Zklady hmotnostn

spektrometrie
stav molekulrn patologie, Fakulta vojenskho
zdravotnictv, Univerzita obrany Hradec Krlov
Historie
Koichi Tanaka Koichi Tanaka vyvinul MALDI
techniku
Tanaka K., Waki H., Ido Y., Akita S., Yoshida
T.: Rapid Commun. Mass Spectrom. 1988. 2,
151
JB JB Fenn Fenn vyvinul ionizaci
elektrosprejem
Fenn JB., Mann M., Meng CK., Wong SF.,
Whitehouse CM.: Science 1989, 246, 64
Oba zskali Nobelovu cenu v
roce 2002 v oboru chemie
Tanaka K.
Fenn J.B.
Princip
Hmotnostn spektrometrie (MS) je
fyzikln-chemick metoda, kter
uruje hmotnosti atom, molekul a
molekulovch fragment po jejich
peveden na ionty.
Pstroj se nazv hmotnostn
spektrometr.
Princip
MS vypovd o primrn struktue analyzovan
ltky
Neposkytuje informace o sekundrn i terciln
struktue proteinu
Odhaluje posttranslan a chemick modifikace
protein (fosforylace, glykosylace, oxidace.) a
me urit i msto modifikace
Me urit izotopov pomr prvk ve vzorku
nap.
13
C/
12
C,
34
S/
32
S,
18
O/
16
O - kvantifikace
Princip
Umouje analzu komplexnch sms
Zmen molekulov hmotnosti, kontrola kvality
Identifikaci protein
Odhaluje mutace a DNA sekvenan chyby
Monost analzy nekovalentnch komplex
Vlastnosti hmotnostn spektrometrie
Citliv
Specifick
Rychl
Jednoduch interpretace dat
Popis pstroje
1. Iontov zdroj
2. Hmotnostn analyztor
3. Detektor
4. dc pota
Experimentln uspodn
Vacuum Vacuum
System System
Sample Sample
Inlet Inlet
Detector Detector
Data Data
System System
Mass Mass
Analyser Analyser
Ionisation Ionisation
Method Method
Atmosphere
Sou
Sou

sti MS syst
sti MS syst

mu
mu
MALDI-TOF hmotnostn spektrometry
Ultraflex III MALDI TOF/TOF
(Bruker)
4800 MALDI TOF/TOF
(Applied Biosystems)
M
A
L
D
I
-
T
O
F

V
o
y
a
g
e
r
(
A
p
p
l
i
e
d
B
i
o
s
y
s
t
e
m
s
)
Princip
Ionizace
1.Mkk techniky ionizace
Energetick pebytek dodan molekule je mal a
fragmentace primrn vzniklho iontu je mal.
2. Tvrd techniky ionizace
Dodan energie postauje k rozshlej fragmentaci
primrn vzniklho iontu.
Typy ionizace
- nrazem elektron (EI)
- psobenm elektrostatickho pole (FI, FD)
- chemickou ionizac (CI)
- nrazem rychlmi atomy nebo ionty (FAB)
- ionizac fotony
- ionizac
252
Cf
- elektrosprejem, termosprejem (ESI)
- ionizace laserem za ptomnosti matrice (MALDI)
Hmotnostn analyztory
Umouj rozdlit v ase nebo prostoru sms iont o
rznch hmotnostech.
Typy analyztor
Prletov analyztor (TOF)
Kvadruplov analyztor (jednoduch, trojnsobn)
Iontov past
Hybridn (Q-TOF, Q-trap, trap-TOF, trap-ICR, )
Tandemov (TOF-TOF, QQQ)
FT- ICR MS, ORBITRAP
Detektor
Poskytuje analogov signl mrn potu
dopadajcch iont.
Dl se do dvou skupin
1. Detektory pro pm men detekuj el. proud
vznikajc pmm dopadem stanovovanch iont
(men izotopovho zastoupen prvk pi zjiovn st hornin)
2. Nsobiov detektory vyuvaj efekt nsoben
elektron uvolnnch z prvn konverzn dynody
po dopadu iont (nejastji pouvan detektory v MS,
poskytuj miteln signl pro jednotliv ionty)
Ionizace
MALDI
Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization
Metoda vyuv ionizace laserem
pulsn technika -------- UV (N
2
)
IR (CO
2
)
zkouman ltka je kokrystalyzovna v pevn matrici,
kter je ozena krtkm laserovm pulsem (3 ns)
dojde ke vzniku iont (neutrlnch, kladn i zporn nabitch)
jejich proud je usmrnn do analyztoru z doby letu (TOF)
MALDI-TOF MS - ionizace
1.Vzorek (A) je smchn s
matric (M) a usuen
(vykrystalizovn) na MALDI
destice
2. Laserov vstel ionizuje
molekuly matrice.
3. Molekuly vzorku jsou
ionizovny penosem protonu
z matrice:
MH
+
+ A M + AH
+
+
MALDI
destika
Laser
AH
+
+20 kV
Ground Variable
Grid Grid
MALDI ionizace
Mkk ionizace
Mal nebo dn fragmentace
Jednou nabit ionty [M+H]
+
; [M-H]
-
Lze mit proteiny, peptidy, oligosacharidy, nukleotidy,
syntetick polymery
Analza komplexnch slouenin
Rychl pprava vzorku & analza
Tolerantn k detergentm a solm
Jednoduch interpretace dat
Spojen s TOF analyztorem
ESI - ionizace elektrosprejem
Mkk ionizace
Technika pro disperzi kapalin a aerosol
On-line spojen HPLC a hmotnostnho spektrometru
Vznik vcensobn nabitch iont [M+zH]
z+
, [M+zH]
z-
Pro jeden analyt se ve spektru objevuj srie pk,
kter odpovdaj iontmte ltky, o stejn molekulov
hmotnosti M, s rozdlnm potemnboj z.
Vskyt iont - adukt analytu se sodnmi ionty
[M+zNa]
z+
a draselnmi ionty [M+zK]
z+
(pokud je
vzorek zasolen)
Nen tolerantn k detergentm a solm (ped analzou
je nutn peitn a odsolen vzorku)
Spojen s rznmi typy analyztor
ESI MS intaktnho proteinu
Vhody
Dky ptomnosti analytu ve vce iontech
s rznm nbojem lze snadno urit nboj iont
Nevhody
Snen citlivosti dky rozdlen signlu mezi
vce pk a men pehlednost spekter
sloitjch sms.
ESI - ionizace elektrosprejem
Pi ionizaci elektrosprejem probhaj
tyi zkladn procesy
1) vznik nabitch kapek na konci sprejovac
kapilry
2) zmenovn nabitch kapek v dsledku
odpaovn rozpoutdla a jejich opakovan
rozpad (Coulombick tpen)
3) uvolnn iont do plynn fze z malch,
vysoce nabitch kapek
4) sekundrn dje, kterch se astn ionty
v plynn fzi
ESI - ionizace elektrosprejem
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+ +
+
+
+
+
+
+
+
+
- -
-
+
+
+
+
Sprejovac kapilra
+
Zdroj vysokho
napt
+
Elektrony
-
Oxidace
+ + +
+ +
+ + +
+ + +
+ +
+ + +
+ + +
+ + + +
+ + +
+ + ++
+ + ++
+ + ++
+
+
+
+ + ++
+ + ++
+ + ++
+ + +
+ +
+ + +
+ + +
+ + + +
+ + +
+ + ++
+ + ++
+ + ++
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Elektrony Redukce
Taylorv kuel
Coulombick tpen
Zmenovn kapek v dsledku
odpaovn rozpoutdel
Foto ESI
Kapilra
Vstup
do MS
Hmotnostn analyztory
Ionty o stejn energii nebo o stejnm impulsu maj
rychlosti zvisl na hodnotch efektivn hmotnosti m/z
Ionty jsou vyputny do urychlovacho pole a se
zskanou energi postupuj analyztorem rychlost v,
take drhu d prolet za dobu t
Mezi dvma ionty rozdlnch hmotnost je tedy
diference v dobch letu
t = k ( m
1
/z - m
2
/z)
TOF analyztor
TOF analyztor
Umouje mit v linernm, reflektronovm
a PSD mdu
Linern md men protein (pm drha letu,
cca 1m)
Reflektronov md men peptid (drha letu
je prodlouena pomoc reflektronovho iontovho
zrcadla, cca 2-3m)
Post-Source Decay (PSD) kombinace
reflektronovho mdu s fragmentac mateskch
iont (informace o sekvenci peptid)
Letov trubice
Detektor
Zdroj
iont
15-25 kV
Prletov analyztor (TOF)
Letov trubice
Detektor
Zdroj
iont
Leh ionty dolet k detektoru rychleji ne ionty t.
15-25 kV
Prletov analyztor (TOF)
MALDI MS spektrum protein
Linern md
Reflektronov md
Charakteristika reflektronov md
Vysok rozlien (a 20 000) a pesnost (10-100 ppm)
Vysok citlivost (fmol = 10
-15
mol)
Teoreticky neomezen rozmez m/z
Tm souasn detekce vech iont: zisk plnho spektra
v jednom ionizanm pulsu
Kvadruplov analyztor (Q)
Dynamick analyztor, dlen iont je dosaeno jejich
prchodem mezi tymi kovovmi tyemi
Tye jsou paraleln rozmstny na krunici, na
protilehl tye je vloeno vdy stejn napt, kter je
kombinac stejnosmrn (U) a stdav (V) sloky
Napt vloen na dva pry ty jsou zvolena v danm
asovm okamiku tak, aby mezi tyemi proletly pouze
ionty s hodnotou m/z v uritm omezenm intervalu,
ppadn s jedinou hodnotou m/z.
Zbyl ionty jsou vyneseny ven z elektrickho pole a
zachyceny na tych kvadruplu.
Pn prez
kvadruplovm analyztorem
Schematick znzornn
kvadruplovho analyztoru
s naznaenm drhy iont.
Kvadruplov analyztor (Q)
Souasnou, plynulou zmnou hodnot U a V jsou
postupn analyzovny vechny ionty ve zvolenm
rozsahu m/z
Kvadrupl funguje jako laditeln filtr slouc ke
skenovn spektra ve zvolenm rozsahu
Je-li na tye pivedena pouze stdav sloka
napt, kvadruplov analyztor propout
vechny ionty nezvisle na jejich efektivnch
hmotnostech. V tomto reimu se analyztor
pouv jako iontov vodi.
Kvadruplov analyztor (Q)
Vhody
relativn rychl zznam celho spektra
linern stupnice m/z
nen ptomen magnet
Nevhody
nzk rozlien
nzk rozsah m/z (2 4 kDa)
diskriminace iont s vym m/z
Kvadruplov analyztor (Q)
Pouit
pi analzch anorganickch a lehkch i stedn tkch organickch
slouenin
analza peptid a protein je vhodn pedevm ve spojen s ESI, kde
je hodnota m/z generovanch iont snena dky vymu potu nboj
dosahuj tak vbornch vsledk pi men kvantity analyt
jsou vhodn pro spojen GC/MS a HPLC/MS
umouj men v tandemovm uspodn hmotnostnho
spektrometru
lze pout stejn hmotnostn analyztory, nap. QqQ trojit
kvadrupl
nebo kombinace hmotnostnch analyztor, nap. Q-TOF
kvadrupl a prletov analyztor
Kvadruplov analyztor (Q)
Vyuit trojitho kvadruplu
pro strukturn analzu peptid a jinch lehkch a
stedn tkch biomolekul
pracuje tak, e v prvnm kvadruplovmfiltru je
izolovn prekurzor (matesk iont)
druh kvadrupl pracuje v reimu iontovho vodie a
slou jako kolizn cela
v dsledku srek s molekulami koliznho plynu (nap.
helium, argon) dochz ke kolizn indukovan disociaci
(CID) za vzniku dceinnch iont, kter jsou pak
analyzovny poslednm, tetm, kvadruplem
Kvadruplov analyztor (Q)
Iontov past (IT)
je v podstat trojrozmrn kvadrupl
skld se z prstencov stedn elektrody s hyperbolickm
prezem a dvou kruhovch elektrod rovn s
hyperbolickm prezem, kter prstenec voln uzavraj
na prstenec je vloeno kombinovan stejnosmrn (U) a
radiofrekvenn (V) napt
dochz ke stabilnm oscilacm iont v pasti
vechny ionty nad uritou hodnotu m/z odpovdajc
amplitud vysokofrekvennho napt maj trajektorie, kter
je udruj uvnit pasti
Iontov past (IT)
do iontov pasti je zavdno hlium (tlumc plyn)
He tlum oscilace iont a udruje je ve stedu pasti
pi zvyovn vysokofrekvenn amplitudy se ionty s rostouc
hodnotou m/z postupn stvaj nestabilnmi a jsou vypuzovny z
pasti a detekovny.
Kvadruplov iontov past
Vhody
umouje strukturn analzy bez nutnosti jakhokoli rozen
pstroje
vybran iont lze v pasti uchovat, nsledn ho podrobit fragmentaci
do druhho (MSMS) nebo vce (MSn) stup
teoreticky mohou komern iontov pasti mt MS
10
, prakticky jsou
detekovny ionty asi do MS
4
a vjimen do MS
7
pomrn vysok rychlost skenovn (~10
3
Da/s)
umouje dosaen izotopovho rozlien do m/z ~ 2 4 kDa
vyho rozlien lze doshnout za cenu snen rychlosti skenovn
spektra nebo rozsahu m/z
Iontov past (IT)
Vhody
mc rozsah iontov pasti byl pvodn 650 Da, ale
dalmi pravami bylo dosaeno a 70 000 Da a
rozliovac schopnosti FWHM a 40 000
standardn se vyrbj iontov pasti s rozsahem
2 000 Da
ve spojen s ESI (poskytujc vcensobn nabit ionty)
je iontov past vynikajcm nstrojem proteomiky
Iontov past (IT)
Linern iontov past
v souasn dob dochz k pechodu od klasick kvadruplov
(trojrozmrn) pasti k pastm linernm (linear trap, LT)
LT jsou tvoeny kvadruplem, kter je ze vech stran uzaven
vky
ionty jsou nejprve akumulovny v potenciln jm mezi vky
iontovho vodie pracujcho v kvadruplovm reimu a pozdji
vypoutny ve smru osy nebo pes otvory v tych kvadruplu
nejvznamnj vhodou linern pasti, ve srovnn s
trojrozmrnou, je vrazn innj akumulace iont, vy
iontov kapacita, tm i vy dynamick rozsah, a vce
operanch reim
vhodn pro men posttranslanch modifikac protein
(fosforylace)
Iontov past (IT)
Tandemov hmotnostn spektrometr
tandemov hmotnostn spektrometrie (MS/MS),
ppadn hmotnostn spektrometrie n-tho stupn (MS
n
),
slou k bli charakterizaci analyzovan ltky, nap.
uren aminokyselinov sekvence nebo lokalizace
posttranslanch modifikac
obsahuj dva hmotnost analyztory sriov spojen
kolizn celou
v prvnm analyztoru dojde k rozlien prekurzorovch
(mateskch) iont a k vbru jednoho z nich
tento prekurzor je podroben fragmentaci v kolizn cele
a vznikl produktov (dceinn) ionty jsou rozlieny
v druhm analyztoru
Pprava vzork pro MS
Pedseparan techniky
rozdlen analyzovan ltky (1D, 2D ELFO,HPLC,
capLC, MudPIT HPLC .)
Dlen jak proteinovch tak i peptidovch sms
Separovan
Protein
Proteolytick
peptidy
MALDI-TOF
MS spektrum
proteolyt. peptid
Proteasa
Postup ppravy vzork
2D-PAGE a MALDI-TOF
tpen protein
Enzymov
proteolza, nejpouvanj enzym je trypsin
Chemick
nejsou bn, pouvaj se jako doplkov
nap. BrCN - bromkyan se pouv pro tpen ve
vod nerozpustnch nebo membrnovch protein
Molekulov hmotnost vzniklch peptid se pak m
na hmotnostnm spektrometru
Proteolytick enzymy - protezy
Katalyzuj exotermn hydrolzu peptidovch vazeb v proteinech a
peptidech
Vhody jejich pouit
vysok specifita
minimalizovan vedlej reakce
dobr innost tpen
Podmnky pouit, dleit je dodren:
pH reaknho pufru
pomru enzym/substrt
teptoty
doby inkubace
pokud je to nutn provd se:
redukce disulfidovch vazeb (nap. DTT)
alkylace reaktivnch cystein (nap. jodacetamid)
Klasifikace
proteinzy - psob na proteiny
(nevyaduj ptomnost volnch konc susbstrt)
peptidzy - psob na mal oligopeptidy
(vyaduj alespo jeden konec substrtu voln
a to v blzkosti msta tpen)
endopeptidzy - katalyzuj hydrolzu peptidovch
vazeb uvnit etzce a tvo peptidy o rzn dlce
exopeptidzy - katalyzuj hydrolytick odtpen
koncov aminokyseliny
N-koncov (aminopeptidzy)
C-koncov (karboxypeptidzy)
Proteolytick enzymy - protezy
Peptidzy
Endopeptidzy se zskvaj:
z orgn trvicho traktu obratlovc (pankreas - chymotrypsin, trypsin,
aludek - pepsin)
krve (thrombin)
sleziny (kathepsiny)
rostlinnho materilu (papain, ficain, bromelain)
mikroorganism (Glu-C, pronase, thermolysin)
Exopeptidzy se zskvaj:
pankreatu
rostlin
mikroorganism
Tabulka enzym a chemickch ltek
pouvanch pro tpen protein
Trypsin
v proteomice nejpouvanj serinov endopeptidza
tp v mrn alkalickm prosted (pH 7.8)
tp specificky peptidov vazby na C-konci kladn
nabitch zbytk argininu a lysinu, pokud nensleduje
prolin
doba tpen 4 - 24 hodin
teplota pi tpen 37 C
methylovan trypsin tp 30 minut pi 58 C
poskytuje definovan peptidov fragmenty
dobe se ionizuj
vhodn velikost pro MS analzu
jeden z monch typ trypsinu je hovz trypsin
m Mw 24 kDa, pH 9.4
trypsin je vhodn pro tpen v polyakrylamidovm gelu, je schopn difundovat
pry gelu k proteinu
vt molekuly peptidz nejsou schopny do gelu difundovat ze strickch dvod
vzhledem k vysok specifit tpen jsou tvoeny databze obsahujc proteiny s
teoretickmi trypsinovmi peptidy vetn jejich m/z hmotnost
vyuit k identifikaci protein metodou peptide mass fingerprinting (peptidov
mapovn)
Nevhody
mal termostabilita (pi vy teplot kles aktivita)
autolza (autolytick peptidy trypsinu ru MS analzu)
tp pouze v optimlnm pH
Modifikace trypsinu (methylace, acylace) zabrauj jeho autolze a termolabilit.
Trypsin
Chymotrypsin
serinov endopeptidza
nkdy nahrazuje nebo dopluje trypsin
vhodn pro tpen protein v roztoku i gelu
specifita tpen je na rozdl od trypsinu nzk
peptidovou vazbu tp na C-konci v mst:
F (phenylalanin), Y (tyrosin), W (tryptophan),
L (leucin), I (isoleucin), V (valin), M (methionin)
pokud nensleduje prolin
Glu-C
serinov endopeptidza
produkt bakterie Staphylococcus aureus
tp peptidov vazby na C-konci kyseliny
glutamov ppadn kyseliny asparagov (3000x
pomaleji)
Lys-C
serinov endopeptidza
produkt bakterie Lysobacter enzymogenes
tp peptidov vazby na C-konci lysinu
Pouit enzym v proteomice
studium glykosylace (Glu-C, Asp-N)
lokalizace fosforylanch mst (elastza)
analza peptid s disulfidovmi vazbami (Glu-C, Lys-C,
thermolysin)
peptidov mapovn (Asp-N, Arg-C, Glu-C, Lys-C -
striktn specifita)
proteinov modifikace vetn posttranslanch (pronza),
poskytuje krtk peptidy - nevhodn pro peptidov
mapovn
strukturn zmny v proteinech na zklad izotopov
vmny vodk/deuterium, analza O-glykosylace proteinu
(pepsin, peptidzy)
Enzymatick tpen vzorku
Trvic enzym trypsin umouje specifick tpen peptidov
vazby u kladn nabitch zbytk.
Trypsin tp peptidov vazby na C-konci kladn nabitch
zbytk argininu a lysinu, nen-li nsledujc zbytek prolin.
- Phe - Trp - Met - Gly - Ala - Lys - Leu - Pro - Met - Asp - Gly - Arg -- Cys -
Trypsin Trypsin
Matrice
Matrice slou jako rozpoutdlo analytu, take jeho
molekuly jsou dostaten zjemn separovny a jejich
intermolekulrn psoben je redukovno na minimum
Matrice mus absorbovat v UV oblasti (pokud pouvme
N
2
laser) a mus bt mlo tkav (to souvis s erpac
rychlost vakuovho systmu)
Matrice mus vytvoit co nejjemnj smsn krystaly
U matric je dleit ptomnost -OH skupin, kter
zajiuj ionizaci analyt. Pokud jsou -OH skupiny
nahrazeny za CH
3
CO- skupiny, matrice ztrc svou
funkci
Vzorce a nzvy matric
Krystaly vzorku a matrice SA
na MALDI destice
Brucella melitensis CAPM 6374 Burkholderie pseudomallei CAPM 3462 Francisella tularensis CAPM 5541 Brucella melitensis Burkholderie pseudomallei Francisella tularensis Brucella melitensis CAPM 6374 Burkholderie pseudomallei CAPM 3462 Francisella tularensis CAPM 5541 Brucella melitensis Burkholderie pseudomallei Francisella tularensis
MALDI-TOF MS
Vbr matrice

Nzev matrice Analyzovan ltka
-kyano-4-hydroxyskoicov kys. (CHC)
Peptidy, proteiny < 10 kDa, karbohydrty,
lipidy
3,5-dimetoxy-4-hydroxyskoicov kys. (SA) Proteiny, peptidy > 10 kDa, glykoproteiny
2,5-dihydroxybenzoov kyselina (DHB)
Neutrln karbohydrty, syntetick polymery,
peptidy, proteiny, glykopeptidy, lipidy,
glykoproteiny
3-hydroxypikolinov kyselina (3-HPA) Oligonukleotidy, glykoproteiny
3,4-dihydroxyskoicov kyselina (CA) Proteiny, oligonukleotidy
Interpretace spekter
Metoda peptidovho mapovn (PMF)
700 1260 1820 2380 2940 3500
Mass (m/z)
0
4.0E+
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
%

I
n
t
e
n
s
i
t
y
Voyager Spec #1 MC[BP = 1112.6, 39593]
1112.57
1508.83
1337.66
1806.97
721.40
1032.59
1718.91
1278.70
2299.22
2007.11
874.52 1204.64
1381.70
1851.91
1530.83
2310.25 1095.54