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Proteinas Asociadas a Componentes Del Citoesqueleto

Proteinas Asociadas a Componentes Del Citoesqueleto

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Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 35, No. 2, 2004.
89
Proteínas asociadas a los componentesdel citoesqueleto
Recibido: 9 de octubre de 2001. Aceptado: 30 de mayo de 2002.Palabras clave: proteínas, citoesqueleto, citoplasma, células eucariotas.Key words: proteins, cytoskeleton, cytoplasm, eucaryotic cells.
Delia Mercedes Rojo Domínguez, Lourdes García Bacallao, Maureen Hernández Angel y MayraAlvarez Corredera.*
División de Productos Naturales, Centro de Investigaciones Biomédicas, Calle 146 esquina a Avenida 31, Cubanacán, Playa,Ciudad de La Habana. *Departamento de Farmacología, Facultad de Ciencias Médicas  Calixto García, Ciudad de LaHabana.
RESUMEN
. El citoesqueleto es una compleja trama de filamentos en el citoplas-ma que sirve como huesos y musculos de las células eucariotas y que permitelas propiedades de forma, organización interna y movimiento. Los filamentos queconstituyen el citoesqueleto son: los microtúbulos, los filamentos intermedios ylos filamentos de actina de 24,10 y 7 nm de diámetro respectivamente. Los princi-pales avances logrados en el conocimiento de esta dinámica estructura subcelularderivan de estudios realizados en músculos y tejidos cuyas células presentan cilioso flagelos, las cuales poseen funciones evidentemente asociadas al movimientomecánico. Los componentes moleculares presentes en estas estructuras estántambién en aquellas que conforman el citoesqueleto de todas las células. Los fila-mentos y microtúbulos que participan en los movimientos del músculo y de loscilios presentan propiedades muy semejantes a las observadas en el citoesquele-to, pero difieren en estabilidad. Los movimientos del citoesqueleto son muy lábilesy cambiantes mientras que los del músculo y los de los cilios son más estables.Los dos tipos más importantes de filamentos del citoesqueleto son los de actina ylos microtúbulos. Ambos están formados por subunidades de proteínas que pue-den ensamblarse y desensamblarse rápidamente en las células. Existen delica-dos mecanismos que controlan este ensamble del
 pool
de subunidades nopolimerizadas en el citoplasma. Los filamentos intermedios se encuentran en lamayor parte de las células animales. Están formados por subunidades de proteí-nas fibrosas y son mucho más estables que la mayoría de los filamentos de actinay los microtúbulos.
ABSTRACT
. The cytoskeleton is a complex weft of filaments in the cytoplasm, whichis used as the ¨bones and muscles¨ in the eucaryotic cells and supports the propertiesof shape, internal organization and movement. The cytoskeleton filaments are:microtubules, the intermediate filaments and actin filaments of 24,10 y 7 nm in diameterrespectively. The main achievements in the knowledge of this dynamic subcelularstructure derive from studies performed on muscles and tissue whose cells presentcilium and flagellum having its function obviously associated with the mechanicalmovement. The molecular components present in those structures are also present inthose other structures conforming the cytoskeleton in all types of cells. The filamentsand microtubules participating in the muscles and cilium movement have properties very similar to those observed in the cytoskeleton although differing in stability. Thetwo most important types of filaments of the cytoskeleton are actin filaments andmicrotubules. Both are made of globular proteín subunits that can assemble anddisassemble rapidly in the cell. A delicate mechanism exists for controlling theirassembly from pools of unpolymerized subunits in the cytoplasm. A third class of proteín filaments called intermediate filaments is found in most animal cells; they aremade of fibrous proteín subunits and are much more stable than most actin filamentsand microtubules. In addition to three major types of proteín filaments, the cytoskeletonalso contains many different accessory proteín that either link the filaments to oneanother or to other cell components as the plasma membrane, or influence the rateand extent of the filament polymerization.
INTRODUCCION
Tanto los movimientos como lasformas características de un tipo ce-lular o estructura eucariótica espe-cífica implican un complejo conjun-to de fibras proteicas que se encuen-tran en el citoplasma, el citoesque-leto. Las células eucarióticas con-tienen tres grandes clases de fibrascitoesqueléticas: microfilamentos deactina, los microtúbulos y los fila-mentos intermedios de 7, 24 y 10 nmde diámetro respectivamente. Estasfibras no se encuentran en losprocariotas.Los microfilamentos de actina ylos microtúbulos se forman por po-limerización de subunidades de pro-teínas llamadas actina G y tubulinarespectivamente. La polimerizacióny despolimerización de estas fibrasestán estrechamente reguladas porlas células. Por ejemplo, estructurastales como los husos mitóticos quecontienen microtúbulos, se formandurante la fase mitótica del ciclo ce-lular y posteriormente, se desensam-blan rápidamente. La mayor parte delas células eucariotas contienen unoo más tipos de filamentos interme-dios, cada uno de los cuales tambiénestá formado a partir de subunida-des proteicas específicas. Algunos sistemas de actina y demicrotúbulos son característicaspermanentes de las células, inclu-yendo los filamentos de actina ymiosina en el aparato contráctil delmúsculo, los filamentos de actina enlas células intestinales de borde encepillo y los microtúbulos que se
 
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encuentran en los cilios de ciertosmicroorganismos. Estos sistemas defibras se prestan fácilmente a análi-sis bioquímicos y ultraestructuralesporque sus estructuras filamentosasextremadamente ordenadas son es-tables, abundantes y fácilmentepurificables. Tales estudios hanaportado gran cantidad de informa-ción sobre la estructura molecular yfunción de estos sistemas. Por ejem-plo, los movimientos ondulatorios delos cilios y la contracción muscularson consecuencia del ensamble ydesensamble de asociaciones espe-cíficas proteína- proteína entre dosfilamentos que se deslizan uno so-bre otro. La energía para estos mo- vimientos se genera de la hidrólisisdel ATP, catalizada por enzimas es-pecíficas que se unen a la actina o alos filamentos de tubulina.Muchas de las proteínas citoes-queléticas están codificadas por fa-milias multigénicas. Cada familiaderivó probablemente de un gen ori-ginal presente en una célula euca-riota primordial que a través de laevolución fue duplicado y posterior-mente modificado. Una cuestiónimportante que se debe discutir essi las diferentes proteínas de actinay tubulina de los vertebrados supe-riores forman estructuras específi-cas o tienen funciones únicas o bien,si son otros componentes los quedeterminan las diferentes funcionesde las diversas estructuras que con-tienen a aquellas.
MICROTUBULOS
Son polímeros dinámicos que secaracterizan por su aspecto tubulary por la constancia de sus propieda-des en diferentes tejidos celulares.Pueden estar libres en el citoplasmao bien como parte integrante de loscilios y flagelos. El componente prin-cipal es una proteína denominadatubulina, que forma la unidad bási-ca, heterodímero de
α−β
tubulina.Estos polímeros crecen por la adi-ción de
α−β
tubulina y se acortan porla liberación de heterodímeros detubulina desde ambas terminacio-nes. La estabilidad de los diferentesmicrotúbulos es variable, los del cito-plasma y los del huso suelen serlábiles, en tanto que los de los ciliosy flagelos son más resistentes a losdiferentes tratamientos. Los micro-túbulos desempeñan una funciónmecánica, ya que constituyen unaespecie de citoesqueleto. Tambiéndepende de ellos la forma de las cé-lulas y de las prolongaciones celula-res. La polaridad y desplazamientodireccional de las células cultivadasdepende de los microtúbulos. Estasestructuras están asociadas con eltransporte de moléculas, gránulos y vesículas en el interior de las célu-las. También desempeñan un papelimportante en la contracción delhuso y en el movimiento de loscromosomas y centriolos, así comoel movimiento ciliar y flagelar. Se haconsiderado la intervención de losmicrotúbulos en la transducciónsensorial.
1
La mayoría de las Proteínas Aso-ciadas a los Microtúbulos (MAP) hansido identificadas y se conoce que seunen a ellos sin requerimiento denucleótidos.
2
Individualmente serevela un patrón característico en lascélulas nerviosas (Tabla 1)Todas estas MAP son moléculasfibrosas de diferente longitud en unintervalo entre 50 a 185 nm y formanproyecciones filamentosas en la su-perficie del microtúbulo. En recien-tes clonajes y secuenciaciones mo-leculares de cDNA- MAPs, revelaque MAP 2 (1828 aa ), Tau (432 aa) yMAP 4 (1072 aa) están todas com-puestas por una proyección dominioamino-terminal y una carboxilo ter-minal, región de unión de losmicrotúbulos. Esta región de uniónestá bien conservada en estas tresproteínas y consiste en tres o cuatrorepeticiones de 18 aa. En contraste,la región de unión a microtúbulos deMAP 1 B (2413aa) contiene 21 repe-ticiones de 4 aa (lys, lys, glu X, don-de X es cualesquiera aa), cerca delcentro de la molécula.Un considerable número de evi-dencias basadas fundamentalmenteen estudios
in vitro
, implica que elcontrol de la dinámica de los mi-crotúbulos y la morfogénesis celular,es la mayor función de estas MAP
in vivo
.
Dinámica de los microtúbulos
En disolución la tubulina puraexhibe un estado de inestabilidad di-námica, en el cual los polímeros con-tinúan polimerizando y despolime-rizando, aun cuando la masa de es-tos se mantenga en un estado está-tico. Esta inestabilidad se piensa quesea manejada por un ciclo de hidró-lisis e intercambio de GTP. Los dí-meros de tubulina unidos al GTP sepolimerizan preferencialmente y lasterminaciones de los microtúbulosno-se despolimerizan, hasta que elGTP unido se hidrolice a GDP.
3
Ladinámica de los microtúbulos pue-de ser descrita por los indicadoressiguientes:1. El número total de microtú-bulos, depende del número de sitiosde nucleación
in vivo
, ya que losmicrotúbulos crecen solo por sitiosespecíficos en la célula, usualmentedesde los centrosomas.2. La velocidad de crecimientoy la de acortamiento, están defini-das por la velocidad de adición y pér-dida respectivamente de dímeros detubulina al final de los microtúbulosindividualmente.3. La velocidad de catástrofe esla frecuencia de transición de los fi-nales individuales de los microtú-bulos en un estado de crecimiento aun estado de acortamiento.4. La velocidad de rescate es lafrecuencia de transición de los fina-les individuales de los microtúbulosdel estado de acortamiento al esta-do de crecimiento. Siendo constan-te el número de sitios de nucleación,las cuatro velocidades (crecimiento,acortamiento, catástrofe y rescate)determinan otros indicadores:a) La fracción de tubulina presentecomo polímero contra la fracciónpresente como unidad base (losheterodímeros).b) La velocidad de renovación o re-cambio de los dímeros de tubulinaentre polímeros y
 pool
de dímeros.
Las MAP controlan la dinámica delos microtúbulos
 in vitro
e
 in vivo
Los microtúbulos exhiben fasesde elongación y rápido acortamien-to, la abrupta transición entre estasfases (rescate y catástrofe) es la ra-zón de su llamada inestabilidad di-námica
in vitro
. Se han hecho ob-servaciones a tiempo real, usando vi-deo-microscopio o microscopio decampo oscuro y se ha demostrado lainestabilidad dinámica de losmicrotúbulos, ensamblados indivi-dualmente
in vitro
, con MAP(Tau)purificadas, MAP2 purificadas, pre-paraciones de MAP estables al calor
opiT nóicazilacoL  A 1P A M .seno x aysatirdneD B1P A M .seno x aysatirdneD  A 2P A M .satirdneD B2P A M .satirdneD C2P A M .satirdneD )uaT(P A M .seno x  A  )uaTgib(P A M .seno x  A  4P A M neetnanimoderP edsopitsohcum .nóisi vidnesaluléc P A M X .supone X edso veuH
Tabla 1.
Patrón de distribución de lasMAP.
 
Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 35, No. 2, 2004.
91
no fraccionadas o MAP(Tau) produ-cidos en
Echerichia coli.
4-6
 
Las MAPcerebrales reducen la velocidad delacortamiento rápido de los micro-túbulos, pero permiten una pérdidasignificativa de polímeros durante lafase de acortamiento. Las MAP(Tau)y MAP2 purificadas, disminuyen lafrecuencia de catástrofe y aumentanla frecuencia de rescate, mientrasque las MAP estables al calor, supri-men la catástrofe completa, pero amuy bajas concentraciones detubulina. Entonces cada una de es-tas MAP modulan, pero no suprimenla conducta dinámica de los microtú-bulos. Esta conducta es perturbadapor la fosforilación por MAP (mito-gen-activated protein) quinasa,
7
queafecta esta actividad disminuyendola afinidad de las MAP(Tau) del en-rejado de microtúbulos.
5
Estudios dela redistribución cinética de la lon-gitud de los microtúbulos
in vitro
,muestra que un péptido análogo co-rrespondiente a la segunda secuen-cia, en la región de unión al microtú-bulo de la MAP, puede retardarmarcadamente la distribución ciné-tica de la longitud.
8
Se sabe ya que las MAP contro-lan individualmente la dinámica delos microtúbulos
in vitro
. Ahora esnecesario saber si ellas realmentecontrolan la dinámica de los micro-túbulos
in vivo
. En observaciones ycuantificaciones
in vivo
de la con-ducta individual de los microtúbu-los, se observó que la dinámica delos microtúbulos es específica deltipo celular; estos experimentos serealizaron por microscopia fluores-cente después de una inyección consubunidades de tubulina, marcadacon rhodamina.
9
La estabilidad también se exami-nó en células Hela y 3T3 transforma-das con el cDNA de MAP 2 C, MAP(Tau) o MAP 1 B con tratamiento deun agente despolarizante de losmicrotúbulos. Los microtúbulos encélulas transformadas con MAP2 C,MAP(Tau) o MAP1B se estabilizaroncontra los agentes despolimeri-zantes de microtúbulos, pero la es-tabilización fue menos eficiente encélulas transformadas con MAP1Bque en células transformadas conMAP2C o MAP(Tau).
10
Este estudiodemostró también que los microtú-bulos en células transformadas conMAP1B,
11
fueron enriquecidas en atubulina acetilada. Estos resultadossugieren que las MAP neuronalesque fueron introducidas en losfibroblastos por transfección decDNA estabilizan los microtúbulosy afectan el estado de modificaciónpostraduccional de la tubulina. En-tonces hay aquí una gran evidenciaque indica que las MAP funcionanen la dinámica de los microtúbulos.
12-14
Se estudió también cómo los com-ponentes de tubulina influyen en ladinámica de los microtúbulos, utili-zando a estos libres de MAP, de labanda marginal de eritrocitos deaves, en comparación con los micro-túbulos de cerebro de mamíferos. Latubulina en el sistema eritrocitarioes muy homogénea, en contraste conla tubulina cerebral. Fue muy inte-resante que aunque los microtú-bulos de eritrocitos muestran unaconducta similar a los de cerebro,ellos fueron mucho menos dinámi-cos. La concentración crítica para laelongación y velocidad de asociacióny disociación de la tubulina, es mu-cho menor que con los microtúbulosde cerebro. Las catástrofes son raras,los rescates frecuentes. Esto signifi-ca, que la estabilidad dinámica pue-de ser controlada por el isotipo detubulina, también como e indepen-dientemente de las MAP.
15
La fosforilación de las MAP esotro factor que influye en la dinámi-ca de los microtúbulos
in vivo
. Es-tudios previos han demostrado quehay unión de las MAP a los microtú-bulos dependiente de fosforilación.En las células en división, sepiensa que la fase de transición in-terfase mitosis de microtúbulos di-námicos sea inducida por reaccionesde fosforilación mediadas por MPF(mitosis promoting factor) y por laMAP quinasa, funcionando despuésde MPF. Con el objetivo de estudiaresta interacción, las principalesMAP p220 se purificaron de huevosde Xenopus. Cuando se purificó p220de la célula en interfase, se unió po-tentemente a los microtúbulos y es-timuló la polimerización de latubulina, mientras que cuando p220se extrajo de las células en faseM(mitosis), mostró muy poca o nin-guna actividad. La proteína fue lo-calizada en los microtúbulos duran-te la interfase, pero fue fosforilada ydifusamente distribuida a través dela célula en la fase M. Este estudiosugiere que el drástico cambio en laacción de p220 en la dinámica de losmicrotúbulos durante la transiciónde interfase a fase M, pudo ser indu-cida por su fosforilación en fase M,probablemente catalizada por MAPquinasa y MPF.
16
 Acorde con la regulación de ladinámica de los microtúbulos por lasMAP, la única ATPasa que se une aestos (katanina) fue identificada ycaracterizada recientemente.
17
Lakatanina es una proteína heterodí-mera (81 a 70 kDa) purificada de hue- vos de rana y erizo, que usa la hidró-lisis de ATP para separar y desen-samblar los dímeros de tubulina delos microtúbulos. Junto a otras MAPesta proteína podría controlar la di-námica de los microtúbulos de lacélula en división.La proteína X MAP fue original-mente descrita como una proteínaque incrementa el contenido depolímero por el incremento de la ve-locidad en el extremo de crecimien-to rápido de los microtúbulos.
18
Trabajos más recientes demostra-ron que XMAP incrementa el recam-bio, disminuyendo la frecuencia derescate y aumentando la velocidadde crecimiento y acortamiento. El in-cremento en la velocidad de creci-miento es suficiente para compen-sar el aumento de la velocidad derescate y acortamiento y por tantopromueve el ensamble de la malla.Este resultado es importante por dosrazones: primero XMAP es la prime-ra proteína caracterizada que incre-menta el recambio. Todas las otrasMAP caracterizadas, reducen el re-cambio incrementando el rescate. Laexistencia de proteínas como XMAPpodrían explicar porqué el recambio
in vivo
es mucho mayor que en di-soluciones de tubulina pura. Segun-do XMAP promueve el ensamble dela malla al mismo tiempo queincremente el recambio. La acciónde XMAP o de una proteína similar,podría parcialmente explicar cómoel nivel de polímeros de la malla eninterfase y metafase son iguales, auncuando el recambio es mucho mayoren metafase.
Bases estructurales de la nuclea-ción de los microtúbulos por
γ γ γ γ γ 
-tubulina
 Además de la regulación del cre-cimiento y acortamiento dinámico,el número de sitios de nucleación delos microtúbulos del centrosomatambién parecen ser regulados conel incremento del número de sitiosde nucleación que ocurren durantela mitosis.
19,20
Los sitios de nuclea-ción en el centrosoma, están com-puestos por
γ 
-tubulina (al menos enparte). Esto se basa en que: primero,la inmunolocalización de
γ 
-tubulinamuestra que están concentrados enlos centrosomas y otros sitios denucleación de los microtúbulos ysegundo, que la inhibición de
γ 
-tubulina,
in vivo
e
in vitro
, trae lapérdida de la actividad de nuclea-ción de los microtúbulos en loscentrosomas.

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