Isolasi Cepat Genom DNA dari Kerang Hijau Asia (Perna viridis) untuk Amplifikasi Random Polimorfisme Mikrosatelit

Kerang hijau Asia, Perna viridis merupakan sumber protein hewani bagi manusia. Selain itu, kerang ini merupakan bioindikator penting berbagai logam berat kontaminan dalam lingkungan laut. Saat ini, Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan metode yang digunakan secara luas dalam studi modern populasi genetika untuk mendeteksi keragaman genetika di dalam dan di antara populasi. Namun, studi semacam ini dibatasi oleh panjang dan padatnya proses dari isolasi DNA suatu spesies. Sudah banyak studi yang mengembangkan prosedur cepat dari ekstraksi DNA, namun sebagian besar metode cepat yang dikembangkan, untuk deteksi PCR gen tertentu yang tidak selalu cocok dan berlaku untuk penggolongan molekuler. Di sini peneliti mengembangkan metode isolasi DNA yang cepat, sederhana, dan tidak mahal dari mantel kerang hijau Asia (Perna viridis) untuk amplifikasi PCR dari amplifikasi random mikrosatelit (RAM). Kerang hijau Asia yang digunakan dalam penelitian ini, didapat dari pembenihan kerang di sepanjang pantai barat Semenanjung Malaysia. Kerang yang sudah bersih mantelnya dipisahkan. Setengah bagian dari mantel disimpan di tas terpisah pada suhu -20oC dan sebagiannya lagi direndam dalam etanol absolut dan disimpan pada 4oC yang dilakukan beberapa hari sebelum ekstraksi DNA. Ekstraksi DNA dilakukan dengan berbagai variasi prosedur. Terdapat 6 variasi prosedur dengan kombinasi protokol yang berbeda-beda. Kombinasi protokol tersebut adalah Chelex 100 resin- Proteinase K, Chelex 100 resinProteinase K- etanol absolute, Chelex 100 resin- Proteinase K- silika, Chelex 100 resin, Chelex 100 resin- etanol absolute, dan digunakan pada masing-masing prosedur. Proteinase K- etanol absolute. Kombinasi ini berpengaruh pada senyawa apa yang akan digunakan dan tidak

Kuantitas

DNA dideterminasi

menggunakan

spektofotometer

UV

(Thermo). Reaksi PCR dilakukan dalam Chelex 100 resin- Proteinase K 35 siklus. Produk Amplifikasi PCR difraksinasi secara elektroforesis pada 2% gel agarose dan diwarnai dengan etidium bromida. Dalam penelitian ini protokol ekstraksi DNA yang berbeda dari yang telah ada dibandingkan dan protokol yang cepat, sederhana dan murah dikembangkan. Hasilnya protokol yang dikembangkan tersebut dapat mengekstrak DNA genom dengan kemurnian yang lebih tinggi pada kerang yang diawetkan dengan etanol dibandingkan dengan yang dibekukan. Kemurnian DNA dari kerang yang dibekukan kurang dari 1,8 namun masih dapat diterima untuk amplifikasi PCR. Amplifikasi random mikrosatelit dengan menggunakan PCR menghasilkan perbedaan pita pada gel elektroforesis dan semua pita dapat digandakan. Protokol ekstraksi DNA didasarkan pada tiga tahapan: (1) memanaskan/ merebus jaringan mantel di dalam Chelex 6% resin 100; (2) pencernaan jaringan dengan Proteinase K; (3) penggumpalan DNA dengan etanol absolute. Semua protokol hanya memerlukan waktu sekitar 1 2/3 jam dan cocok untuk ekstraksi DNA dari sampel yang berjumlah besar. Pada penelitiaan ini, lisat DNA yang diperoleh dari metode Chelex 100- proteinase K hanya menghasilkan beberapa pita yang lemah dalam analisis RAM. Spektofotometri UV menunjukkan kemurnian yang rendah pada ekstraksi DNA. Walaupun dengan keadaan seperti itu amplifikasi PCR masih dapat dilaksanakan dengan menggunakan Taq DNA polymerase. Kemurnian DNA yang diperoleh dengan menghilangkan penggunaan Proteinase K atau Chelex 100 resin relatif lebih rendah dari DNA yang diperoleh dengan Chelex 100- Proteinase K- penggumpal protokol etanol. Ekstraksi DNA menggunakan kombinasi Chelex 100, proteinase K dan purifikasi silica memberikan hasil yang kurang baik tidak sesuai dengan hasil penelitian sebelumnya. Profil RAM yang dihasilkan berbeda dengan penelitian sebelumnya dan kemurnian DNA yang dihasilkan tidak tinggi.

Hasil penelitian memperlihatkan bahwa penggabungan protokol Chelex 100- Proteinase K- penggumpal etanol adalah metode yang kuat dan ekonomis untuk isolasi DNA dari jaringan mantel kerang beku dan yang diawetkan etanol untuk mempelajari filogenetik populasi. Prosedur tidak menggunakan bahan kimia berbahaya dan prosedur secara lengkap tidak lebih dari 2 jam. Oleh karena itu, protokol ini cocok untuk menyelidiki sejumlah besar kerang untuk studi genetika populasi.