenta la concentracin de iones hidronio (el efecto no es tan pronunciado en el caso de hongos y levaduras). Alimentos con valores de pH menores de 4,5 son considerados cidos y con valores mayores, alimentos no cidos. Para estos ltimos la rigurosidad del procesamiento trmico deber ser mayor. Las medidas electromtricas del pH han sustituido en gran medida a otros mtodos, an cuando en normas oficiales an se incluyan mtodos colorimtricos para ciertos alimentos. 1.2. Objetivo: Determinar el pH de una muestra de vinagre y de una bebida cola 1.3. Materiales y reactivos Vaso de precipitado pHmetro: Dejar estabilizar y calibrar pHmetro de acuerdo a las instrucciones del aparato (para la calibracin usar soluciones buffer de pH 7,0 y 4,0 a 20-25 C). Los electrodos deben mantenerse sumergidos en agua destilada mientras no se est utilizando. Lavar cuidadosamente el electrodo, antes y despus de cada medicin, con suficiente agua destilada mediante una piseta y secar el exceso con papel absorbente, sin frotarlo

1.4. Procedimiento Si la muestra a analizar no contiene cantidades apreciables de CO2, la medicin puede realizarse directamente. Para lquidos que contienen CO2 disuelto u ocluido, la muestra se coloca en bao de agua a 40 C y se agita con varilla de vidrio hasta eliminacin del gas. Se deja enfriar a temperatura ambiente y se mide el pH. En otros casos especficos se siguen protocolos estandarizados. Por ej., en la determinacin de pH de alimentos slidos se prepara un homogenato del mismo con una fluidez conveniente, ya sea en mortero o procesador, teniendo la precaucin de no agregar ms de 20 ml de agua, recientemente hervida y enfriada, por cada 100 g de producto. En el caso de semislidos generalmente no es necesario el agregado de agua para lograr una consistencia adecuada de la pasta resultante. Una vez preparada la muestra de acuerdo al procedimiento requerido proceda a realizar la determinacin del pH de la muestra, la que debe estar entre 20 y 25 C Agitar la muestra despus de la lectura y repetirla hasta que dos lecturas coincidan cercanamente. Se comete algn tipo de error al realizar esta determinacin?

1.5. Resultados Usando la constante de disociacin del cido predominante en la

muestra, calcular el pH terico de la misma.

Comparar el valor terico con el obtenido experimentalmente.

2. Determinacin de acidez total titulable 2.1. Introduccin En el procedimiento usual para determinar la concentracin total de cidos, una alcuota de la solucin muestra se titula con una solucin estndar de lcali hasta el punto en el cual ha sido aadida una cantidad equivalente de la base. Este punto final puede detectarse mediante indicadores cido-base (cambio de color) o electromtricamente (pHmetro). Este ltimo mtodo resulta ms conveniente para el caso de muestras coloreadas en las que se dificulta la deteccin de un cambio de color del indicador. As, el punto final de una valoracin cidobase se determina mediante el cambio de pH que se monitorea luego de cada agregado de la solucin titulante con ayuda de un pHmetro. Gram (1950) indic que en una titulacin de este tipo (llamada potenciomtrica) el punto final se encuentra, generalmente, trazando un grfico de E (o pH) en funcin de V (volumen aadido del titulante). Algunas veces, sin embargo, el punto de mxima pendiente no permite determinar con precisin el punto final de la titulacin, por lo que resulta conveniente graficar pH/V en funcin de V para detectarlo claramente. Se pueden distinguir tres formas para determinar el punto final en estos casos, una vez trazada la curva de valoracin: I. Mtodo de las tangentes: se trazan las tangentes a la curva de valoracin (pH vs. V). Su punto de corte coincide con el punto final. II. Mtodo de la primera derivada: se representa la derivada de la curva de valoracin (pH/V) vs. V. El punto final se corresponde con un mximo. II. Mtodo de la segunda derivada: se representa la derivada segunda de la curva de valoracin (2pH /V2) vs. V. El punto final se corresponde con el punto de corte con el eje de abscisas. 2.2. Objetivo Determinar la acidez de una muestra de vinagre y de una bebida cola 2.3. Bureta Matraz aforado Erlenmeyer pHmetro Soluciones de NaOH 0.1N y 0.05N previamente valoradas Materiales y Reactivos

2.4. Procedimiento 2.4.1. Preparacin de la muestra de vinagre: Pipetear 1 ml de vinagre en un vaso de precipitado de 250 ml que contenga 50 ml de agua libre de CO .
2

2.4.2: Preparacin de la muestra de bebida cola: . Se toman 200 ml de la bebida cola y se hierven durante 20 minutos, en un vaso de precipitado tapado con un vidrio de reloj (para eliminar todo el CO2). Una vez enfriado se miden 25,00 ml de muestra y se vierten en un vaso de ppdo., se agregan 25ml de agua destilada libre de CO2 (se debe cubrir el electrodo de vidrio). *. Determinar el pH (el pHmetro debe estar previamente calibrado). *. Agregar mediante bureta 1 ml de solucin estndar de NaOH 0,1 N para la muestra de vinagre y 0.05N para la muestra de bebida cola. Repetir la lectura del pH. *. Continuar agregando volmenes de 1 ml de base y determinar el pH despus de cada adicin. *. Cuando el valor de pH se aproxime a 5 agregar 0,5 ml de la solucin de NaOH en lugar de 1 ml. *. Continuar tomando medidas aproximadamente constantes. de pH hasta que estas sean

*. Para la bebida cola se vuelve a agregar valorante, hasta obtener el segundo salto de pH. Se contina la adicin de unos mililitros ms de NaOH Porqu es necesario realizar un pre tratamiento de la muestra en

el caso de la bebida cola?

A qu se debe que en algunos casos exista un segundo salto en el

pH al continuar con el agregado de la base?

2.5.

Resultados

Trazar las curvas: a) pH vs. V y b) pH/V vs. V. A partir de la curva obtener el volumen necesario para neutralizar la muestra y calcular el porcentaje de acidez (como ctrico, mlico, tartrico o actico segn la muestra). Porcentaje de acidez de vinagre

Porcentaje de acidez de bebida cola

Compare una titulacin cido base con determinacin del punto

final mediante indicador y potenciomtricamente en cuanto a error de titulacin. Explique.

TRABAJO PRCTICO N 4

Anlisis Espectrofotomtrico de la Riboflavina

1. Introduccin La colorimetra es una de las tcnicas empleadas con mayor asiduidad en los laboratorios de anlisis qumico. Esta tcnica suministra informacin cualitativa y cuantitativa sobre sustancias en disolucin. El colormetro es un instrumento diseado para dirigir un haz de luz paralela monocromtica a travs de una muestra lquida y medir la intensidad del haz luminoso emergente. La fraccin de luz incidente absorbida por una solucin a una longitud de onda est relacionada con el paso ptico y con la concentracin de la especie absorbente. Estas dos relaciones estn combinadas en la ley de Lambert-Beer: Log (Io/I) = c l donde Io e I son las intensidades de la luz incidente y emergente, respectivamente, l el paso ptico de la muestra absorbente (cm), c la concentracin de la especie absorbente (moles/litro) y el coeficiente de absorcin molar (M-1 cm-1). La expresin log (Io/I) se denomina absorbancia y se designa por A (siendo adimensional). Fijando el paso ptico (habitualmente 1 cm), resulta que la absorbancia A es directamente proporcional a la concentracin del soluto absorbente. El coeficiente de absorcin molar vara con la naturaleza del compuesto absorbente, el disolvente, la longitud de onda y tambin con el pH. La aplicacin obvia de la ley de Lambert-Beer es el uso del colormetro para determinar la concentracin de una gran variedad de molculas que absorben luz (ej. carotenos, clorofila, hemoglobina, etc.). La tcnica se extiende a sustancias no coloreadas como azcares o aminocidos despus de alguna reaccin capaz de convertir sustancias incoloras en derivados coloreados. Los espectros de absorcin, grficos que relacionan absorbancia con longitudes de onda, son frecuentemente utilizados para la caracterizacin e identificacin de molculas. En esta prctica se realizar un sencillo anlisis espectrofotomtrico de la fenolftalena consistente en la obtencin del espectro de absorcin y construccin de una curva patrn para verificar la ley de Lambert-Beer, clculo del coeficiente y determinacin de la concentracin de una muestra del indicador cido-base de concentracin desconocida.

2. Objetivo Determinar la concentracin de riboflavina en una muestra problema mediante una tcnica espectrofotomtrica 3. Materiales y Reactivos Balanza analtica Espectrofotmetro Matraces aforados Pipetas Buffer fosfato pH 7: Solucin A (NaH2PO4 0,2 M): disolver 27.6 g de NaH2PO4 . H2O en agua destilada, completando un litro. Solucin B (Na2HPO4 0,2 M): 53.65 g de Na2HPO4. 7 H2O se disuelven en agua destilada, llevando el volumen final a 1 litro Para pH 7,2 tomar 140 mL de solucin, 360 mL de solucin B y llevar a volumen con agua destilada en matraz aforado de 500 mL. (Este paso es

realizado previamente por los docentes)

Solucin madre de riboflavina0,1mM: Se pesan exactamente 5 mg de estndar de riboflavina y se disuelven en 250 mL de buffer fosfato en matraz aforado. (Este paso es realizado previamente por los docentes) Solucin de trabajo de riboflavina: Tomar 5 mL de la solucin madre de riboflavina y llevar a volumen con buffer fosfato pH7 en matraz aforado de 10 mL.

4. Procedimiento 4.1. Obtencin del espectro de absorcin:

Tome cualquiera de las diluciones preparadas como se indica ms abajo y mida la absorbancia en el espectrofotmetro desde 400 y 500 nm cada 10 nm. Complete la siguiente tabla:

Grafique, analice el espectro y determine la longitud de onda () adecuada para la continuacin del trabajo prctico.

 Ttulo del grfico:

Cul es el objetivo de determinar la longitud adecuada para las mediciones de absorbancia?

4.2.

Curva de calibracin:

A partir de la solucin de trabajo realizar 4 diluciones seriadas 1:1, para obtener las distintas soluciones curva de calibracin. Lea en espectrofotmetro a la longitud de onda elegida frente a blanco de reactivos. En qu consiste el blanco de reactivos?

 Complete la siguiente tabla:

Conc

Grafique absorbancia vs. Concentracin (recuerde que la recta

obtenida debe pasar por el origen). Calcule .

Relacione la ecuacin de la recta obtenida con la Ley de Lambert

y Beer

5. Resultados Longitud de onda adecuada para medicin de riboflavina en las

condiciones del presente trabajo

Ecuacin de la recta de calibracin obtenida y coeficiente de correlacin lineal. Valor de .

Concentracin de las soluciones problema:

TRABAJO PRCTICO N 5

Validacin de Mtodos Analticos

1. Introduccin: La validacin de un mtodo es el procedimiento por medio del cual se definen los requerimientos analticos y se confirma que el mtodo en consideracin cumple las condiciones de necesarias. Esto implica que es necesario evaluar esas caractersticas de performance de los mtodos utilizados. Queda sobreentendido que el equipamiento utilizado en la validacin se encuentra adecuadamente calibrado y funcionando correctamente dentro de las especificaciones. Adems, el personal que lleva a cabo estos estudios debe ser experimentado y competente, tener suficiente conocimiento sobre la tcnica en custin para poder tomar decisiones acertadas a medida que avanza el estudio.. Los parmetros mpas importantes qe se evalan durante elporceso de validacin son: Selectividad Exactitud Precisin: repetibilidad, precisin intermedia, reproducibilidad Incertidumbre Robustez Recuperacin Linealidad Sensibilidad: lmite de deteccin, lmite de cuantificacin La definicin de cada uno de estos parmetros se encuentra en el anexo I de esta gua. Una vez que se est trabajando con un mtodo validado es necesario demostrar que en todo momento el mismo cumple con los criterios de aceptacin previamente definidos. Para ello deben utilizarse muestras cuyos resultados sean conocidos y efectuar controles de calidad programados. 2. Objetivo: El objetivo del presente trabajo es definir rango lineal, lmite de cuantificacin, lmite de deteccin, repetibilidad y precisin intermedia para el mtodo de determinacin de concentracin de riboflavina en un preparado farmacutico mediante espectrofotometra UV-VIS. 3. Materiales y reactivos: Espectrofotmetro, cubetas, matraces aforados, pipetas, riboflavina (estndar analtico), buffer fosfato pH 7,2.

4. Procedimiento: 4.1. 4.2. A partir de la formulacin farmacutica de riboflavina preparar una solucin de concentracin conocida utilizando buffer fosfato pH 7,2 como disolvente. Mida la absorbancia frente al blanco de reactivos y determine la concentracin de riboflavina por mtodo de calibracin por estndar externo, utilizando la curva de calibracin construida en el TP N4. Nota: Si el valor de A quedara fuera del rango de calibracin realice las diluciones que considere necesarias. Realice la dilucin adecuada para la medicin por triplicado y vuelva a calcular la concentracin en cada caso. Complete la siguiente tabla: A. Conc.

4.3.

Promedio 4.4. Realice 2 diluciones a partir de la concentracin ms baja de la curva para determinar el lmite de deteccin del mtodo.

5. Resultados 5.1.
Utilizando la curva de calibracin construida en el TP N4 defina: Rango lineal

Lmite de cuantificacin

5.2.

A partir de los resultados obtenidos en el punto 4.4. defina: Lmite de deteccin:

5.3.

A partir del coeficiente de variacin para las concentraciones obtenidas en el punto 4.3. calcule: Repetibilidad del ensayo

5.4.

A partir de los resultados obtenidos por sus compaeros calcule:

Precisin intermedia del ensayo

6. Trabajar con datos obtenidos en el laboratorio Determinacin de AMOZ en muestras de miel Curva de calibracin: Conc. (ppb) rea Std 0,30 173557,37 186196,92 179886,20 182961,29 0,50 315995,53 353371,00 334298,02 349987,08 1,00 667266,15 680226,50 677888,56 670480,87 2,00 1393628,10 1485828,86 1457862,76 1436789,86 4,00 2782279,86 2715016,46 2748953,34 2760009,08 rea IS 629525,14 695083,48 688242,18 639534,47 710781,76 692874,75 738065,60 741072,98 695710,62 659793,69 666832,12 680075,55 700766,59 708229,42 699774,03 710034,56 732781,38 703859,57 728576,87 719746,87

Controles de Calidad 0,30 155326,05 499963,67 158062,05 472721,40 128375,45 430258,52 138242,47 433423,78 0,50 228914,42 462690,25 230428,47 460001,99 237199,43 459782,40 239007,88 476551,88 4,00 1889620,99 446152,00 1906549,48 460373,73 1903297,79 448856,89 1805828,40 438934,39

A partir de los resultados obtenidos para la curva de calibracin calcular: a. Linealidad y ecuacin de la recta b. Rango lineal c. Lmite de cuantificacin 6.2. A partir de los resultados obtenidos para las muestras preparadas como control de calidad calcular: 6.2.a. Repetibilidad para las concentraciones de 0,3 y 4 ppb. Expresar el resultado como porcentaje de variacin % 6.2.b. Exactitud para las concentraciones de 0,3 y 4 ppb. Expresar el resultado como error relativo % 6.2.c. Porcentaje de recuperacin para las concentraciones de 0,3 y 4 ppb 6.3. 6.4. Explique cmo se preparan las muestras que se utilizarn como controles de calidad Explique qu ensayo debera hacer para conocer la reproducibilidad del mtodo. En qu momento de la validacin considera que debe realizarse este paso? Adems de los parmetros de validacin del mtodo, qu debe definirse para determinar si el mismo podr cumplir con el propsito para el cual fue desarrollado?

6.1.

6.5.

TRABAJO PRCTICO N 6

Espectrofotometra de Absorcin Atmica

1. Introduccin La espectrofotometra atmica incluye una serie de tcnicas analticas utilizadas principalmente para la determinacin cuantitativa de un elemento metlico presente en una muestra. En la prctica, se introduce una muestra lquida en forma de un fino roco dentro de una llama en donde se producen una serie de reacciones que finalmente conducen a la formacin de tomos del elemento metlico de inters en estado gaseoso, los que pueden absorber, emitir o fluorescer a longitudes de onda caractersticas. As, la espectrofotometra de llama puede ser de absorcin, de emisin, o de fluorescencia atmica, respectivamente. La espectrofotometra de absorcin atmica es el mtodo de preferencia para el anlisis especfico de elementos metlicos hasta en el nivel de trazas. En ste, una fuente, que emite luz en una estrecha banda de longitudes de onda, es utilizada para excitar los tomos libres formados en la llama. Luego, se mide el descenso de la energa de la radiacin incidente provocado por la absorcin, el que ser proporcional a la concentracin de tomos del elemento presente, de acuerdo a la ley de Lambert y Beer. 2. Objetivo: Determinar la concentracin de Ca, Mg, Cu y Zn en muestras de agua mineral, de red y alimento. 3. Materiales y reactivos Balanza analtica,espectrofotmetro de absorcin atmica, bao trmico, estufa, centrfuga, campana de extraccin, tubos de ensayo, matraces aforados, pipetas, soluciones estndar de Mg, Ca, Cu y Zn, solucin de LaCl3 0.2 %, cido ntrico concentrado. 4. Procedimiento 4.1. Muestras de alimento
NOTA: Debido al tiempo que requiere el procesamiento de las muestras, el mismo es realizado previamente por los docentes.

Se pesan aproximadamente 100 g de alimento y se secan en estufa a 60 C, hasta obtener peso constante (aproximadamente 3 das). Se muele la totalidad de la muestra.

Se pesan exactamente 50 mg de la muestra molida y se colocan dentro de tubos de ensayo a los que se les agregan 0,5 mL de cido ntrico concentrado (trabajando bajo campana) para producir la digestin hmeda de la materia orgnica. Por qu se indica moler la totalidad de la muestra seca, si

luego slo se utilizan 50 mg de la misma para realizar el anlisis?

Para la digestin completa de la materia orgnica, las muestras en contacto con el cido ntrico se dejan durante 6 horas a temperatura ambiente y luego otras 6 horas sobre una placa calefactora a 60 C (siempre bajo campana) Por qu debe eliminarse la materia orgnica de la

muestra?

Qu otro tipo de tratamiento previo podra aplicarse en

lugar de la digestin hmeda empleada en este prctico?

Una vez terminado el proceso de digestin se realizan las siguientes diluciones: Se lleva a 5mL con agua bidestilada y se centrifuga a 3500 rpm durante 20 minutos 4.1.1. Muestras para determinacin de macro elementos (Mg, Ca): Se toman 0.02mL del sobrenadante y se agregan 1.98 mL de LaCl3 0.2% 4.1.2. Muestras para determinacin de micro elementos (Zn, Cu):

Se toman 0.2 mL del sobrenadante y se le agregan 1.8 mL de agua bidestilada Cul es la funcin de la solucin de LaCl3?

Por ltimo, en caso de ser necesario, debe realizarse una dilucin tal que la concentracin de de los minerales que se va medir se encuentre dentro del rango de trabajo del equipo. Antes de realizar las determinaciones de los diferentes elementos presentes en las muestras, es necesario obtener una curva de calibracin para cada uno de los mismos. El rango lineal, que se establece para cada elemento, se encuentra en las especificaciones tcnicas del equipo. Para los elementos que se analizan en el TP son: Ca: 1 a 4 g/mL Mg: 0.1 a 0.4 g/mL Cu: 1 a 5 g/mL Zn: 0.4 a 1.5 g/mL Debe prepararse un blanco de reactivos para cada una de las curvas obtenidas En qu consiste el blanco de reactivos en cada caso?

Medir la concentracin de Mg, Ca, espectrofotmetro de absorcin atmica. 4.2 Muestras de agua

Cu

Zn

utilizando

un

Para analizar muestras de agua no hace falta realizar un procesamiento previo, sino que directamente se realizan las diluciones, de tal manera que las concentraciones a medir se encuentren dentro del rango de trabajo del equipo

5.2.1.

Para el anlisis de macro elementos, la dilucin se realiza directamente con LaCl3 0.2%.

Ca: Se toman 0.04 mL de agua (muestra) y se lleva a 2mL con LaCl3 0.2% Mg: Se toman 0.08 mL de agua (muestra) y se lleva a 2mL con LaCl3 0.2% 5.2.2. Para el anlisis de micro elementos no es necesario realizar una dilucin ya que se encuentran en muy baja concentracin. Qu se modifica en el equipo utilizado a la hora de pasar de la

determinacin de un elemento a otro?

5. Resultados Los valores proporcionados por el equipo corresponden a concentraciones de la solucin final (que es la que se est utilizando en la determinacin). Para conocer la concentracin de los minerales en las muestras analizadas deben tenerse en cuenta las diluciones realizadas y los pesos (o volmenes) empleados de las mismas. Las cantidades de Ca y Mg se expresan como % p/p de materia seca. Las cantidades de Cu y Zn se expresan en ppm (base seca) Concentracin de Macroelementos en alimento

Concentracin de microelementos en alimento

Concentracin de macroelementos en agua

 Concentracin de microelementos en agua

Escriba la ecuacin de la recta obtenida en cada caso

TRABAJO PRCTICO N 7

Cromatografa en Capa Delgada

1. Introduccin: La cromatografa en capa delgada es una tcnica sencilla, sensible, eficiente y de bajo costo. Se utiliza tanto para determinar la cantidad de componentes de una mezcla como para identificar y cuantificar los compuestos presentes en la misma. En este tipo de cromatografa, un adsorbente se encuentra depositado formando una fina capa sobre un soporte que puede ser vidrio, aluminio, etc. Los adsorbentes ms comnmente utilizados son: Slica gel xido de aluminio o almina Celulosa Poliamidas

En uno de los extremos de la capa de adsorbente es depositado un volumen determinado de la muestra. Luego la placa es colocada dentro de una cuba de cromatografa, que contiene el solvente de elucin con el que se va a desarrollar la corrida. Es importante que la atmsfera dentro de la cuba se encuentre saturada con dicho solvente.
Qu ocurrira si la cuba no estuviese saturada en el solvente de corrida?

Los solventes ms comnmente utilizados son: Dietilter Hexano Diclorometano Acetona Isopropanol Metanol Etc.

El solvente asciende por capilaridad a lo largo de la placa arrastrando los componentes de la mezcla que se van a separar segn el grado de afinidad que tengan por la fase mvil y por la fase estacionaria. Si los

compuestos son coloreados se observan directamente, de lo contrario deben revelarse con ayuda de un indicador. Los reveladores ms comunes son UV Vapores de yodo Rociar con H2SO4 al 50% y luego calentar

Qu tipo de reveladores son los vapores de yodo y el cido

sulfrico, y cmo operan?

Concepto de Relacin de Frente (Rf):

Siendo: Rx: Distancia que recorre el analito de inters desde el punto de siembra Rs: Distancia que recorre el solvente Los valores de Rf se utilizan para la identificacin de un analito, cuando el mismo coincide con el Rf de un estndar conocido. El valor de Rf se encuentra altamente influenciado por las condiciones en las cuales se realiza la corrida, es por ello que es imposible elaborar tablas con estos valores. Los factores que afectan el valor de Rf en mayor medida son Temperatura Saturacin de la cuba Limpieza de las placas Homogeneidad de la fase estacionaria Pureza de los solventes

2. Objetivo 2.1. Detectar la presencia de un xenobitico presente en una muestra vegetal mediante cromatografa en capa delgada 2.2. Separar distintos pigmentos de la muestra y determinar su relacin de frente en los sistemas en estudio 2.3. Sacar conclusiones en cuanto a la polaridad relativa de los componentes separados segn la relacin de frente obtenida para los distintos solventes.

3. Materiales y reactivos Placas de slica, extracto vegetal seco, solucin patrn de xenobitico, capilares calibrados para siembra, lmpara UV, cubas para TLC, solventes de elucin (etanol; acetona, hexano). 4. Procedimiento 4.1. En cada una de las placas proporcionadas sembrar en el centro (sobre la lnea de siembra) 4 L de muestra (extracto de festuca). A su lado sembrar 2 L de solucin estndar del xenobitico en estudio. 4.2. Colocar cada una de las placas en una cuba conteniendo un solvente de corrida diferente, que adems se ha mantenido cerrada por 30 minutos para asegurar que la atmsfera dentro de la cuba se halla saturada en este solvente (esto puede acelerarse colocando un papel absorbente, como papel del filtro, cubriendo la mitad de la pared interna de la cuba). 4.3. Observar el desarrollo del cromatograma, y retirar la placa cuando el frente del solvente haya avanzado aproximadamente 7 cm. Secar con aire caliente. La cromatografa que se est realizando es de fase normal o

reversa?

Porqu es adecuada para este tipo de solutos?

5. Resultados 5.1.

Identificar el xenobitico en estudio, determinar si el mismo est compuesto por una sustancia pura.

5.2.

Individualizar distintos componentes de la muestra y determinar el Rf para cada uno segn las distintas condiciones de corrida.

5.3.

Determinar la polaridad relativa de las sustancias que se observan luego de la corrida cromatogrfica.

5.4.

Qu tipo de mtodo cuantitativo podra aplicarse en este prctico? Cmo podra proceder para realizar una cuantificacin ms exacta de los solutos?

TRABAJO PRCTICO N 8

Cromatografa Lquida de Alta Performance y Cromatografa de Gases

1. Introduccin: Si bien existen algunos compuestos que pueden analizarse tanto por cromatografa de gases como por hplc, las caractersticas de los analitos van a determinar en cierta medida cul ser la tcnica ms adecuada para su deteccin y/o cuantificacin. Las diferencias ms importantes que presentan ambas tcnicas se resumen en la siguiente tabla: HPLC Fase mvil Lquido Necesidad de bombas Muestra lquida Pueden analizarse compuestos termolbiles, no voltiles y de alto PM GC Gas Necesidad de alta temperatura Muestra lquida o gaseosa Los compuestos que se analizan deben ser termoestables, voltiles (o volatilizables) y de bajo PM (hasta 1000) Columnas entre 10 y 100 mts de largo Mayora capilares (dimetro interno menor a 1mm) Fase estacionaria generalmente lquida FID, ECD, CT, etc. Para volatilizar los analitos Para permitir/mejorar la separacin

Inyeccin

Separacin

Columnas hasta 25 cm de largo Dimetro interno mnimo 2.1 mm Fase estacionaria slida UV-Vis, arreglo de diodos, ndice de refraccin, etc Para permitir/mejorar la deteccin

Deteccin Derivatizacin

Cuando se trabaja con estas tcnicas cromatogrficas, altamente sensibles, es importante el desarrollo de una metodologa de limpieza y extraccin de los analitos que se quieren identificar, de lo contrario, se obtendrn interferencias que no permitirn su correcta deteccin y/o cuantificacin. De esta manera, los pasos previos a la inyeccin de la muestra son cruciales en toda determinacin.

2. Objetivo 2.1. Conocer los componentes de los sistemas cromatogrficos descriptos 2.2. Poder predecir los cambios en los tiempos de retencin que ocurrirn al variar algunas condiciones de la corrida, como la proporcin de solventes en HPLC o la temperatura en GC 3. Materiales y reactivos El presente trabajo prctico es demostrativo por lo tanto se utilizarn cromatogramas previamente obtenidos 4. Procedimiento Se llevar a cabo el anlisis de metabolitos derivados de zearalenona por HPLC-UV y una mezcla de cidos grasos voltiles por GC-FID Las muestras ya se encuentran procesadas y se analizarn los resultados obtenidos utilizando distintos sistemas HPLC y GC En el sistema HPLC-UV se inyect una mezcla de zearalenona y metabolitos derivados, (-Zearalanol y -zearalenol), en modo isocrtico con distintas proporciones de acetonitrilo:agua como fase mvil. En el sistema GC-FID se inyect una mezcla de cidos grasos voltiles (de C2 a C7) con distintas condiciones de temperatura Qu condiciones deben cumplir los solventes utilizados para

HPLC?

Qu condiciones deben cumplir los gases utilizados en GC?

 Cmo influye la temperatura en HPLC?

Cmo debe ser la temperatura del inyector y del detector

(FID) con respecto a la de la columna en GC?

5. Resultados 5.1 En funcin de los cromatogramas obtenidos para el sistema HPLC analizar cmo modificara la proporcin de los solventes en la fase mvil para mejorar la separacin. Cmo espera que se modifique el cromatograma obtenido

si se aumenta la proporcin de solvente orgnico?

Qu otra modificacin podra mejorar los resultados?

En qu circunstancias realizara un gradiente?

5.2.

En funcin de los resultados obtenidos pensar cmo modificara la temperatura de la corrida para mejorar la separacin. Comprobar los resultados obtenidos con distintas rampas de temperatura Son coherentes los resultados obtenidos con los esperados?

Porqu?

Qu otra modificacin que podra mejorar los resultados

obtenidos?

Porqu es en este caso es estrictamente necesaria la

utilizacin de una rampa de temperatura?