LAPORAN PENDAHULUAN PRAKTIKUM TEKNIK BIOPROSES INOKULASI (PENAMAAN DAN PERHITUNGAN MIKROBA) Identitas praktikan Nama NIM Kelompok

I. II. Nama Percobaan Tujuan Percobaan : : DEASY PUSPITA SARI : 03101403065 : TIGA(3) / KAMIS 08.00-10.00 WIB : Inokulasi (Penamaan dan Perhitungan Mikroba) :

1. Untuk mengetahui cara pembiakan jamur pada medium padat 2. Dapat menghitung bayaknya jumlah mikroba dengan menggunakan alat Haemacytometer. 3. III. Dasar Teori A. Inokulasi Untuk mendapatkan satu spesies saja dalam satu piaraan bakteri, maka perlulah diadakan suatu piaraan murni (pure culture). Caranya dengan mengambil sample dari udara, tanah ataupun dari kotoran. Inokulasi adalah pekerjaan memindahkan bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru dengan tingkat ketelitian yang sangat tinggi. Untuk melakukan penanaman bakteri (inokulasi) terlebih dahulu diusahakan agar semua alat yang ada dalam hubungannya dengan medium agar tetap steril, hal ini agar menghindari terjadinya kontaminasi Jika disebarkan pada medium yang steril akan tumbuh beraneka koloni yang masing-masing mempunyai sifat-sifat yang khas. Dan kalau kita mengambil bahan dari salah satu koloni tersebut dan ditanam pada medium yang steril, maka bahan itu akan tumbuh menjadi kooni yang murni, asal pekerjaan pemindahan itu dilakukan dengan cermat menurut teknik aseptic. Piaraan ini dapat disimpan , tetapi tiap-tiap saat tertentu harus diadakan peremajaan dengan memindahkannya ke medium baru. :

Untuk mengamati sifat-sifat suatu koloni, maka perlu ditumbuhkan pada medium padat agar, agar sifat-sifatnya tampak jelas dan dapat dilihat dengan pandangan biasa tanpa menggunakan mikroskop (pengamatan mikroskopi). Ada empat cara menumbuhkan bakteri pada medium padat, yaitu: a. Piaraan lempengan (plate atreak culture), yang diperoleh dari menggesekgesekan ujung kawat inokulasi yang membawa bakteri pada permukaan agaragar lempengan dalam cawan petri sampai meliputi seluruh permukaan. b. Piaraan miring (slant culture), yang diperoleh dengan cara mengesek-gesekkan ujung kawat inokulasi yang membawakan bakteri pada permukaan agar-agar miring. c. Piaraan tusukan (stab culture), yang diperoleh dengan cara menusukan ujung kawat inokulasi yang membawa bakteri dalam agar-agar pada tabung reaksi sedangkan permukaan agar ini tidak miring. d. e. Piaraan adukan (shake culture), yang diperoleh dengan cara mencampur adukan setetes suspensi bakteri kedalam medium yang masih cair (belum membeku). Piaraan satu sel, menggunakan alat yang disebut mikropipet. Alat ini dapat memungut satu bakteri dari sekian banyak, dengan tiada ikutsertanya bakteri lain. Mikropipet ditempatkan pada tangan-tangan suatu micromanipulator. Dengan mikropipet dibuat beberapa tetesan bergantung pada suatu kaca penutup. Pekerjaan ini dilakukan dibawah obyektif mikroskop. Jika tampak suatu tetesan hanya mengandung satu bakteri, maka dengan mikropipet, tetesan tersebut dipindahkan ke suatu medium encer dengan maksud supaya bakteri berbiak dulu. Kemudian disini dapat diperoleh piaraan murni. Metode ini sangat memerlukan kesabaran, lagipula micromanipulator itu sangat mahal. f. Inokulasi hewan, Metode ini didasarkan pada semua bakteri dapat tumbuh di dalam tubuh seekor hewan dinamakan piaraan Pneumococcus murni. Inokulasi dapat dilakukan didalam kulit (intracutaneous), dapat dibawah kulit (subcutaneous), dapat di dalam otot(intramuscular), dapat didalam rongga tubuh atau tempat yang lain.

Sifat-sifat suatu koloni adalah sifat-sifat yang ada sangkut pautnya dengan bentuk, susunan, permukaan atau pengkilatan dan lain sebagainya. Agar sifat tersebut tampak jelas maka bakteri perlu ditumbuhkan pada medium padat. Sifat-sifat yang perlu diperhatikan pada koloni yang tumbuh dipermukaan medium padat ini adalah : a. b. c. d. e. f. g. Besar kecilnya koloni. Ada koloni yang berupa titik saja, ada yang melebar keseluruh permukaan. Bentuk. Bentuk koloni bermacam-macam, ada yang bulat, memanjang, teepinya rata atau tidak rata. Kenaikan permukan. Ada koloni yang rata dengan permukaan dan ada yang timbul. Halus kasar permukaan pada koloni. Wajah permukaan. Permukaan koloni ada yang berwarna mengkilap dan ada juga yang berwarna suram. Warna. Kebanyakan koloni ada yang berwarna putih kekuning-kuningan, tetaapi ada juga yang berwarna coklat, kehitaman, jingga biru, ungu dan hijau. Kepekatan. Ada koloni yang lunak, ada yang keras dan juga ada yang kering. Sifat-sifat koloni yang tumbuh pada agar-agar lempengan, miring, dan pada tusukan gelatin, antara lain yaitu : 1. Agar-agar Lempengan. Bentuk koloninya dilukiskan dalam bentuk titik-titik, bulat, berbenang, tak beraturan, serupa akar dan serupa kumparan. Permukaan koloni dapat datar, timbul mendatar, timbul melengkung, membukit, mencembung dan berupa kawah. 2. Agar-agar Miring. Bentuk-bentuknya ada yang berupa tasbih, pedang, duri, akar, batang dan berupa titik-titik. 3. Agar-agar Tusukan. Bentuk koloni yang dapat mengencerkan gelatin bila dilihat dari samping dapat berupa pedang, tasbih, bertonjol-tonjolan dan ada yang berjonjot, serupa batang.

Sedangkan bentuk koloni yang tidak dapat mengencerkan dapat berupa kawah, serupa mangkuk, corong, pundi-pundi dan berlapis. Sifat-sifat koloni pada medium cair memperlihatkan permukaan yang serabut, cincin, langit-langit atau selaput. Medium cair ini dapat dibuat dengan tidak menambahkan atau mencampurkan agar-agar atau gelaaatin ke dalamnya. Piaraan murni yang sudah disimpan bertahun-tahun itu mudah sewkali mengalami mutasi. Jika hal ini sampai terjasi, maka piaraan itu bukan lagi merupakan piaraan yang murni (kehilangan tipe aslinya). Untuk menghindarkan atau paling sedikit mengurangi terjadinya mutasi dalam piaraan simpanan, maka perlu dilakukan langkah-langkah sebagai berikut : a. b. c. Pada waktu-waktu tertentu piaraan dipindahkan ke medium yang baru. Piaraan disimpan didalam tempat yang bersuhu rendah dan terhindar dari radiasi. Bakteri diliofilisasikan, yaitu dengan dimasukan didalam ampul berisi susu kering bercampur dengan CO2, kemudian ddisimpan ditempat yang dingin. Pengukuran kuantitatif populasi mikroba seringkali sangat diperlukan dalam berbagai macam penelahaan mikroorganisme. Pada hakekatnya terdapat dua macam pengukuran dasar, yaitu: 1. Penentuan jumlah sel 2. Penentuan massa sel Penentuan atau pengukuran jumlah sel biasanya dilakukan untuk organisme bersel tunggal (misalnya bakteri), sedangkan penentuan massa sel dapat dilakukan bukan hanya untuk organisme bersel tunggal, tetapi juga untuk organisme berfilamen (misalnya kapang). Ada berbagai cara untuk mengukur jumlah sel antara lain: 1. Hitungan cawan (palt count) atau pengenceran 2. Hitungan mikroskopis langsung (direct microscopic count) atau penggunaan ruang hitung 3. Secara elektronis dengan bantuan alat yang disebut penghitung coulter (coulter Counter)

4. Penggunaan turbidometer / nefelometer Cara lain untuk mengukur jumlah sel antara lain dengan penyaring sampel dengan suatu saringan membran, lalu diinkubasikan pada permukaan medium yang sesuai. Jasad-jasad renik yang tertahan pada permukaan saringan menyerap nutrien dari medium dan menghasilkan koloni-koloni yang masing-masing berasal dari satu sel tunggal yang dapat hidup. 1. Hitungan Cawan (Pengenceran) Dengan pengenceran, disiapkan beberapa buah tabung berisi aquadest steril sebanyak 9 ml. Masing-masing tabung kemudian ditambahkan 1 ml sampel yang akan diperiksa secara bertahap, yaitu : 1. 1 ml sampel ke dalam tabung pertama, sehingga konsentrasi larutan di dalam tabung pertama menjadi 10-1. 2. 1 ml dari tabung pertama ke tabung kedua, sehingga konsentrasi tabung kedua menjadi 10-2. 3. Dan seterusnya sampai mencapai larutan dengan konsentrasi terendah. Dari tiap-tiap tabung kemudian diambil 1 ml larutan dan ditanamkan ke dalam cawan petri berisi media padat. Pertumbuhan koloni yang kemudian timbul pada tiaptiap cawan dihitung. Cara perhitungan ini harus memperhitungkan faktor kerapatan pertumbuhan koloni, karena jika pertumbuhan koloni terlalu rapat biasanya sulit untuk dipertanggungjawabkan hasilnya. Juga untuk pertumbuhan yang terlalu jarang sehingga diperlukan adanya pemilihan cawan yang ditumbuhi koloni yang paling tinggi kemurniannya untuk dihitung. 2. Hitungan Mikroskopis Langsung Pada metode mikroskopis langsung, sampel diletakkan di ruang hitung (seperti hemasiotomeyer) dan jumlah sel dapat ditentukan secara langsung dengan bantuan mikroskop. Pada metode ini, hasil pengenceran tidak ditanamkan pada media, tetapi diteteskan ke dalam ruang hitung. Selanjutnya diperiksa di bawah mikroskop

terhadap mikroba yang terdapat pada kolom perhitungan. Misalnya didapatkan jumlah yang terhitung 12 sel, maka perhitungan jumlah sel adalah: Jumlah Sel Dimana: 12 25 50 103 memerlukan = = = = banyak Jumlah sel yang terhitung. Jumlah kotak pada ruang perhitungan. Volume tiap-tiap kotak. Pengenceran sampel. peralatan. Namun kelemahannya adalah tidak dapat = = 12 x 25 x 50 x 103 1,5 x 107 sel/ ml

Keuntungan metode ini adalah pelaksanannya yang cepat dan tidak membedakan sel-sel yang hidup dan yang mati. Dengan kata lain hasil yang diperoleh adalah jumlah total sel yang ada dalam populasi. Sel mati akan menyerap warna biru, sedangkan sel hidup mereduksi zat warna tersebut secara enzimatif menjadi tidak berwarna, jadi sel-sel akan tampak biru. Kelemahan lain dari metode hitungan mikroskopis langsung adalah sulitnya menghitung sel yang berukuran kecil seperti bakteri, karena ketebalan hemasitometer tidak memungkinkan. Hal ini biasanya dapat diatasi dengan mewarnai sel sehingga mudah dilihat. Kelemahan lainnya adalah kadang-kadang sel cenderung bergumpal, sehingga sukar untuk membedakan sel-sel individu. Cara mengatasinya adalah dengan menceraiberaikan gumpalan sel tersebut dengan menambahkan bahan anti gumpal, seperti Dinatrium etilamina tetra asetat dan tween sebanyak 0,1 %. 3. Penggunaan Nefelometer / Turbidometer Cara ini merupakan perhitungan kerapatan materi (sel) di dalam larutan, yang diberi cahaya. Kualitas bias cahaya yang dilkakukan identik dengan kerapatan materi sel yang berada dalam larutan.

4.

Haemacytometer Haemacytometer adalah alat khusus yang digunakan untuk menghitung

mikroorganisme. Pada alat ini terdapat kotak-kotak kecil dengan luas 1 / 400 mm2 dan kedalaman 0,1 mm. Penggunaannya adalah dengan meletakkan kaca preparat yang di atasnya dan ditutup dengan deck glass. Pengamatan ini dilakukan dengan menggunakan mikroskop agar dapat mengamati sel-sel mikroba baik yang kecil maupun yang besar, yang dibatasi oleh kotak-kotak haemacytometer. Perhitungan dengan haemacytometer ini merupakan perhitungan langsung karena sample langsung diambil dan diteteskan pada alat haemacytometer dan diamati di bawah mikroskop. Perhitungan dengan metode ini mempunyai beberapa keuntungan, yaitu semua sel mikroba baik yang masih hidup atau pun sudah mati dapat dihitung. Sedangkan kelemahannya yakni apabila pengenceran tidak homogen lagi, maka akan terjadi kesalahan dalam perhitungan. Pengenceran yang dilakukan bertujuan untuk memudahkan pengamatan karena sample kental dapat menjarangkan sel mikrooranisme yang mengakibatkan pengamatan menjadi sulit dilakukan. B. Biakan Murni Suatu biakan/piaraan murni yang disimpan bertahun-tahun mudah sekali mengalami mutasi. Dan jika hal ini terjadi, maka piaraan ini bukan lagi biakan/piaraan yang murni karena telah kehilangan tipe aslinya. Untuk menghindari atau mengurangi terjadinya mutasi pada biakan/piaraan murni tersebut, maka perlu dilakukan hal-hal di bawah ini : a. b. c. Pada waktu-waktu tertentu biakan/piaraan dipindahkan ke medium yang baru. Biakan/piaraan disimpan di dalam tempat yang bersuhu rendah dan terhindar Dari radiasi. Bakteri diliofilisasikan, yaitu dimasukkan dalam ampul berisi suhu kerig bercampur dengan CO2, kemudian disimpan di tempat yang dingin.

Ada piaraan yang sewaktu-waktu perlu diremajakan tiap dua atau tiga bulan sekali. Untuk meremajakan itu caranya yaitu piaraan perlu dipindahkan ke medium baru pada suhu biasa yaitu antara 25 - 27 oC yang kemudian dimasukkan dalam lemari es untuk diperbarui dua atau tiga bulan lagi. Sedangkan untuk penyimpanan dengan cara diliofilisasikan asal selalu ada dalam 4oC. C. Fermentasi Fermentasi merupakan proses perubahan kimia dalam bahan pangan yang disebabkan oleh enzim. Enzim berperan ini berasal dari mikroba atau jasad renik yang digunakan dan dikenal sebagai ragi alkohol. Melalui fermentasi diperoleh produk yang mempunyai nilai gizi, biologis, serta cita rasa dan aroma yang lebih baik dibandingkan dengan bahan asalnya. Hal ini dikarenakan dalam ragi terdapat mikroba yang mengandung komponen seperti protein, karbohidrat, lemak, mineral dalam jumlah tertentu. Proses fermentasi secar sederhana dapat dilihat sebagai berikut : C6H12O6
Sc

2C2H5OH + 2 CO2

Sc : Sacharomyces cereviseae Fermentasi adalah proses oksidasi biologi dalam keadaan anaerob. Sebagai substrat pada umumnya karbohidrat. Dalam proses fermentasi yang bekerja sebagai pembawa hidrogen atau elektron biasanya hanya NAD dan NADF; sedangkan sebagai akseptor hidrogen akhir adalah bahan organik. Bahan organik yang berfungsi sebagai akseptor hidrogen akhirnya pada umumnya adalah asam piruvat, sehingga sistem sitokhrom tidak diperlukan. Istilah fermentasi sering juga dipakai untuk menyatakan proses yang aerob pada proses-proses industri tertentu, penggunaan ini sebenarnya tidak tepat D. Starter Ragi pasar merupakan starter yang biasanya digunakan dalam fermentasi alkohol. Ragi merupakan suatu substrat yang terbuat dari tepung beras dengan beberapa macam rempah. Mikroba yang berperan ini adalah sejenis khamir (kapang). Spesies khamir yang dipakai adalah : Saccharomyces Cereviseae var. ellipsoideus,

Schizpsaccharomyces Pombe, dan Saccharomyces Anamensis untuk membuat alkohol. Spesies-spesies tersebut memenuhi syarat-syarat yang dibutuhkan untuk fermentasi alkoholik, yait : a. b. c. d. e. f. g. E. Mempunyai kecepatan fermentasi yang tinggi Mempunyai rendemen per unit substrat yang tinggi Toleran terhadap alkohol yang dihasilkan Tahan terhadap pH rendah Mempunyai karakteristik yang sama pada suhu inkubasi yang relatif tinggi Tahan terhadap sulfat, gula pada konsentrasi tinggi Sedikit memproduksi asam volatil

Substrat Substrat yang baik untuk fermentasi adalah substrat yang mengandung

komponen yang dibutuhkan seperti sumber C, N, vitamin dan mineral dalam jumlah yang cukup. Substrat ini dimasak terlebih dahulu dengan air (perbandingan 1:1) dan didihkan selama lebih kurang 15 menit. Pemasakan ini bertujuan agar memudahkan kerja enzim pemecah amilum untuk mengekstraksikan bahan yang terlarut menjadi gula dan dekstrin. Produk fermentasi yang terbentuk tergantung pada berbagai faktor antara lain 1. Jenis dan konsentrasi ragi 2. Lama fermentasi 3. Temperatur 4. PH 5. Konsentrasi substrat 6. Oksigen IV. Alat dan Bahan a. Alat :

1. Tabung reaksi 2. Jarum oase 3. Nyala bunsen 4. Cawan petri b. Bahan 1. Medium yang telah jadi 2. Kultur murni 3. Jarum/kawat 4. Alkohol V. Prosedur Percobaan : 1. 2. 3. 4. 5. 6. Siapkan tabung yang berisi jamur dan tabung medium. Panaskan jarum oase sampai berpijar dan diamkan sebentar. Buka sumbat tabung jamur, kemudian lewatkan dekat nyala bunsen. Ambillah jamur dengan menggunakan jarum oase. Buka sumbat tabung medium dan mulut tabung dilewatkan pada nyala api bunsen. Masukkan ujung jarum oase tadi yang telah membawa jamur dengan menggesek-gesekkannya pada permukaan medium dari kiri ke kanan dengan arah dari bawah ke atas medium. 7. 8. 9. Tabung medium kemudian disumbat lagi. Simpan tabung yang telah ditanami tadi. Amatilah bentuk jamur yang terjadi.