ANLISIS DE VITAMINAS EN ALIMENTOS

ANLISIS DE VITAMINAS EN ALIMENTOS

1. 2. 3. 4. 5. Introduccin. Toma de muestra para el anlisis de vitaminas Procedimientos de extraccin de las vitaminas Mtodos de cuantificacin de vitaminas Ejemplos

1. Introduccin.

Compuestos de (relativamente) bajo peso molecular que el ser humano requiere en pequeas cantidades para el funcionamiento normal del metabolismo

VITAMINAS
CLASIFICACIN: - Liposolubles - Hidrosolubles INTERS DE SU ANLISIS: - Caracterizacin de la composicin de los alimentos -Valoracin del poder nutritivo del alimento. -Alimentos enriquecidos - Estimacin de prdidas nutricionales en un p g de un p producto a lo largo proceso industrial - Control del fraudes, comprobacin etiquetas..

-Papel esencial y especfico en el metabolismo -No pueden ser sintetizadas por el organismo. -Su deficiencia provoca enfermedades

CONTENIDO EN LOS ALIMENTOS: - Frutas : Vara segn el zumo<pulpa<piel - Carne: depende de la parte (msculo, grasa, vsceras...) - Cereales: contenido - Lcteos: en general por tratamientos.

CLASIFICACIN DE LAS VITAMINAS en funcin de su comportamiento fsico:

VITAMINAS LIPOSOLUBLES (A,D,E,K) Se consumen junto con alimentos que contienen grasa. Se disuelven en compuestos apolares (grasas, aceites, solventes) Se almacenan en el hgado y en los tejidos grasos (no es necesario tomarlas todos los das). Txicas si se consumen en exceso. VITAMINAS HIDROSOLUBLES (B1,B2,B3,B5,B6,B12,Biotina,C,Flico) Se disuelven en agua (pueden pasar al agua del lavado o de la coccin de los alimentos) Son coenzimas o precursores de coenzimas necesarias para reacciones qumicas del metabolismo. No se almacenan en el organismo (necesario el aporte regular) No son txicas porque se excretan por la orina.

VITAMINAS LIPOSOLUBLES

(retinol)

(tocoferol)

VITAMINAS HIDROSOLUBLES

VITAMINAS HIDROSOLUBLES

de protenas, hidratos de carbono y grasas

VITAMINAS HIDROSOLUBLES

(B9)

CARACTERIZACIN ALIMENTOS TABLAS DE COMPOSICIN

USDA (Depto Agricultura USA) http://www.nal.usda.gov/fnic/foodcomp/search/

Ej: j Composicicn p Manzana http://ndb.nal.usda.gov/ndb/foods/show/2141?fg=Fruits+and+Fruit +Juices&man=&lfacet=&format=&count=&max=25&offset=&sort=&qlo okup=

ETIQUETAS. VALORACIN DEL PODER NUTRITIVO

B3

2. Toma de muestra

TOMA DE MUESTRA
DEPENDENCIA DEL TIPO DE ENSAYO
PUNTOS DE VISTA TECNOLGICO Y LEGAL: -Plan de Muestreo Normalizado -Muestra representativa -Precauciones: labilidad

PROCEDIMIENTO
- Separacin de la parte no comestible - Trituracin de muestra (picadora mecnica...) T !!! - Toma de sub-muestra (~500 g) - Homogeneizacin de la sub-muestra - Almacenamiento en frascos de plstico (-20C) (Vit. C no se almacena)

3. Procedimientos de extraccin

EXTRACCIN:

especfica para cada vitamina

VITAMINAS LIPOSOLUBLES VITAMINAS HIDROSOLUBLES VITAMINA C RESTO DE VITAMINAS HIDROSOLUBLES

ANLISIS
CUANTIFICACIN

EXTRACCIN DE VITAMINAS LIPOSOLUBLES Procedimiento general Adecuado para todo tipo de alimentos
MODIFICACIONES

Saponificacin con NaOH (elim. de lpidos)

Embudo de decantacin

MTODOS QUMICOS Neutralizacin con HCl

Extraccin del insaponificable con ter de petrleo n-hexano Fase orgnica Concentracin Cuantificacin Fase acuosa

Adicin de antioxidantes para inhibir la oxidacin Vit. E y D Uso de KOH etanlica para saponificar Vit. A Empleo de ter etlico en lugar de ter de petrleo

Rotavapor

EXTRACCIN DE VITAMINAS HIDROSOLUBLES Procedimiento general (excepto vit.C) Adecuado para todo tipo de alimentos Romper estructuras celulares: Tratamiento con HCl (30 min/100C)

MTODOS QUMICOS Ajustar pH a 4.5

Hidrlisis con enzimas (amilasa, takadiastasa) para eliminar macromolculas y liberar la vitamina de sus formas fosforiladas (12 h/37 C) C) Filtrar y diluir con H2O Cuantificacin

EXTRACCIN DEL CIDO ASCRBICO

(VIT HIDROSOLUBLE)

Muestra de alimento Molienda (10 20g) Tamizado (Malla 40 mesh) Extraccin de la vitamina C con cido metafosfrico (4-6%): agitacin a 25C Centrifugacin (10 min/4000 r.p.m.) Dilucin del sobrenadante con cido perclrico (0.005M) Filtracin Determinacin por HPLC

4. Mtodos analticos de cuantificacin

MTODOS ANALTICOS
- BIOLGICOS: BIOENSAYOS miden la cantidad de nutrientes aprovechables por un animal (mtodos de referencia p para la determinacin de vit. B12 Y D) - MICROBIOLGICOS se sigue el crecimiento de microorganismos como una funcin de la concentracin de ciertas vitaminas (Slo hidrosolubles) - FISICOQUMICOS miden la cantidad total presente en una muestra: CROMATOGRAFA, ESPECTROFOTOMETRA FLUOROMTRIA, ESPECTROFOTOMETRA, FLUOROMTRIA METODOS ENZIMTICOS

10

MTODOS BIOLGICOS O BIOENSAYOS

-Requieren mucho tiempo -Su uso se limita a casos en los que no hay mtodos alternativos de anlisis o cuando se requiere informacin sobre el valor biolgico o la biodisponibilidad de la vitamina. -Tienen la ventaja de que no se requiere la etapa de extraccin

1. Seleccin de diferentes grupos de animales 1 raza 2. Aplicacin de sustancias que queremos estudiar (a unos animales s y a otros no) 3. Aplicacin de dosis con contenido creciente 4. Observacin del efecto final Glbulos rojos Msculos 5. Curva estndar de respuesta

MTODOS MICROBIOLGICOS
(vitaminas hidrosolubles) -Son mtodos muy sensibles y especficos para cada vitamina. -Requieren tiempo de incubacin y seguir estrictamente el protocolo analtico. Principio: el crecimiento de un determinado microorganismo es proporcional a su requerimiento de una vitamina especfica Comparar el crecimiento del microorganismo en la muestra y en cantidades conocidas de vitamina. El crecimiento del microorganismo se mide en trminos de turbidez, produccin de cido, gravimetra

Piridoxal

piridoxamina

poridoxina

El mtodo se basa en medir la turbidez producida por el crecimiento de microorganismos (saccharomyces carlsbergensis, uvarum) cuando se inoculan en un medio que contiene vitaminas. La turbidez del medio producida por los microorganismos es proporcional a la concentracin de vitamina B6 o B12 presente.

B6

B12

11

MTODOS FISICOQUMICOS
-Son ms simples, exactos y precisos (sobre todo los mtodos cromatogrficos). - Aplicables para la cuantificacin de la mayora de vitaminas y gran variedad de matrices biolgicas (pequeas adaptaciones) - Se requiere etapa previa de extraccin

- Clsicos: volumetra - Instrumentales: Espectrofotometra Fluorimetra Cromatografa - GC - HPLC Polarigrafa

12

MTODOS FISICOQUMICOS
Vitamina liposoluble A (retinol) y carotenoides D2, D3 y sus metabolitos E(tocoferol) ( f ) Mtodo ms utilizado Espectrofotometra (450 nm) HPLC HPLC GC Espectrofotometra p f HPLC GC Espectrofotometra (585 nm)

MTODOS FISICOQUMICOS
Vitamina hidrosoluble B1 Riboflavina metabolitos E(tocoferol) PP B6 B12 C Mtodo ms utilizado Espectrofotometra Fluorimetra HPLC HPLC GC Fluorimetra HPLC HPLC Espectrofotometra(325 nm) HPLC HPLC Volumetra Espectrofotometra

13

ESPECTROFOTOMETRA
DATOS ESPECTRALES DE ABSORCIN EN EL UV-VISIBLE A - GRFICAS DE ABSORBANCIA log vs

- LEY DE LAMBERT-BEER: * LAMBERT: A c * BEER: A l A = log Po/P = c l

Procedimiento
1. Establecer condiciones de trabajo 2. Preparar curva de calibracin que relacione A con C: 3. Medir muestra e interpolar.

A C

14

FLUORIMETRA

Mtodo luminiscente molecular: Las molculas de analito se excitan para dar una especie cuyo espectro de emisin va a dar informacin para realizar un anlisis cualitativo y cuantitativo. Ventajas: * Sensibilidad (lmites de deteccin de partes por billn) * Selectividad * Gran intervalo lineal de concentraciones Desventajas: * Es limitado el nmero de sistemas que presentan luminiscencia

RELACIN ENTRE INTENSIDAD DE FLUORESCENCIA Y CONCENTRACIN

15

POLAROGRAFA
Permite determinar la cantidad y el tipo de sustancias electroqumicamente activas durante una reaccin de oxidacin o reduccin en funcin del comportamiento tensin-corriente de un electrodo polarizable.

16

I(A)

patrones Muestra

Altura del pico

E(V)

patrones

CROMATOGRAFA

17

En Cromatografa:
- Componentes que se desean separar deben ser solubles en la fase mvil - Deben ser capaces de interaccionar con la fase estacionaria: - disolvindose en ella - adsorbindose - reaccionando de forma qumica
CONSECUENCIA

durante la separacin los componentes se distribuyen en ambas fases CLASIFICACIN

18

-slido

19

CROMATOGRAMA

EJEMPLOS DE LA DETERMINACIN DE ALGUNAS VITAMINAS

20

DETERMINACIN ANALTICA DE LA VITAMINA A (Liposoluble)

PRECURSOR

FORMAS ACTIVAS

DETERMINACIN ANALTICA DE LA VITAMINA A (Liposoluble)

Cristales de retinol vistos con Luz polarizada

HPLC-UV Columna: C8, 250x4mm, 5m Fase mvil: metanol/agua (92:8) UV absorbancia a 330 nm UV, HPLC-FD Columna: Slice, 250x4mm, 7m Fase mvil: hexano/ter Fluorescencia, exc:330 nm em: 470 nm

Trans-retinol

21

DETERMINACIN ANALTICA DE LA VITAMINA E (Liposoluble)

HPLC-UV Columna: C8, 250x4mm, 5m Fase mvil: metanol/agua (92:8) UV, absorbancia a 288 nm HPLC-FD Columna: Slice, 250x4mm, 7m Fase mvil: hexano/isopropanol p p (99:1) ( ) Fluorescencia, exc:290 nm em: 330 nm

DETERMINACIN ANALTICA DE LA VITAMINA B1 (Hidrosoluble)

HPLC-FD Columna: Slice, 250x4mm, 7mm Fase mvil: MeOH,H MeOH H2O,actico O actico Fluorescencia, ec: 360 nm em: 435

Tiamina

Tiamina

22

DETERMINACIN ANALTICA DE LA VITAMINA C (Hidrosoluble)

Degradacin oxidativa del AA: AA: cido ascrbico AH-: monoanin ascorbato ADA: cido dehidroascrbico DCG: cido 2,3-dicetogulnico

Volumetra redox Oxidante: O id 2,6-dicloroindofenol 2 6 di l i d f l Reductor: Vitamina C Punto final: exceso de reactivo valorante (rosa prpura a pH<4)

DETERMINACIN ANALTICA DE LA VITAMINA C (Hidrosoluble)

Indicador (2,6 diclorofenolindofenol) Oxidacin de la vit C Indicador (2,6 diclorofenolindofenol) Oxidacin de la vit C

Disolucin patrn de Ascrbico (250 ppm)

Zumo con contenido en Ascrbico desconocido

Vindicador=5.5 mL 1mL?

Vindicador= 2 mL

23