Ekstraksi Senyawa Dalam Sampel Biologis (Deproteinisasi, Kolom Solid Phase Ekstraksion)

NAMA: 1. ALI RAFIQ 2. FAUZIA NUR LENY 3. DESRY ALFAHRYAN 4. MAGVIRAH 5. REZEKILAH 6. VINNY SWP

Pengertian Deproteinisasi

Deproteinasi adalah proses pemisahan protein Fungsi Deproteinisasi pada Analisis Klinik adalah untuk mendapatkan sampel yang bebas dari protein (pengotor) yang dapat mempengaruhi dalam menganalisis suatu sampel.

Solid Phase Extraction (SPE)

Solid Phase Extraction atau Ekstraksi Fase Padat adalah ekstraksi kolom yang berbasis kromatografi. Teknik SPE digunakan untuk pra-perlakuan sampel atau clean-up sampel-sampel yang kotor seperti sampel dengan kandungan matriks yang tinggi seperti garamgaram, protein, polimer, resin.

Prinsip Kerja Analisis Metode SPE

Penetapan kadar senyawa asam, netral dan basa yang diekstraksi dari cairan biologis dengan SPE kolom C8-kation exchange dan dideteksi dengan menggunakan GC-NPD

Diagram skematik prosedur SPE sebagai berikut :

Tahapan Solid Phase Extraction

Pengkondisian Kolom (cartridge) dialiri dengan pelarut sampel untuk mencapai nilai pH yang sama. Retensi (tertahannya) sampel Larutan sampel dilewatkan dalam cartridge baik untuk menahan analit dan mengelusi komponen yang tidak diharapkan , atau sebaliknya. Pembilasan Menghilangkan seluruh komponen yang tidak tertahan oleh penjerap selama tahap retensi. Elusi Mengambil analit yang dikehendaki jika analit tersebut tertahan pada penjerap.

Tinjauan Senyawa Kimia Senyawa Target

Senyawa Target: Senyawa asam, netral dan basa. Senyawa Pengotor: - Dalam darah : Protein, metabolit dan sel darah

- Dalam urin : Metabolit

Medium : Cairan biologis (darah dan urin)

Contoh Senyawa Asam, Netral Dan Basa

Senyawa Asam: phenobarbital, fenitoin dan internal standar (alobarbital). Senyawa Basa: morfin, MDMA, kokain, diazepam, lidokain dan internal standar (nalorphine, trihexylamine dan prazepam).

Pengkodisian kolom - 2 ml metanol - 2 ml buffer fosfat pH 6 Pemasukan sampel Dibiarkan selama 2 menit agar sampel meresap ke dalam kolom

Pengelusian analit

SPE Senyawa Asam

- 1 mL 0.1M bufer fosfat (pH 6)/metanol (80:20), lalu dikeringkan dengan vakum selama 5 menit, laju alir 1.5 mL/min - 1 mL 1M asam asetat, lalu dikeringkan dengan vakum selama 2 menit, laju alir 1.5 mL/min - 1 mL n-hexana, lalu dikeringkan dengan vakum selama 2 menit, laju alir 1.5 mL/min Pencucian

kolom dielusi dengan menggunakan 4 ml metilenklorida

Eluat diuapkan pada suhu kamar dengan bantuan gas nitrogen

Pengkodisian Kolom
2 ml metanol 2 ml air

Pemasukan Sampel
Dibiarkan selama 2 menit agar sampel meresap ke dalam kolom

Pencucian
2 ml air, laju alir 2 mL/min 2 ml buffer asetat pH 4, laju alir 1 mL/min

Pengelusian Analit Tahap 1 Eluet

(Benzodiazepin)

Kolom dielusi dengan menggunakan 2 ml asetonitril, eluat ditampung, kolom dibiarkan mengering dengan vakum selama 2 menit.

Pengelusian Analit Tahap 2

Kolom dielusi kembali dengan menggunakan 4 ml kloroform yang dijenuhkan dengan ammonia: isopropanol (80:20) (2%)

Eluat (Senyawa Basa lainnya)

Ditambahkan dengan 0,1 mL methanol yang diasamkan (0,1 mL HCl dalam 100 mL methanol) kemudian di uapkan pada suhu kamar

Keuntungan & Kerugian SPE

Keuntungan Proses ekstraksi lebih sempurna Pemisahan analit dari pengganggu yang mungkin ada menjadi lebih efisien Mengurangi pelarut organik yang digunakan Fraksi analit yang diperoleh lebih mudah dikumpulkan Mampu menghilangkan partikulat Lebih mudah diotomatisasi Kerugian Produsibilitas hasil bervariasi Adanya adsorbsi yang bolak-balik pada cartridge

Contoh

Analisis senyawa phenobarbital (asam) dan morfin (basa)

Phenobarbital
a. b. c.

pKa

: 7,4

Kelarutan : larut dalam 1000 bagian air, 8 bagian etanol, 40 bagian kloroform, 13 bagian eter dan 700 bagian benzena Jarak lebur : 174-178o C pKa : 8 dan 9,9

Morfin
a. b.

Kelarutan : 1 bagian larut dalam 1,75 bagian air, dalam 100 bagian etanol, sangat mudah larut dalam campuran kloroform isopropanol daan praktis tidak larut dalam eter Jarak lebur : 254-256oC

c.

Sekian & Terimakasih