Apresentacao Final

Desenvolvimento de mtodo de HPLC
Apresentado por: Dr. Jeff Layne 13 de outubro de 2011
Parte 1. Teoria Geral da Cromatografia Parte 2. Fase Estacionria: Uma viso geral dos suportes de HPLC Parte 3. A seletividade em funo da fase mvel Parte 4. Cuidado e uso da coluna
O Processo da Cromatografia Lquida
Origem da Cromatografia Lquida

Cromatografia de Coluna:
Coluna vazia Partculas absorventes adicionadas A amostra carregada no topo da coluna O solvente adicionado para o topo da coluna A separao ocorre medida que as faixas se movem para baixo na coluna
Mikhail Tsvet, 18721872-1919
Bsico das Separaes Cromatogrficas

A separao de compostos por HPLC depende das interaes das molculas do analito com a fase estacionria e com a fase mvel
Fase mvel
Fase estacionria
O processo de separao
Analitos
Fase mvel Fase estacionria
O processo de separao
Fase mvel Polar/Aquoso
N
Benzo(a)pyrene
Ethyl sulfate
Fase Estacionria Apolar (ex: C18)
Interaes Hidrofbicas
Funil de separao
Fase orgnica
Benzo(a)pyrene Ethyl sulfate
Analito na fase aquosa Torneira
Mecanismos de interao
Em qualquer separao, quase nunca possvel obter um modo nico de separao. Em fase reversa, as principais interaes so as seguintes: 1. Interaes Hidrofbicas 2. Interaes Polares 3. Interaes Inicas Mtodo de desenvolvimento = Mudar as condies das fases estacionria e mvel para otimizar estas interaes e alcanar uma separao especfica. Tapentadol
OH
CH3 CH3 N CH3 CH3

9
CH3
CH3
Hidrofbica
OH
CH3 3 Interaes fracas e progressivas entre uma fase estacionria no polar e as molculas
H C
CH3
CH3 N H3C CH3
Interaes hidrofbicas e van Der Waals A reteno ser prevista pelos valores de Log P
H 3C O Si H 3C HO O OH Si O HO Si
Si H C Si 3 CH3 C H 3O O Si O OH O
OH
OH Si O O HO
H 3C S i O Si
H 3C C HO 3 Si
Si
CH3 O Si
CH3 Si CH3 CH3 OH OH
Si O OH
Si OH
O OH
O OH
10
Interaes Polares
CH3
CH3
Polar
H3C CH3 N H3C
CH3 3 Interaes entre grupos funcionais polares dos analitos e os silanis residuais e os grupos polares do mdia
H C
Interaes com Hidrognio e Dipolo-Dipolo. Relativamente fraca e progressiva
H3C
HO
OH
OH Si O O HO
H 3C S i O Si
H 3C C HO 3 Si
Si
CH3 O Si
Si O OH
Si OH
O OH
O OH
11
Interaes de Troca Inica

CH3
CH3
CH3 3 Interaes entre grupos funcionais ionizveis do analito e contracarga na fase estacionria.
H C
Troca inica
OH
Troca inica Interaes fortes e lentas
CH3 H3C
+
H3C
HN
CH3
OH
OH Si O O HO
H 3C S i O Si
H 3C C HO 3 Si
Si
CH3 O Si
Si O OH
Si OH
O OH
O OH
12
Medidas cromatogrficas
13
Medidas cromatogrficas
14
Asym
O volume morto
Os analitos, que no interagem com o absorvente, eluem da coluna com um volume igual ao volume morto da coluna. O volume morto da coluna a quantidade da fase mvel na coluna entre as partculas e nos poros das partculas porosas.
A fase mvel ocupa o espao entre as partculas ou o volume intersticial.
A fase mvel enche os poros das partculas porosas.
15
O volume morto
Um composto que no interage com o adsorvente de forma alguma elui no que denominado o volume morto ou a frente do solvente. O tempo que leva os compostos no retidos o tempo do volume morto ou t0.
volume morto frente do solvente t0
16
Fator de reteno (k)

O fator de reteno (capacidade )do composto seu volume de eluio (tempo) relativo ao volume de eluio (tempo) de um composto no retido. O valor k de um determinado analito ser determinado por sua afinidade relativa para a fase estacionria e para a fase mvel. Fator de reteno (k)=
tR t0 t0 t0
17
Fator de reteno (k)

Para qualquer analito determinado, o valor k ser facilmente modificado ao ajustar a % da fase mvel forte (ex: metanol ou ACN).
Exemplo: A Separao de Esteroides:

Colunas usadas: C18(2) 150 x 4,6 mm
18
Efeito da mudana de % orgnica
19
Assimetria de Pico
O valor de assimetria (Asym) para um pico uma medida da divergncia do pico a partir de uma forma perfeita do pico de Gauss. Os picos com valores de assimetria maiores do que 1,0 so conhecidos como de alargamento, aqueles com valores de assimetria menores do que 1,0 so conhecidos como frente. Os picos assimtricos podem ser atribudos a um nmero de fatores: (1) Interaes fortes secundrias(ex: interaes inicas entre compostos bsicos e silanis residuais) (2) Sobrecarga de amostra (3) Incompatibilidade do solvente da amostra (4) Empacotamento ruim
20
Alargamento de picos devido as interaes secundrias

O alargamento de picos em mtodos de fase reversa mais comumente devido as interaes inicas fortes entre os analitos bsicos e os silanois residuais na superfcie da slica.
CH3
CH3
CH3
H 3C
Troca de ons
OH
CH3 H 3C HN
+
H 3C
CH3
OH
OH Si O O HO
H 3C S i O Si
H 3C C HO 3 Si
Si
CH3 O Si
Si O OH
Si OH
O OH
O OH
21

Exemplo: A separao de antidepressivos tricclicos:
Colunas usadas: Coluna A C18 50 x 2,1 mm Coluna B C18 50 x 2,1mm
Amitriptyline (pKa 9,4)
Nortriptyline (pKa 9,7)
Protriptyline (pKa 8,2)
22

Coluna A C18 50x2,1mm
Alargamento de picos
1
Coluna B C18 50x2,1mm

Max. 1.2e5 cps.
): 264.2/191.1 Da ID: Protrip from Sample 28 (Halo C18-50x2, 2.7 um, MeOH:0.1% ...
Max. 1.1e5 cps. XIC of +MRM (8 pairs): 278.2/191.2 Da ID: Amitrip from Sample 7 (TCA-Kin-XB-C18, 50x2, 2.6, MeOH 50.... 1 5 5 4 1 4
6 2 3 7
3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 Time, min 4.4 4.6 4.8 5.0 5.2
8
5.4 5.6 5.8 6.0
3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 Time, min
2
4.4
3
4.6
7
4.8
8
5.0 5.2 5.4 5.6 5.8 6.0
): 264.2/191.1 Da ID: Protrip from Sample 28 (Halo C18-50x2, 2.7 um, MeOH:0.1% ... 4
Max. 1.1e5 cps. from Sample 13 (Kinetex XB-C18-50x2, 2.6 um, MeO... XIC of +MRM (8 pairs): 264.2/191.1 Da ID: Protrip
4
Max. 1.2e5 cps.
3.4
3.6
3.8
4.0 4.2 Time, min
4.4
4.6
4.8
5.0
5.2
5.4
5.6
5.8
6.0
3.4
3.6
3.8
4.0 4.2 Time, min
4.4
4.6
4.8
5.0
5.2
5.4
5.6
5.8
6.0
23
Fase mvel: A = 0,1% cido frmico em gua, B = 100% Metanol, Gradiente: 15 a 60% B em 5 min, retido por 1 min Fluxo: 400 L/min 1. Amoxapine 2. Imipramina 3. Desipramine 4. Protriptyline* 5. Amitriptyline 6. Nortriptyline* 7. Clomipramine 8. Norclomipramine
Alargamento de picos devido a sobrecarga

Os analitos fortemente bsicos so muito sensveis carga de amostra, e exibiro efeitos de alargamento de pico como uma funo da carga crescente (g na coluna):
DAD1 C, Sig=254,4 Ref=300,100 (DJ040611\DJGSK 2011-04-06 12-28-48\GSK000006.D) m AU 1 4 .2 0 8 30 25
20
2,5 g na coluna; Alargamento USP = 1.17
15
pKa 9,7
10
0 12 12.5 13 13.5 14 14.5 15 15.5 16 16.5 m in
DAD1 C, Sig=254,4 Ref=300,100 (DJ040611\DJGSK 2011-04-06 12-28-48\GSK000008.D) m AU 1 4 .1 6 9
50
40
5 g na coluna; Alargamento USP = 1,34
30
20
10
0 12 12.5 13 13.5 14 14.5 15 15.5 16 16.5 m in
100
80
60
40
20
0 12 12.5 13 13.5 14 14.5 15 15.5 16 16.5 m in
24
Frente do pico devido a sobrecarga

Os compostos neutros e cidos geralmente mostraro frente do pico quando a coluna est sobrecarregada.
Saturao do detector !
DAD1 A, Sig=240,10 Ref=off (MT042211\DJGSK 2011-04-22 09-12-57\MUPIROCIN000001.D) mAU 2250 2.495
2000
1750
1500
Frente devido a sobrecarga
1250
1000
750
500 1.905 2.145 1.8 1.9 2 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 min
250 1.745 0
25
Frente do pico devido aos efeitos do solvente

O frente do pico tambm pode ocorrer devido aos efeitos dos solventes da amostra: (1) Insolubilidade da amostra (2) O solvente da amostra muito forte:
Amostra em 50% Metanol 7 .4 e 4
7 .0 e 4 6 .5 e 4 6 .0 e 4 5 .5 e 4 5 .0 e 4 4 .5 e 4 4 .0 e 4 1 .2 e 5 3 .5 e 4 3 .0 e 4 2 .5 e 4 2 .0 e 4 1 .5 e 4 1 .0 e 4 5 0 0 0 .0 0 .0 1 .0 e 5 8 .0 e 4 6 .0 e 4 1 .8 e 5
Amostra em 100% Metanol 2 .4 e 5

2 .2 e 5 2 .0 e 5
Hydromorphone
Eluio mais rpida ! 1 .4 e 5

1 .6 e 5
Frente
0 .2 4
Morphine
1 .0 6
4 .0 e 4
Norhydrocodone 1 .7 7
1 .5 2 .0 2 .5 3 .0 3 .5 4 .0
1 .3 6
2 .0 e 4
1 .7 9 1 .7 1
0 .9 7 0 .5 1
0 .5 1 .0 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5
1 .8 5 2 .1 5
2 .0 2 .5 3 .0
3 .2 13 .3 6
3 .5
3 .9 7
4 .0
26
Seletividade ( ()
A seletividade uma medida da diferena na interao de dois compostos com a fase estacionria. A seletividade uma funo tanto da fase estacionria quanto da fase mvel.
= k2/k1
27
Seletividade ( ()
A escolha da fase estacionria geralmente causar um efeito radical sobre OH a seletividade dos analitos. CHO CH
3
H H HO Estrone
m A U
H
H
H HO Estradiol
1 7 5
Coluna C18
1+2
1 5 0
1 2 5
1 0 0
= 1,0
7 5
5 0
2 5
0 1 2 3 4 5 m in
m A U
1 0 0
Coluna Phenyl
1 2
8 0
6 0
= 2,3
4 0
2 0
0 1 2 3 4 5 m in
28
Seletividade ( ()
Porm a fase mvel uma ferramenta muito poderosa para ajustar a seletividade.
Coluna: Gemini C6-phenyl de 5 m 150 x 4,6 mm Fase mvel: 20mM KH2PO4, pH 2,5; % orgnica como observado Fluxo: 1,0 mL/min Deteco: UV em 220nm 1. Saccharin 2. p-Hydroxybenzoic Acid 3. Sorbic Acid 4. Dehydroacetic Acid 5. Methylparaben
35% Metanol
20% Acetonitrila
29
Eficincia da coluna (N)

A amostra injetada numa banda estreita, que, em seguida, entra no leito da coluna. Os picos tornam-se mais amplos como uma funo de parmetros variveis, incluindo: O tamanho das partculas Como as partculas so empacotadas na coluna Morfologia das partculas
w1/2
tR
Banda de amostra injetada
30
Eficincia da coluna (N)

O valor do alargamento da banda (pico) ou disperso que ocorre na coluna medida pelo clculo da eficincia da coluna (N) expressa como o nmero de pratos tericos
tR
As colunas que causam um importante alargamento do pico possuem poucos pratos tericos. As colunas que produzem picos muito estreitos (alargamento de pico baixo) tm um grande nmero de pratos tericos.
W1/2
W 31
Largura do pico (W)
A equao de Van Deemter

Os trs fatores principais que causam um alargamento e uma diminuio na eficincia da coluna so descritos pela equao de Van Deemter:
*
e e
Verso simplificada:
H = A dp + B/ + C de2
Tamanho da partcula Tamanho da partcula Velocidade linear (Fluxo) Transferncia de massa
Velocidade linear (Fluxo) Viscosidade da fase mvel

32
Efeito do tamanho da partcula na eficincia

A eficincia de uma coluna bem condicionada ser uma funo de diversos fatores, um dos quais ser o tamanho da partcula. Conforme o tamanho da partcula diminui, a eficincia aumenta. Alm disso, a presso tambm aumenta conforme o tamanho da partcula diminui. 10 m 50.000 P/m 5 m 100.000 P/m 3 m 150.000 P/m Core-Shell 300.000 P/m Sub-2 m 300.000 P/m
Eficincia Presso
33
Efeito do tamanho da partcula na eficincia

5 m w1/2 N = ~100.000 pratos/m Presso relativa = 1
3 m
w1/2
N = ~150.000 pratos/m Presso relativa = 2x
Core-Shell
w1/2
N = ~300.000 pratos/m Presso relativa ~3x
Sub-2 m
34
w1/2
N = ~300.000 pratos/m Presso relativa >4x
Efeito do comprimento da coluna sobre a eficincia

Para um tamanho especifico de partcula, a eficincia da coluna ser diretamente proporcional ao comprimento da coluna. Porm, a presso e o tempo de eluio tambm sero diretamente proporcionais ao comprimento da coluna. 5 cm 5.000 Pratos 8 min 50 Bar 10.000 Pratos 16 min 100 Bar 15.000 Pratos 24 min 150 Bar 25.000 Pratos 40 min 250 Bar
10 cm
15 cm
25 cm
35
Equilibro entre o comprimento da coluna e o tamanho de partcula

Column Length Coluna (mm) 250 150 100 50 Efficiency Eficincia dp 5m 25,000 15,000 10,000 5,000 Efficiency Eficincia dp 3m 37,500 22,500 15,000 7,500 45,000 30,000 15,000 33 60 80 Efficiency Eficincia sub-2m / Core-shell Reduo no tempo de anlise (%)
*Use colunas empacotadas com partculas menores para reduzir o tempo de analise enquanto mantm/melhora a eficincia !!
36
Efeito do fluxo sobre a eficincia

A eficincia tambm uma funo do fluxo da fase mvel. Todas os tipos de recheio tero um fluxo timo, o que uma funo do tamanho da partcula partculas menores tm fluxo timo maior.
a b
37
Fluxo zero
w1/2
Fluxo muito baixo
6
tR
w1/2
Fluxo timo (ideal) ou maior
5
tR
38

Efeito a eficincia da coluna (100x4,6mm) Efeitodo dafluxo taxa sobre de fluxo sobre a eficincia da coluna (100x4,6mm)
35000
CoreCore-Shell ~2 mL/min
30000
CoreCore-Shell 2,6 2,6 Core-Shell 2.6 Totalmente 3 Luna 3uporoso 3
25000
N (Plates/column)
3 ~1,5 mL/min
Totalmente 5 Luna 5uporoso 5
20000
15000
10000
5 ~1 mL/min
5000
0 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 Flow rate (ml/min)
39
Resumo
As medies cromatogrficas que discutimos at agora iro desempenhar um papel significativo no desenvolvimento do mtodo. 1. Fator de reteno (k) (k) reteno de analito relativo ao tempo morto t0 Controlado pelos ajustes da % da fase mvel forte 2. Assimetria de pico forma do pico (de frente, alargamento, simtrico) Resultado das interaes secundrias (ex: inicas no modo RP) Sensvel a carga de amostras e efeitos do solvente da amostra 3. Seletividade () diferena no k de dois analitos Ser determinado pela composio da fase mvel e da natureza da fase estacionria 4. Eficincia (N) funo da largura do pico e reteno Determinada pelo tamanho da partcula, o comprimento da coluna e o fluxo O empacotamento da coluna afetar a eficincia (fornecedor)
40
Resoluo: A Meta da Cromatografia
41
O objetivo e a finalidade da cromatografia lquida separar os componentes individuais de uma amostra, de modo que eles possam ser identificados e/ou quantificados.
42

A resoluo uma medida de como dois picos so separados um do outro.
Ela calculada como a diferena de tempo de reteno de dois picos eludos divididos pela largura mdia dos dois picos na linha de base.
R (resoluo) = RTB - RTA / .5 (larguraA + larguraB)
43
(1) O tempo de reteno para os dois picos ser uma funo do fator de reteno (k). (1) A seletividade () tambm afetar os valores do tempo de reteno para os dois picos. (1) A largura do pico ser uma funo da eficincia da coluna (N) e da assimetria (Asym (Asym). Asym).
N, Asym
44

A equao abaixo permite-nos calcular a importncia relativa de cada um destes trs fatores na resoluo geral:
Eficincia Fator de reteno
Seletividade
importante observar que voc (o analista) tem controle sobre cada um desses fatores por meio da sua escolha da coluna HPLC e as condies de analises:
1. 2. 3.
45
Eficincia (N) tamanho da partcula/morfologia e comprimento da coluna Seletividade () Fase estacionria e fase mvel Fato de reteno (k) Fase estacionria e fase mvel
O efeito de k, e N na resoluo
Determinante mais importante da resoluo!!
Aumento constante na resoluo
Ineficiente aps k ~10
46
Impacto de eficincia sobre a resoluo

Mudar a eficincia da coluna uma forma muito eficaz de otimizar a resoluo. H uma correlao forte e linear entre N e Rs, mas no uma relao 1:1. A eficincia da coluna uma ferramenta flexvel, pois podemos facilmente modific-la por meio de mudanas no tamanho da partcula e comprimento da coluna. Comprim ento da coluna (mm) Tempo de corrida maior Presso mais alta
47
Eficincia 5m 25,000 15,000 10,000 5,000
Eficincia 3m 37,500 22,500 15,000 7,500
Eficincia sub-2 m / Core-shell
250 150 100 50
45,000 30,000 15,000
Eficincia/resoluo maior Presso mais alta
Impacto de eficincia sobre a resoluo

2.5
Relative Resolution
O aumento por 2 da eficincia da coluna aumenta Rs por um fator de 1,4x
1.5
0.5
0 0 10000 20000 30000 40000
Column Efficiency (Plates)

48
Otimizar a eficincia para uma resoluo mxima

1. Para o desenvolvimento do mtodo, comece com um comprimento intermedirio de coluna, empacotada com o menor tamanho de partcula que as limitaes de presso do sistema permitiro. HPLC convencional 3 m 150x4,6mm ou corecore-shell 100x4,6mm UPLC subsub-2 m ou partcula corecore-shell Opera no fluxo timo para aquele tamanho de partcula 2. Ajuste para uma produtividade mxima: Resoluo excessiva coluna menor, aumente o fluxo Resoluo insuficiente coluna maior; modificar o fluxo para compensar o aumento de presso
49
O Efeito do Fator de Reteno na Resoluo

O fator de reteno o mais importante, porm limitado ao determinar a resoluo. importante ter um valor razovel de k, porque os analitos devem ser mantidos de modo a separ-los. A desvantagem que ha valores elevados de k', a difuso passiva provoca uma extensa ampliao de banda e perda de desempenho.
50
Otimizando o Fator de Reteno

1. Ajustar o valor k' para que fique entre 2 e 10. Em RP, ajustar a % de orgnicos (acetonitrila ou metanol) Alterar a natureza da fase estacionria / da mdia pode modular k' tambm Ex: C18 contra C8 far a transferncia em valores k' 1. Em k < 2, obtenha resoluo sub-tima Tambm pode ter interferncia de solvente, componentes no-retidos 1. Em valores k > 10, ampliao de banda ocorre devido a difuso limitar o ganho de resoluo Em RP, misturas complexas de componentes polares e no polares exigir o melhor desempenho / equilbrio do tempo de execuo do gradiente As fases estacionrias polares podem diminuir a "janela de eluio total" das misturas complexas no modo isocrtico
51
O Impacto da Seletividade na Resoluo

Pequenas mudanas na seletividade podem ter um efeito radical sobre a reteno. Este um dos motivos porque as mesmas fases estacionrias de 2 fabricantes podem, s vezes, fornecer resultados muito diferentes e tambm porque as mudanas na composio da fase mvel podem alterar os resultados de forma to intensa.
52
Exerccio de Desenvolvimento de Mtodo 1: Otimizao para reduzir o tempo de anlise e aumentar a produtividade
53
Mupirocin: Perfil de Impureza

Coluna: Fase mvel: Fluxo: C8 250 x 4,6mm 5m 70 / 30 0,1M Acetato de amnio / THF
1,0 mL/min 1-6 = Impurezas A - G 7. Mupirocin
Compostos:
Mupirocin
54
Mupirocin: Mtodo Original

DAD1 A, Sig=240,10 Ref=off (Z:\1\DATA\MT050211\DJGSK 2011-05-02 15-34-44\MUPIROCIN000001.D) mAU 175
7 5
150
125
100
75
Rs 3/4 = 0,63 ; k = 2,3 1 2 34

0 2 4 6 8 10
50
~16min 6
25
0 12 14 16 min
Coluna: Fase mvel:
5 m C8(2) 250 x 4,6mm 70/30 0,1M Acetato de amnio pH 5,7/THF
Fluxo: 1,0 mL/min
55
Etapa 1: Ajustar k' para melhorar a resoluo
Etapa 1. Reduzir a % orgnica para aumentar k': Aumenta Rs Aumenta o tempo de corrida
56
Etapa 2. Otimizar o comprimento e o tamanho da partcula

Comprimento da coluna (mm) Eficincia sub-2 m / Core-shell Reduo de % no tempo de anlise
Eficincia dp 5 m
Eficincia dp 3 m
250 150 100 50
25,000 15,000 10,000 5,000
37,500 22,500 15,000 7,500 45,000 30,000 15,000 33 60 80
57
Etapa 2. Troca para um acoluna de150x4,6mm 3 m: Reduz o tempo de anlise Mantm a eficincia
Etapa 3. Otimizar o fluxo

35000
Core-Shell 2.6
30000
Luna 3u
25000 N (Plates/column)
Luna 5u
20000
15000
10000
5000
0 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 Flow rate (ml/min)
Etapa 3. Aumenta o fluxo para 1,5 mL/min: Otimizar a eficincia para partcula de 3 m
58
Mupirocin: Mtodo Intermedirio

VWD1 A, Wavelength=240 nm (JL050211\MUPI0003.D) mAU
7
80
60
40
k = 9; Rs 3/4 = 1,6 2 3 4
10 12
20 min 6
20
0 0 2 4 6 8 14 16 18 min
Coluna: Fase mvel: Fluxo:
3 m C8(2) 150 x 4,6mm 80/20 0,1M Acetato de Amnio pH 5,7/THF 1,5 mL/min
Rs aumentou de 0,63 para 1,6 Tempo de corrida aumentou de 16 para 20 minutos

59
Etapa 4. Trocar para as Partculas CoreCore-Shell

Compri mento da coluna (mm) 250 150 100 50 Eficincia dp 5 m Eficincia dp 3 m Eficincia sub-2 m / Core-shell Reduo no tempo de anlise (em %)
25,000 15,000 10,000 5,000
37,500 22,500 15,000 7,500 45,000 30,000 15,000 33 60 80
Etapa 4. Trocar para as particulas CoreCore-Shell 100x4,6 2,6 m : Reduz o tempo de anlise Aumenta a eficincia
60
Mupirocin: Mtodo Final Otimizado

7
250
200
150
1
100
Rs 3/4 = 2,3 8 min 4

4 5
50
0 0 1 2 3 6 7 8 9 min
CoreCore-Shell 2,6 m C8 100 x 4,6mm 80/20 0,1M Acetato de amnio pH 5,7:THF 1,5 mL/min (2ml/min se a presso permitir)
Rs aumentou de 1,6 para 2,3 Tempo de corrida diminuiu de 20 para 8 minutos

61
Mupirocin: Mtodo Final Otimizado

Mtodo inicial:
D A D 1 A , S i g= 240,1 0 R e f=o ff ( Z:\1 \DA T A \M T 050 211\ DJ G S K 201 1-0 5-0 2 15 -34 -44 \M U P IRO C IN00 0001 .D) m AU 1 75
1 50
5 Rs 3/4 = 0,63 1 2 34
0 2 4 6 8 10
1 25
1 00
75
16 min 6
12 14 16 m in
50
25
Mtodo final otimizado:

VWD1 A, Wavelength=240 nm (JL050211\MUPI0006.D) mAU 250
200
150
Rs 3/4 = 2,3 1 2
0 1 2 3
100
8 min 3 4
4 5
50
6
6 7 8 9 min
62
Fim da parte I
63
Parte 1. Teoria Geral da Cromatografia Parte 2. Fase Estacionria: Uma viso geral dos suportes de HPLC Parte 3. A seletividade em funo da fase mvel Parte 4. Cuidado e uso da coluna
64
Tecnologia de Partculas de HPLC

Partcula CoreCore-Shell
Partcula Totalmente Porosa
65
Slica Totalmente Porosa

Polimerizao
Alkaline
Tetraethoxysilane
Silica SolSol-Gel
99,9% da rea da superfcie reativa interna
66

H uma grande quantidade de variabilidade nas qualidades fsico-qumicas finais da slica em funo dos diferente fabricantes. Estas diferenas na prpria base da slica ajuda a explicar a grande variao no comportamento de marcas diferentes de colunas de HPLC. As variveis principais so: Forma da partcula (irregular contra esfrica) Pureza (contedo do metal) rea de superfcie Tamanho do poro Carga de carbono:
67

Vantagens: Disponibilidade com vrias tipos de fases ligadas Elevada resistncia mecnica Eficincia excelente Altamente receptivo variao das caractersticas dos materiais (tamanho de poro, rea de superfcie, etc.) Desvantagens: Dissoluo de slica a um pH >~7,5 (pode estender-se com a fase ligada) Hidrlise de fase ligada a um pH < 1,5
68
Partcula Hbrida de Organoslica

Partculas de slica convencionais
Ponte Siloxano
Partculas hbridas de organoslica

Ethane Ligao
Dissoluo em pH > 7,5
Estvel para pH ~12
69

Vantagens: Faixa de pH estendida de 1-12 Desempenho e resistncia de partcula de slica convencional Seletividade nica
Desvantagens: Menos fases estacionrias disponveis em comparao com a slica convencional (ex: ciano e amino)
70

LC/MS Anlise de nicotine e metabolites
GeminiGemini-NX 3 m C18 100 x 2,0mm
MP: Gradiente: Fluxo: 1. 2. 3. 4. 5. Nornicotine 3-OH-Cotinine Anabasine Cotinine Nicotine A = 10mM NH4HCO3 B = Acetonitrile 10-75 %B em 3 min 500 L/min
71
Tubo Poroso de Slica Monoltica

Vantagens: Presso extremamente baixa A estrutura macroporosa permite a injeo direta de amostras sujas Nenhum deslocamento e/ou instabilidade do empacotamento das colunas Desvantagens: Menos fases estacionrias Eficincia menor do que as partculas convencionais (< desempenho 3m)
72
Tubo Poroso de Slica Monoltica

Onyx C18 100 x 4,6mm 15 L injees de plasma humano; filtrado; sem PPT
1. H = Hypoxanthine 2. U = Uric acid 3. X = Xanthine 4. A = Adenosine 5. I = Inosine
73
Journal of Chromatography B, Volume 854, Edies 1-2, 1 de julho de 2007, Pginas 158-164
Camada porosa de 0,35 m
Partcula CoreCore-Shell de 2,6m
Ncleo slido de 1,9 m
74
CoreCore-Shell de 2,6 m: 2,6 m dimetro total da partcula Presso ~50% menor do que sub-2 m totalmente poroso Eficincia = 260 300,000 P/m Eficincia da UPLC usando sistemas de HPLC convencionais*
CoreCore-Shell UPLC 1,7 m: 1,7 m dimetro total da partcula Eficincia = 280 320.000+ P/m Mdia de maior eficincia atualmente disponvel
75
Tradicional 3 m C18 150 x 4,6 mm CoreCore-Shell 2,6 m C18 150 x 4,6 mm
N = 166.502 p/m
N = 295.343 p/m
Aumento da altura do pico
Agilent 1100
Agilent 1100
76
Totalmente porosa 1,7 m C18 50 x 2,1 mm 0,6 mL/min Eficincia = 272.080 p/m CoreCore-Shell 1,7 m C18 50 x 2,1 mm 0,6mL/min Eficincia = 318.680 p/m
CoreCore-Shell 2,6 m C18 50 x 2,1 mm 0,6mL/min Eficincia = 267.720 p/m
77
Vantagens: 3x a eficincia das partculas 5 m totalmente porosas e 2x a eficincia das partculas 3m Presso compatvel com os sistemas convencionais de HPLC* Desvantagens: A presso ainda maior do que as partculas de 3 m Mais sensvel aos extravolumes do sistema Mais sensvel a sobrecarga em alguns casos
78
Perfil de impureza da droga:
MP: A = 40mM KH2PO4 pH 7,2, B = Acetonitrile Gradiente: 5-35%B em 30min Fluxo: 0,2 mL/min
Totalmente poroso 1,7 m C18 150x2,1mm

0.06
0.04 AU 0.02 0.00
634 Bar
10.50
11.00
11.50
12.00
12.50
13.00
13.50 14.00 Minutes
14.50
15.00
15.50
16.00
16.50
17.00
CoreCore-Shell 2,6 m C18 150x2,1mm

0.06
372 Bar
0.04 AU 0.02 0.00 10.50 11.00 11.50 12.00 12.50 13.00 13.50 14.00 Minutes 14.50 15.00 15.50 16.00 16.50 17.00
79
Resumo
Partcula de Slica Totalmente Porosa: Uso geral Muitos tamanhos de partculas e fases estacionrias Pouca sensibilidade ao volume morto do sistema Partcula CoreCore-Shell Desempenho de UPLC usando sistemas convencionais de HPLC Deve ser a escolha para o desenvolvimento do mtodo no lugar dos suportes totalmente porosos Partcula Hbrida de Organoslica: Faixa de estabilidade de pH estendida Mesmas caractersticas de desempenho que a totalmente porosa tima para aplicaes de pH alto Tubo Monoltico: Baixa Presso; suscetibilidade entupimento reduzido Ideal para anlise de amostras "sujas" (ex: plasma) Eficincia de ~3um da slica esfrica totalmente porosa
80
Ligantes de Fase Reversa
81
Grupo de pesquisa Granick Universidade de Illinois na Campanha Urbana
Fases Ligadas
Uma vez que voc decidiu sobre o tipo de partcula de HPLC, a prxima deciso ser escolher uma fase estacionria apropriada. Esta escolha influenciar consideravelmente a seletividade final de sua separao.
Escolha da Fase Ligada: Ligada: Fases alkil Fases fenil Fases com grupos polares Escolha da tecnologia de partcula: partcula: Totalmente porosa CoreCore-Shell Tubo monoltico UPLC
82
O Processo de Ligao
HCl
1. Ligar o principal ligante da fase estacionria

83
2. EndEnd-Capped os silanis residuais
Classes de Fase Estacionria em Fase Reversa

Fases alkyl (C18, C8, C4): Fases com grupos polares:
Fuso
Fases Fenil (Penil, PFP):

F F
Fases com endcapping polares:
Hidro
F F F
84
Fases Alkyl
Modo primrio de interao
85
O principal mecanismo de reteno em cromatografia de fase reversa baseado nas interaes hidrofbicas entre os analitos e a fase ligada. Portanto, as fases que apresentam uma natureza fortemente hidrofbica oferece um bom desempenho.
CH3
CH3
CH3
OH
H 3C
CH 3 CH 3 N H 3C CH 3
Si H C Si 3 CH3 O C H 3O Si O OH O
OH
OH Si O O HO
H 3C S i O Si
H 3C C HO 3 Si
Si
CH3 O Si
Si O OH
Si OH
O OH
O OH
86
Seletividade de Metileno
Ns usamos o teste de seletividade de metileno para determinar a capacidade da fase estacionria para separar molculas com base nas diferenas no seu carter hidrofbico. De modo geral, as fases ligadas muito hidrofbicas (por exemplo, C18) iro exibir nveis mais elevados de seletividade de metileno do que as fases menos hidrofbicas.
m AU 250
C18 Phenyl
87
200 150 100 50 0

m A U 4 0 0
10
m in
3 0 0
2 0 0
1 0 0
0 2 4 6 8 1 0 m in
0.200
C18 > C8 > C5 Fenil > CN > Amino
0.180
0.160
Slope of log k vs. # -CH2 CH2- units
0.140
0.120
0.100
0.080
0.060
0.040
0.020
0.000
Luna C18(2)
Synergi Hydro-RP
Jupiter C18
Synergi Max-RP
Luna C8(2)
Luna C5
Luna Phe-Hex
Jupiter C4
Synergi Polar-RP
Prodigy Phenyl
Luna Cyano
Luna Amino
88
Colunas: 5m C18 150x4,6mm 5m C8 150x4.6mm 5m Fenil 150x4.6mm 65:35 Acetonitrila: gua 1 mL/min Dois esterides: 1. Testosterona 2. Metiltestosterona
OH CH3 CH3 H O Testosterone H H
Fase mvel: Fluxo: Componentes:
OH CH3 CH CH3 H O Methyltestosterone H H
89
Testosterone
MetMet-Testosterone
C18 Rs = 3,39 Seletividade alta
C8 Rs = 1,78 Seletividade mdia

90
Fenil Rs = 1,06 Seletividade baixa
Fases Fenil
As fases Fenil so consideravelmente menos hidrofbicas do que as fases C18, porm oferecem uma seletividade potencial que pode ser bastante diferente devido a capacidade da fase a oferecer interaes pipi-pi com os analitos. Ela deve ser considerada como uma seletividade complementar as fases alkil convencionais (ex: C18).
Modos de interao
F F
91
Seletividade Fenil
Enquanto as fases C18 se sobressaem ao separar molculas que diferem principalmente na natureza hidrofbica, a fase fenil, muitas vezes, exibe uma melhor capacidade para separar molculas que diferem nos grupos funcionais polares. Esta seletividade polar melhorada provavelmente atribuvel interao com a nuvem de eltrons Pi do anel fenil.
92
Seletividade Fenil
Colunas: C18 Fenil 150 x 4,6 mm 75:25 Metanol: gua 1 mL/min
OH CH3 H
H O CH3
Dimenses: Fase mvel: Fluxo:
Componentes:
1. Estrone 2. Estradiol
H HO Estradiol
H
HO
Estrone
93
Seletividade Fenil
OH CH3 H H HO H
HO H H H O CH3
C18
Estradiol
mAU
Estrone
175
C18
150
1+2
125
100
75
50
25
0 1 2 3 4 5 m in
Phenyl
mAU
100
Phenyl
1 2
80
60
40
20
0 1 2 3 4 5 m in
94
Fases com Grupos Polares

Os grupos de silanois residuais de qualquer suporte de fase reversa a base de slica oferece um grau de interao hidroflica. A presena de grupos funcionais polares adicionais (endcapping ou incorporados com o ligante) aumenta ainda mais as interaes com compostos polares. Estas fases so recomendadas por: a. Seletividade polar para alguns analitos b. Estabilidade com as fases mveis 100% aquosas c. Formato de pico melhorado para drogas bsicas
95
Estabilidade das Fases com Grupos Polares em Meio 100% Aquoso

Bases de cido Nuclico:
Luna C18(2)
Day 1
C18 com Endcapping Polar

Day 1
0 2 4 6 8 10 12
0
Day 2
10
12
Day 6
Colapso da fase!
0 2 4 6 8 10 12 14 min
0 2 4 6 8 10 12 14
96
Estabilidade das Fases com Grupos Polares em Meio 100% Aquoso

Anlise de ETG e ETS na urina: por LC/MS/MS
XIC of -MRM (6 pairs): 221.200/75.000 Da ID: ETG-1 from Sample 6 (P-2_Hyro-RP_100x4.6_4u_FR600... Max. 9020.0 cps.
C18 com Endcapping Polar 2.5 m 100x3,0mm 10mM Formato de amnio

I n t e n s it y ,c p s
1.00 e5 9.50 e4 9.00 e4 8.50 e4 8.00 e4 7.50 e4 7.00 e4 6.50 e4 6.00 e4 5.50 e4 5.00 e4 4.50 e4 4.00 e4 3.50 e4 3.00 e4 2.50 e4 2.00 e4 1.50 e4 1.00 e4 500 0.00 0.00 0 .5 49 1.0 96 1 .5 144 2.0 19 1 2.5 239 3.0 2 87 3.5 334 T im e, m in 4.0 3 82 4.5 429 5 .0 477 5.5 525 6 .0 572 6.5 62 0
ETS ETG
1. 2.
Ethyl glucuronide Ethyl sulfate
XIC of -MRM (6 pairs): 221.200/75.000 Da ID: ETG-1 from Sample 6 (P-2_Hyro-RP_100x4.6_4u_FR600...
Max. 9020.0 cps.
1.10 e4
ETG
I n t e n s it y ,c p s
1.00 e4
ETG
900 0.00
ETS
800 0.00
700 0.00
600 0.00
500 0.00
400 0.00
300 0.00
ETS
200 0.00
100 0.00
0.00 0 .5 49 1.0 96 1.5 1 44 2.0 191 2.5 2 39 3.0 287 3.5 3 34 T im e, m in 4.0 382 4.5 4 29 5.0 477 5.5 5 25 6.0 572 6.5 6 20
97
Maior Reteno dos Analitos Polares

DAD1 A, Sig=210,4 Ref=360,100 (DJ031111\CATECHOL000066.D) m AU 175
C18 150x4,6mm
150
125
100
75
50
25
0.5
1.5
2.5
m in
DAD1 A, Sig=210,4 Ref=360,100 (DJ031111\CATECHOL000065.D) m AU 140
Fenil com endcapping polar 150x4,6mm
120
100
80
Epinephrine Norepinephrine Dopamine
60
40
20
-20 0 0.5 1 1.5 2 2.5 m in
98
Seletividade Polar Melhorada

Oximetazolina e produto de oxidao:
Oxymetazoline
3 .3 3 6 3 .9 0 2
4 3 2 1 0 -1 -2 -3 2
3 .2 3 3
C18
4 3 2
Fenil
3 .6 8 4
6 5 4
Fenil com grupo polar

3 .0 4 9
Rs 1,45
1 0 -1 -2 -3
Rs 2,1
3 .5 6 3
mAU
mAU
mAU
3 2 1 0 -1
Rs 3,2
2.5
3.5
4.5
min
2.5
3.5
4.5
min
2.5
3.5
4.5
min
Rs melhorada com Fenil
Rs timo com fase fenil e grupo polar
99
Resumo das Fases Estacionrias

1. A escolha da Tecnologia de Partculas ter um efeito radical sobre os componentes crticos. A escolha da partcula ser geralmente um suporte totalmente poroso ou Core-Shell Tubos monolticos para amostras extremamente sujas Partculas hbrida de orgnoslica para pH alto As diferenas no tamanho dos poros e na rea de superfcie podem dar s colunas de fabricantes distintos caractersticas de desempenho muito diferente 2. A fase estacionria mais comum para os mtodos de fase reversa C18, e lgico comear a seleo com uma fase C18 As fases Fenil oferecem uma seletividade alternativa, especialmente para aromticos polares As fases com grupos ou endcapping polares oferecem outra opo de seletividade e uma estabilidade com fases mveis 100% aquosas
100
Modelo de Seleo de Coluna

A amostra requer + de 97% de fase mvel aquosa? Sim Fase com grupo ou endcapping polar No A amostra requer uma fase mvel de pH bsico? Sim Partcula hbrida de organoslica No A sua matriz extremamente suja? Sim No
Coluna monoltica
Comprimento e tamanho da partcula Escolha da fase estacionria
Coluna de HPLC Convencional ou CoreCore-Shell
Resoluo insuficiente?
Fase estacionria alternativa
101
Exerccio de Desenvolvimento de Mtodo 2: Seleo do Suporte e da Fase Estacionria
102
Anlise de Epmero de Testosterona

Epmeros = estereoismeros que diferem na configurao de um centro estereognico (Carbono 17) Como tem massa idntica, tem que ser separada pelo HPLC para quantificao exata usando o MS
CH3 CH3 H O H
OH
Testosterone, C19H28O2
Massa monoisotpica: 288,21 Da
Epitestosterone, C19H28O2
Massa monoisotpica: 288,21 Da
103
Seleo de Partcula
A amostra requer + de 97% de fase mvel aquosa? No A amostra requer uma fase mvel de pH bsico? No A sua matriz extremamente suja? No
Comprimento e tamanho da partcula Escolha da fase estacionria
Coluna de HPLC convencional ou CoreCore-Shell
Partculas CoreCore-Shell
100x2,1mm; C18, XBXB-C18, C8
104
Escolha da Fase Alkil

CoreCore-Shell C18
Testo EpiEpi-
CoreCore-Shell XBXB-C18
CoreCore-Shell C8
105
Escolha de Coluna Alternativa

A amostra requer + de 97% de fase mvel aquosa? No A amostra requer uma fase mvel de pH bsico? No A sua matriz extremamente suja? No
Fase com grupo ou endcapping polar
Partcula hbrida de organoslica
Comprimento e tamanho da partcula Fluxo Escolha da fase estacionria Otimizao da fase mvel
Coluna de HPLC Convencional ou CoreCore-Shell
Resoluo insuficiente?
Fase estacionria alternativa
106
Avaliao da Fase Fenil

CoreCore-Shell PFP
107
Avaliao do Endcapping Polar e das Partculas Hbridas

Endcapping Polar C18
Partcula hbrida C18
108
Mtodo Final
CoreCore-Shell XBXB-C18 (Primrio)
Partcula hbrida C18 (Back(Back-up)
Colunas: CoreCore-Shell 2,6 m XBXB-C18 100x2,1mm Partcula de slica hbrida 3 m C18 100x2,1mm FM A: FM B: Fluxo Etapa 0 1 2 3 0,1%FA, 1mM Formato de amnio em gua 0,1%FA, 1mM Formato de amnio em ACN 0,4 mL/min Tempo (min) %B 0 30 1 75 3 75 3.1 30
109
Fim da Parte II
110
Kinetex Tecnologia CoreCore -Shell: A Soluo Completa para HPLC e UHPLC

Nome dos oradores Vencimento Local
Estudo de Caso com Kinetex

Waters Bondapak C18 300 x 3,9 mm Kinetex 2.6 m C18 100x4,6mm
Corrida de 50 min
Corrida de 20 min
Bondapak e Waters so marcas registradas da Waters Corporation. Phenomenex no afiliada Waters Corporation. As comparaes das separaes podem no ser representativas para todas as separaes.
112

Mtodo antigo Tempo de equilbrio Tempo de anlise Fluxo Tempo para ensaio triplicado (N = 6 amostras) Tempo total Volume Total 50 min 50 min 1,0 mL/min 950 min Kinetex 10 min 20 min 1,0 mL/min 370 min
~15 h ~950 mL
~6 h ~370 mL
Aumento da produtividade e reduo do consumo de solvente por um fator de quase 2,5 vezes
113
As comparaes das separaes podem no ser representativas para todas as separaes.

Coluna C18 totalmente porosa Rs = 6,8 Coluna C18 Kinetex 2,6 m Rs = 6,8
Corrida de 20 min
Corrida de 3 min
114

Etapas Tempo de anlise Fluxo Tempo para ensaio triplicado Tempo para teste de dissoluo (24 ensaios) Uniformidade do contedo (10 ensaios) Tempo total Volume Total Mtodo antigo 20 min 1,7 mL/min 60 min 24 h 200 min ~27 h ~2800 mL Kinetex 3 min 1,7 mL/min 9 min 3,6 h 30 min ~4 h ~400 mL
Aumento da produtividade e reduo do consumo de solvente por um fator de quase 7 vezes!

115
Plano
I. O desenvolvimento da Tecnologia CoreCore -Shell II. A Vantagem Kinetex III. Kinetex para HPLC IV. Kinetex para UHPLC V. Fases estacionrias e processo de qualidade VI. Dicas para Desenvolvimento de Mtodo
A Evoluo da Tecnologia Core-Shell

10 m 1,7 m 5 m 3 m Kinetex
1970
1980
1990
2000
2010
Slica Irregular
Kinetex CoreCore-Shell
Partcula Core-Shell da Kinetex

Membrana porosa de 0,35 m
Ncleo Interno de 1,9 m
Partcula Totalmente Porosa

118
Partcula CoreCore-Shell Kinetex de 2,6 m
O que a eficincia da coluna?

O valor do alargamento da banda (pico) ou disperso que ocorre na coluna medida pelo clculo da eficincia da coluna (N) expressa como o nmero de pratos tericos
tR
As colunas que causam um importante alargamento do pico possuem poucos pratos tericos. As colunas que produzem picos muito estreitos (alargamento de pico baixo) tm um grande nmero de pratos tericos.
W1/2
W 119
Largura do pico (W)
A Vantagem Core-Shell
As colunas que contm partculas Core Core-Shell oferecero eficincia (N) significativamente maior do que as colunas que contm partculas totalmente porosas do mesmo dimetro.*
Partculas Totalmente Porosas
w1/2 tR
Banda de amostra injetada
* Gritti et al., Dirio de cromatografia A, 1.217 (2010) 1.589
Partculas Core-Shell Kinetex
w1/2
tR
* Gritti et al., Dirio de cromatografia A, 1.217 (2010) 1.589
3 m C18 totalmente poroso; 150 x 4,6 mm N = 166.502 p/m
Kinetex 2,6 m C18; 150 x 4,6 mm N = 295.340 p/m
Aumento de 78% de eficincia!
122 * Gritti et al., Dirio de cromatografia A, 1.217 (2010) 1.589
450 400 350 300
Fully Porous
Core-Shell
Efficiency( p/m)
250 200 150 100 50 0 5 3.5/3.6 2.5/2.6 1.7 1.3
Particle Diameter (m)
*Farcas et al., HPLC 2012 Conference
A equao de Van Deemter para a altura de prato torico (H):
Incorpora as propriedades fsicas, cinticas e termodinmicas das separaes Descreve as relaes entre a altura de prato e a velocidade da fase mvel Descreve as 3 origens de disperso do pico ou da amplitude de banda de uma coluna
H = A dp + B/u + C de2 u
Difuso de Eddy Efeito multimulticaminhos
Partculas Totalmente Porosas
w1/2 tR
H = A dp + B/u + C de2 u
Difuso longitudinal
w1/2
Very low flow
6
tR
H = A dp + B/ + C de2
Transferncia de massa (cintica)
Disperso devido resistncia transferncia de massa
a b
127
H = A dp + B/ + C de2
Transferncia de massa (cintica)
Disperso devido resistncia transferncia de massa
a b
H = A dp + B/ + C de2
15
15
Reduced plate height h
Reduced plate height h
4.6 x 100 mm Luna-C18 (2)

10
4.6 x 100 mm Kinetex-C18

10
Eddy dispersion Longitudinal diffusion Solid-liquid mass transfer
Eddy dispersion Longitudinal diffusion Solid-liquid mass transfer
0 0 5 10 15 20
0 0 5 10 15 20
Reduced velocity
Reduced velocity
*Gritti e Guiochon, 2012. LC-GC 30(7) 586-595.
A Famlia Kinetex
Partcula Kinetex Compatibilidade do sistema Eficincia tpica (p/m) Totalmente Porosas Eficincia (p/m)
1,3 m UHPLC >400,000 N/A
1,7 m UHPLC 320,000 280,000
2,6 m UHPLC e HPLC 280,000 ~180,000
5 m HPLC 180,000 100,000
Escalonamento com Kinetex

Transferncia simples de mtodo entre as partculas Kinetex:
Kinetex 5 m C18 150x4,6mm
Kinetex 2.6 m C18 150x4,6mm Mesma Seletividade Eficincia Maior Presso Maior
Transferncia com Kinetex

Detector A:237nm
13 min
2.5
DAD1 A, Sig=235,4 Ref=360,100 (JL042712\ASPIRIN000003.D) 2 . 0 7 5
Shimadzu LCLC-20A Kinetex 5 m C18.250 x 4,6 mm Tempo de corrida = 13 min Rs 1/2 = 3,98
5.0
7.5
10.0
12.5
VWD1 A, Wavelength=235 nm (JL042712\ASPIRIN000005.D) 0.396
Combinar as Partculas Kinetex com instrumentao

0.570 0.254
6 .2 8 1
7 min
Agilent 1100 Kinetex 2.6 m C18 150 x 4,6 mm Tempo de corrida = 7 min Rs 1/2 = 4,13
1 .5 7 2
1 .7 1 9
2 .6 9 0
2,5 min
0.75 1 1.25 1.5 1.75 2 2.25 2.276 m in
Agilent 1290 Kinetex 1,7 m C18 50 x 3,0 mm Tempo de corrida = 2,5 min Rs 1/2 = 2,95
0.25
0.293
0.5
Agilent uma marca registrada da Agilent Technologies, Inc. Shimadzu uma marca registrada da Shimadzu Corporation. Phenomenex no afiliada Agilent Technologies ou Waters Corporation. As comparaes das separaes podem no ser representativas para todas as separaes.
Kinetex Kinetex para mtodos de HPLC
Kinetex para mtodos de HPLC

Kinetex de 5 m
Uma forma simples e eficaz para melhorar os mtodos existentes com partculas de 5 m e 3 m Eficincia maior ou igual aos suportes de 3 m totalmente porosos, porm na presso de um de 5 m Eficincia tpica = 180.000 pratos/m Presso operacional tpica <250 Bar A nica partcula CoreCore-Shell disponvel para escala de purificao
Kinetex de 5 m
A partcula 5 m mais eficiente disponvel:
Eficincia no Agilent 1200SL Eficincia no Agilent
200000 180000 160000
1200SL
Eficincia (p/m)
Placas por metro
140000 120000 100000 80000 60000 40000 20000 0
F-P 5 W
F-P 5 Z
F-P 3 X
F-P 3 L
F-P 3 Z
Kinetex 5
Agilent uma marca registrada da Agilent Technologies, Inc. Phenomenex no afiliada Agilent Technologies. As comparaes das separaes podem no ser representativas para todas as separaes.
Kinetex de 5 m
A partcula 5 m mais eficiente disponvel:
Comparison of Efficiency Shimadzu Eficincia noon Shimadzu LC-LC-20A 20A LC
160000 140000
Efficiency (Plates/m) Eficincia (p/m)
120000 100000 80000 60000

(2 C 1 -C S B () 8 2 LI 5 m 18 C 1 8 ) 8
40000 20000
C 8m 8 8 1
8 1
C 3
mC
0
5 t e
tr
r ao
3 .5
i3
x e
in
rF e
c k
n 5
id r
Su
Lu
XB
s el
ir
Todas as marcas registradas pertencem a seus respectivos proprietrios. Phenomenex no afiliada a estas empresas. As comparaes das separaes podem no ser representativas para todas as separaes.
UC
LO E S
m C
Kinetex de 5 m
Eficincia 3 m com presso de 5 m :
Comparao Presso Comparison ofde Pressure
140 120
100
Presso (bar) Pressure (Bar)
80
60
40
5C
(2
20
)8
3 8
C1 8
C 1
ir e m C
5 O m
m 3
rC o 18
m X
S LI L E
te x
il
ua n
in
ac k P
Bi dr
Todas as marcas registradas pertencem a seus respectivos proprietrios. Phenomenex no afiliada a estas empresas. As comparaes das separaes podem no ser representativas para todas as separaes.
137
M C
am
5 m
C 3
82 )(
.C 5
Kinetex de 5 m
Resoluo e sensibilidade melhoradas versus 5 m totalmente porosa:
VWD1 A, Wavelength=295 nm (JL052412\JEFF 2012-05-25 08-14-13\PAR000001.D) 12.899 m AU VWD1 A, Wavelength=295 nm (JL052412\JEFF 2012-05-25 08-14-13\PAR000001.D) 12.899
Agilent ZORBAX 5 m XDBXDB-C18 250 x 4,6 mm

100 80
*HPLC no otimizadao(Agilent 1100)
Altura = 120 mAU
Rs = 0,98
12.282
60
5.942
40
20
12.282
18.232
11.728
12.708
0 0 2.5 5 7.5 10 12.5
13.266
7.318
15
17.5
19.142
20
min
11
12
13
VWD1 A, Wavelength=295 nm (JL052412\JEFF 2012-05-25 07-36-03\PAR000001.D)
160
Kinetex 5 m C18 250 x 4,6 mm
140
120
Altura = 165 mAU
100
Rs = 2,23
10.744 11.283
80
5.276
60
40 17.131
0 0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5 min
9.180
12.274
6.538
18.054
20
11.283 11.619
10.744
1 0
1 0 .5
1 1
1 1 .5
11.619
11.918
m AU
11.918
1 2
1 2 .5
13.266
bc
12.708
11.728
1 3
m in
Agilent e ZORBAX so marcas registradas da Agilent Technologies, Inc. Phenomenex no afiliada Agilent Technologies. As comparaes das separaes podem no ser representativas para todas as separaes.
Kinetex de 5 m
Agilent ZORBAX 5 m SBSB-C18 150 x 4,6 mm Presso = 120 bar Rs = 1,29 *HPLC otimizado (Agilent 1100)
12\JEFF 2012-05-16 11-51-33\SBC18000002.D)
10
12
14
m in
12\JEFF 2012-05-16 09-19-40\KNX5000001.D)
aumento de 22% em Rs
Kinetex 5 m XBXB-C18 150 x 4,6 mm Presso = 120 Bar Rs = 1,57
10
12
14
m in
Kinetex de 5 m
VW D1 A, W avelength=280 nm (JL051712\JEFF 2012-05-17 07-37-30\OMEP000006.D) m AU 8
Waters Symmetry 5 m C18 250 x 4,6 mm Presso = 190 bar Rs = 0,88 *HPLC no otimizado (Agilent 1100)
10
15
20
25
30
35
m in
VW D1 A, W avelength=280 nm (JL051712\JEFF 2012-05-17 14-30-45\OMEP000002.D) m AU
Kinetex 5 m XBXB-C18 250 x 4.6 mm Presso = 188 Bar Rs = 1,98 125% de aumento na resoluo !
100% de aumento na sensibilidade !
10
15
20
25
30
35
m in
Waters e Symmetry so marcas registradas da Waters Corporation. Agilent uma marca registrada da Agilent Technologies Inc. Phenomenex no afiliada Agilent Technologies ou Waters Corporation. As comparaes das separaes podem no ser representativas para todas as separaes.
Kinetex de 5 m
Melhor desempenho versus Slica do tipo A
V W D 1 A , W a v e l e n g th = 2 8 0 n m (Y :\1 \D A T A \J L 0 5 1 7 1 2 \ JE F F 2 0 1 2 -0 5 -1 7 1 4 - 3 0 - 4 5 \O M E P 0 0 0 0 0 2 .D )
m AU
28.130
m AU
Kinetex 5 5 m m XBXBXB-C18 C18 250 250 x x 4,6 4,6 mm mm Kinetex XB

8
2 00
Slica do tipo B, base desativada

1 50
6
Melhor forma de pico para analitos bsicos
1 00
50 30.665 33.951
14.008 14.290
17.630
0 0 0
5
19.356
31.788
12.810
2.169
9.186
10
10
1 5 15
20
20
2 5 25
30
30
3 5 35
m in
m in
V W D 1 A , W a v e l e n g th = 2 8 0 n m (Y :\1 \D A T A \J L 0 5 1 7 1 2 \ JE F F 2 0 1 2 -0 5 -1 7 0 7 - 3 7 - 3 0 \O M E P 0 0 0 0 0 4 .D )
5 Hypersil Hypersil 5 m m ODS ODS 250 250 x x 4,6 4,6 mm mm
8 2 00
Slica do tipo A
4 2.291 13.347 1 00 8.348 17.061 32.875 A re a2 :1
.9 5 1 8
6 1 50
2 50 28.024 A ea r: 1 1 13.347 8.348 17.061 2.291

3 8 .9
0 0 5 10 15 20 25 30 35 m in
Hypersil uma marca registrada da Thermo Hypersil Keystone, Inc. Phenomenex no afiliada Thermo Hypersil Keystone. As comparaes das separaes podem no ser representativas para todas as separaes.
28.024 er a1 :1 1 36 5
m AU
Kinetex de 5 m
Desempenho de 3 m na metade da presso:
VWD1 A, Wavelength=210 nm (JL051612\JEFF 2012-05-16 09-44-20\LCOL000001.D) m AU 250 200
Coluna L 3 m ODS 150 x 4,6 mm Rs = 1,59 Presso = 223 Bar
150
100
50
0 6 8 10 12 14 m in
VWD1 A, Wavelength=210 nm (JL051612\JEFF 2012-05-16 09-19-40\KNX5000001.D) m AU
250
200
Kinetex 5 m C18 150 x 4,6 mm *HPLC otimizado (Agilent 1100) Rs = 1,57 Presso = 120 Bar
150
100
~ 1/2 Presso
6 8 10 12 14 m in
50
Kinetex de 5 m
Desempenho de 3 m na metade da presso:
VWD1 A, Wavelength=278 nm (JL042712\JEFF 2012-04-27 06-59-24\VERAP000009.D) m AU 3 5 .2 7 2 25 30 35 3 5 .7 5 2 0 5 10 15 20 1 7 .8 3 4 60 50
Waters XBridge 3,5 m C18 150 x 4.6 mm Rs = 3,09 BP = 260 Bar

1 9 . 7 3 2
40
30
20
10
0 40
VWD1 A, Wavelength=278 nm (JL042712\JEFF 2012-04-27 06-59-24\VERAP000001.D) 13.635 34.600 m AU 70 16.094 40.129 35.106 0 5 10 15 20 25 30 35 m in
60
50
Kinetex 5 m C18 150 x 4,6 mm Rs = 5,12 BP = 165 Bar
40
30
20
10
*HPLC no otimizado
(Agilent
1100)
Xbridge uma marca comercial e Waters uma marca registrada da Waters Corporation. Agilent uma marca registrada da Agilent Technologies Inc. Phenomenex no afiliada Agilent Technologies ou Waters Corporation. As comparaes das separaes podem no ser representativas para todas as separaes.
Kinetex de 5 m
Melhor desempenho e tempo de vida para uso no LC/MS:
Aminas heterocclicas de salmo por LC/MS/MS
XIC of +MRM (13 pairs): 183.100/183.100 Da ID: Harman from Sample 19 (Sunfire 3.5um C18 50x2_amines) of DataSET1.wiff (Turbo ... Max. 2.6e6 cps. XIC of +MRM (13 pairs): 183.100/183.100 Da ID: Harman from Sample 16 (Kinetex 5u C18 C18 50x2_amines) of DataSET1.wiff (Turbo... Max. 2.7e6 cps.
2.6e6 2.4e6 2.2e6 2.0e6 1.8e6 1.6e6
3.35
2.7e6 2.6e6 2.4e6 2.2e6 2.0e6 1.8e6 1.6e6
2.98
Waters SunFire 3,5 m C18 50 x 2,1 mm 140 Bar

In ten sity, cp s
Kinetex 5 m XBXB-C18 50 x 2,1 mm 72 Bar
In ten sity, cp s
1.4e6 1.2e6 1.0e6 8.0e5 6.0e5 4.0e5 2.0e5 0.0 0.5 93 1.0 185 1.5 278 2.0 370 2.5 462 3.0 554 3.5 647 Time, min 4.0 739 4.5 831 5.0 923 5.5 1015 6.0 1108 6.5 1200
Max. 1.3e6 cps.
1.4e6 1.2e6 1.0e6 8.0e5 6.0e5 4.0e5 2.0e5 0.0 0.5 93 1.0 185 1.5 278 2.0 370 2.5 462 3.0 554 Time, min 3.5 647 4.0 739 4.5 831 5.0 923 5.5 1015 6.0 1108
XIC of +MRM (13 pairs): 228.100/228.100 Da ID: 7,8-/4,8-DiMeIQx from Sample 19 (Sunfire 3.5um C18 50x2_amines) of DataSET1.wiff ...
XIC of +MRM (13 pairs): 228.100/228.100 Da ID: 7,8-/4,8-DiMeIQx from Sample 16 (Kinetex 5u C18 C18 50x2_amines) of DataSET1.wif...
Max. 1.7e6 cps.
1.3e6 1.3e6 1.2e6
2.55
1.7e6 1.6e6 1.5e6
2.25
1.1e6 1.0e6 9.0e5
1.4e6 1.3e6
2.37
1.2e6 1.1e6 8.0e5 In ten sity, cp s 7.0e5 6.0e5 In ten sity, cp s 1.0e6 9.0e5 8.0e5 7.0e5 6.0e5 4.0e5 3.0e5 2.0e5 1.0e5 0.0 0.5 93 1.0 185 1.5 278 2.0 370 2.5 462 3.0 554 3.5 647 Time, min 4.0 739 4.5 831 5.0 923 5.5 1015 6.0 1108 6.5 1200 5.0e5
Melhor resoluo Metade da presso !
2.69
5.0e5
4,84,8- e 7,87,8-DiMeDiMe-IQx
6.18
4.0e5
6.42
6.54
3.0e5 2.0e5 1.0e5 0.0 0.5 93 1.0 185 1.5 278 2.0 370 2.5 462 3.0 554 Time, min 3.5 647 4.0 739 4.5 831 5.0 923 5.5 1015 6.0 1108
SunFire uma marca comercial e Waters uma marca registrada da Waters Corporation. Phenomenex no afiliada Waters Corporation. As comparaes das separaes podem no ser representativas para todas as separaes.
Kinetex de 5 m
Melhor desempenho e tempo de vida para uso no LC/MS:
Canabinides sintticos por LC/MS/MS
XIC of +MRM (10 pairs): 342.200/155.100 Da ID: JWH-018 from Sample 35 (XSelect 2.5u HSS C18_50x2_20-100% ACN in 4min) of Dat... Max. 4.9e4 cps.
XIC of +MRM (10 pairs): 342.200/155.100 Da ID: JWH-018 from Sample 32 (KNX 5u C18_50x2_20-100% ACN in 4min) of DataSET1.wif... Max. 6.0e4 cps.
1.00e5
7.0e4 6.5e4 6.0e4 5.5e4 5.0e4 4.5e4
Waters XSelect 2,5 m HSS C18 50 x 2,1 mm 245 Bar

3.83
In ten sity, cp s
9.50e4 9.00e4 8.50e4 8.00e4 7.50e4 7.00e4 6.50e4
Kinetex 5 m C18 50 x 2,1 mm 158 Bar

4.00
6.00e4
In ten sity, cp s
4.0e4 3.5e4 3.0e4 2.5e4 2.0e4
5.50e4 5.00e4 4.50e4 4.00e4 3.50e4 3.00e4 2.50e4
1.5e4 1.0e4 5000.0 0.0 0.5 56 1.0 110 1.5 165 2.0 219 2.5 274 Time, min 3.0 328 3.5 383 4.0 437 4.5 492
Max. 6.9e4 cps.
2.00e4 1.50e4 1.00e4 5000.00 0.00 0.5 56 1.0 110 1.5 165 2.0 219 2.5 274 Time, min 3.0 328 3.5 383 4.0 437 4.5 483 5.0
XIC of +MRM (10 pairs): 344.200/155.200 Da ID: JWH-073 - 3HB from Sample 35 (XSelect 2.5u HSS C18_50x2_20-100% ACN in 4min) ...
XIC of +MRM (10 pairs): 344.200/155.200 Da ID: JWH-073 - 3HB from Sample 32 (KNX 5u C18_50x2_20-100% ACN in 4min) of DataSE...
Max. 9.6e4 cps.
7.0e4 6.5e4
2.99
9.5e4 9.0e4 8.5e4
2.73
6.0e4 5.5e4 5.0e4
2.94
8.0e4 7.5e4 7.0e4 6.5e4
4.5e4 In ten sity, cp s

In ten sity, cp s
6.0e4 5.5e4 5.0e4 4.5e4 4.0e4 3.5e4 3.0e4 2.5e4 2.0e4 1.5e4 1.0e4
Maior resoluo Menor presso
2.85
4.0e4 3.5e4 3.0e4 2.5e4 2.0e4 1.5e4 1.0e4 5000.0 0.0 0.5 56 1.0 110 1.5 165 2.0 219 2.5 274 Time, min 3.0 328 3.5 383 4.0 437 4.5 492
JWHJWH-018018-4- e 55-hidroxipentilo metablito
5000.0 0.0 0.5 56 1.0 110 1.5 165 2.0 219 2.5 274 Time, min 3.0 328 3.5 383 4.0 437 4.5 445 5.0
XSelect uma marca comercial e Waters uma marca registrada da Waters Corporation. Phenomenex no afiliada Waters Corporation. As comparaes das separaes podem no ser representativas para todas as separaes.
Kinetex de 5 m
A primeira e nica partcula CoreCore-Shell disponvel para PREP LC:
Analtica Tamanho da coluna: 50 x 4,6 mm Mdia: Kinetex 5 m C18 2,4 mg na coluna
VWD1 A, Wavelength=254 nm (Y:\1\DATA\JL081511\JEFF 2012-08-16 06-54-27\PTM000009.D) 2 .0 6 7 2 .6 2 9 mAU 3500
Are a : 94 85 0.3
Preparativa Empacotamento Axia 50 x 21,2 mm Mdia: Kinetex 5 m C18 48 mg na coluna

mV Detector A Ch1 254nm 2000
3000
2500
2000
1500
1000
A2 r e a. 4 2 6 : 12 96 9. 2
1000
500 0 .6 3 6 1 .5 0 0
4 .7 1 8
0 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 min
0 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 2.75 3.00 3.25 3.50 3.75 4.00 4.25 4.50 4.75
Kinetex de 5 m
Carregamento excelente sob condies preparativas:
Carregamento de Amitriptilina
1.2
KNX 5 C18
1
KNX 5 XBXB-C18 5 XBridge
Amplitude de pico
Picos mais estreitos com Kinetex 5 m
0.8
Xbridge uma marca comercial e Waters uma marca registrada da Waters Corporation. Phenomenex no afiliada Waters Corporation. As comparaes das separaes podem no ser representativas para todas as separaes.
Amplitude de pico
0.6
0.4
0.2
0 1 10 100 1000
mg na coluna Carregamento (mg na coluna)
Kinetex para Mtodos de HPLC

Kinetex de 2,6 m
Uma soluo flexvel tanto para os sistemas de HPLC quanto de UHPLC Potencial para ter a eficincia de UHPLC em sistemas de HPLC convencionais Eficincia tpica = 280.000 pratos/m Aumenta a resoluo e reduz o tempo de anlise Presso operacional tpica de 200200-350 Bar
Kinetex de 2,6 m
Eficincia de UHPLC na presso da HPLC:
colunas de 50 x 2,1 mm, Agilent 1200SL

3 m C18 totalmente poroso ACQUITY 1,7 m BEH C18 Kinetex 2,6 m C18 A partcula 1.7 m totalmente porosa atinge o limite de presso do sistema a 600 bar A partcula 2.6 m CoreCore-Shell Kinetex atinge o limite de presso do sistema a 600 bar
Velocidade Linear (mm/seg)
BEH Technology uma marca comercial e ACQUITY uma marca registrada da Waters Corporation. Phenomenex no afiliada Waters Corporation. As comparaes das separaes podem no ser representativas para todas as separaes.
Kinetex de 2,6 m
Desempenho de UHPLC em um sistema de HPLC convencional:
VWD1 A, Wavelength=210 nm (JL051112\JEFF 2012-05-11 15-45-18\ZORB180000002.D) m AU
Kinetex de 2,6 m C18
60
Agilent 1290 UHPLC
50
40
30
20
10
0 7 8 9 10 11 12 13 14 m in
VWD1 A, Wavelength=210 nm (JL051112\JEFF 2012-05-11 16-27-35\KNX5000002.D) m AU 600
Kinetex de 2,6 m C18
*Agilent 1100 HPLC otimizado
500
400
300
200
100
0 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 m in
Kinetex de 2,6 m
Desempenho de UHPLC em um sistema de HPLC convencional:
V W D 1 A , W a v e l e n g th = 2 1 0 n m ( J L 0 5 1 1 1 2 \ J E F F 2 0 1 2 - 0 5 -1 1 1 6 - 2 7 - 3 5 \K N X 5 0 0 0 0 0 2 .D ) m AU 800
Kinetex 2,6 m C18 100 x 4,6 mm *Agilent 1100 HPLC otimizado
600
Desempenho de UPLC em um sistema de HPLC
400
200
0 7 8 9 10 11 12 m in
V W D 1 A , W a v e l e n g th = 2 1 0 n m ( J L 0 5 1 1 1 2 \J E F F 2 0 1 2 - 0 5 - 1 1 1 6 -3 0 -1 7 \Z O R B 1 8 0 0 0 0 0 0 2 .D ) m AU 70
60
ZORBAX 1,8 m C18 100 x 4,6 mm Agilent 1290 UHPLC
50
40
30
20
10
0 7 8 9 10 11 12 13 m in
Kinetex de 2,6 m
Melhora a produtividade e a resoluo
Coluna: C8 250 x 4,6mm 5 m
Fase mvel: 70 / 30 0,1M Acetato de Amnio / THF Fluxo: 1,0 mL/min Compostos: 1-6 = Impurezas A - G 7. Mupirocin
Mupirocin
Kinetex de 2,6 m
DAD1 A, Sig=240,10 Ref=off (Z:\1\DATA\MT050211\DJGSK 2011-05-02 15-34-44\MUPIROCIN000001.D) mAU
5 m C8 totalmente poroso 250 x 4,6 mm

5
175
150
125
100
75
50
Rs 3 e 4 = 0,63 2 34 6
~16 min
25
0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 min
5 m C8 totalmente poroso 250 x 4,6 mm 70/30 0.1 M Acetato de amnio pH 5,7 / THF 1,0 mL/min
Kinetex de 2,6 m
Kinetex 2,6 m C8; 100 x 4,6 mm

5
250
200
150
1
100
Rs 3 e 4 = 2,3 2 3 4
4 5
8 min 6
50
0 0 1 2 3 6 7 8 9 min
Coluna: Kinetex 2,6 m C8 100 x 4,6 mm Fase mvel: 80/20 0,1 M Acetato de amnio pH 5,7 / THF Fluxo: 1,5 mL/min *HPLC otimizado (Agilent 1100)
Rs aumentado de 0,6 para 2,3 Tempo de anlise diminui de 20 min para 8 min
154
Otimizao do Sistema
300000
Hypersil GOLD 5 m ODS Luna 3 m C18(2) Kinetex 2.6 m C18
18.4%
3.9%
15.6%
Efficiency (Plates per meter)
250000
33.8%
200000
150000
~ Aumento de 50%!
100000 50000
Unoptimized
Acquisition Rate
Tubing
Flow Cell
UHPLC Agilent 1290
Hypersi GOLDl uma marca registrada da Thermo Hypersil Keystone. Agilent uma marca registrada da Agilent Technologies, Inc. Phenomenex no afiliada Agilent Technologies ou Thermo Hypersil Keystone. As comparaes das separaes podem no ser representativas para todas as separaes.
Velocidade de Aquisio do Detector
Resumo: Kinetex para HPLC:

Uma soluo imediata para melhorar a sua cromatografia Presso de uma partcula 5 m, com eficincia maior ou igual a 3 m totalmente porosa Eficincia tpica = 180.000 pratos/m Presso operacional tpica <250 Bar
Potencial para a eficincia de UHPLC em sistemas de HPLC convencionais Eficincia tpica = 280.000 pratos/m Aumenta a resoluo e reduz o tempo de anlise Presso operacional tpica de 200200-350 Bar
Kinetex Kinetex para Mtodos de UHPLC
Todas as marcas registradas pertencem a seus respectivos proprietrios. Phenomenex no e afiliada a qualquer uma destas empresas.
Kinetex para Mtodos de UHPLC

Kinetex de 2,6 m
Igualmente poderoso em sistemas de HPLC e UHPLC Oferece a mesma eficincia que as partculas totalmente porosa de 1,7 m, porm com uma presso muito menor Aumenta a faixa do fluxo de trabalho em sistemas de UHPLC para aumentar a capacidade do pico e diminuir os tempos de anlise
Kinetex de 2,6 m
Aumenta a capacidade de pico e a produtividade versus 1,7 m totalmente porosa:

0 .2 1 1 0 .8 4 3 1 .1 3 8 1 .4 8 8
0.050
Kinetex de 2,6m para UHPLC

1 .2 4 4 2 .4 3 0 2 .0 6 3 2 .2 3 5 3 .0 9 3 3 .6 8 5
2.00 2.20 2.40 2.60 Minutes 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80
0.060
0.040
A U
0.030
Waters ACQUITY 1,7 m BEH C18 50 x 2,1 mm 0,6 mL/min Capacidade de Pico = 343 Presso = 565 Bar
0.020
0.010
0.000
0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
1.20
1 .3 4 0
1.40
1.60
1 .6 7 7
1.80
1 .7 8 9
4.00
4.20
4.40
4.60
4.80
5.00
1 .0 5 9
0.060
0.050
0.040
A U
0.030
1 .8 9 7
0 .6 6 3
0.010
1 .1 4 4
0.000
-0.010 0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
1.20
1 .2 1 9
1.40
1 .3 9 3
1.60
1.80
2.00
2.20
2.40 2.60 Minutes
2.80
3.00
3.20
3.40
3 .5 0 2
3.60
0.020
1 .4 9 4
2 .0 6 7
2 .9 1 0
Kinetex de 2,6 m C18 50 x 2,1 mm 0,6 mL/min Capacidade de Pico = 360 Presso = 320 Bar
0 .1 7 8
1 .2 8 1
1 .0 0 8
2 .2 5 6
3.80
4.00
4.20
4.40
4.60
4.80
5.00
BEH Technology uma marca comercial e ACQUITY e Waters so macas registradas da Waters Corporation. Phenomenex no afiliada Waters Corporation. As comparaes das separaes podem no ser representativas para todas as separaes.
Kinetex para Mtodos de UHPLC Kinetex de 1,7 m

Aumento de at 20% a eficincia comparado com as partculas de 1,7 m totalmente porosa A primeira partcula CoreCore-Shell subsub-2 m no mercado Eficincia = ~ 300,000 pratos/m ou mais
Kinetex de 1,7 m
Kinetex de 1,7 m
Aumento da eficincia de 20% versus 1,7 m totalmente porosa:
DAD1 A, Sig=220,8 Ref=360,100 (JL071811\KINP6000014.D) mAU
Waters ACQUITY 1,7 m CSH PhenylPhenyl-Hexyl 50 x 2,1 mm
100
80
60
40
Rs = 1,19
20
0.5
1.5
2.5
3.5
m in
DAD1 A, Sig=220,8 Ref=360,100 (JL071811\KINP6000010.D) mAU 140 120 100 80 60 40 20 0 -20 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 m in
Kinetex 1,7 m PhenylPhenyl-Hexyl 50 x 2,1 mm
Rs = 2,15
CSH uma marca comercial e ACQUITY e Waters so marcas registradas da Waters Corporation. Phenomenex no afiliada Waters Corporation. As comparaes das separaes podem no ser representativas para todas as separaes.
Kinetex de 1,7 m
Melhor resoluo versus Waters ACQUITY BEH 1,7 m: m:
Gritti and Guiochon, Chemical Engineering Science, Volume 65, Volume 23, 1 de dezembro de 2010, pginas 6310-6319
BEH Technology uma marca comercial e ACQUITY e Waters so macas registradas da Waters Corporation. Phenomenex no afiliada Waters Corporation. As comparaes das separaes podem no ser representativas para todas as separaes.
Kinetex para mtodos de UHPLC

Kinetex de 1,3 m
Um avano radical na tecnologia de suporte de HPLC Eficincia >400.000 pratos/m Valor HETP observado de 2,2 = aproximandoaproximando-se de 500.000 pratos por metro (ACQUITY UPLC) Muito dependente de instrumento
ACQUITY e UPLC so marcas registradas da Waters Corporation. Phenomenex no afiliada Waters Corporation.
Kinetex de 1,3 m
Kinetex 1,3 m versus Waters ACQUITY 1,7 m BEH
(Agilent 1290)
VWD1 A, Wavelength=214 nm (JL072512\JEFF 2012-07-25 15-19-08\BSA0000001.D) m AU 60
N o 1 r m .
50
40
ACQUITY 1,7 m BEH C18 Capacidade de Pico = 170 *

5 0
Kinetex de 1,3 m
30
20
10
4 0
0
BEH 1,7 m
-10
-20
m in
3 0
VWD1 A, Wavelength=214 nm (JL072512\JEFF 2012-07-25 16-07-40\BSA0000001.D) m AU 60
Kinetex de 1,3 m C18 *
Capacidade de Pico = 234

2 0
50
40
30
20
10
1 0
-10
-20
0
0 1 2 3 4 5 m in
3 .0 5
3 .1
3 .1 5
3 .2
3 .2 5
3 .3
m in 3 .3 5
Agilent uma marca registrada da Agilent Technologies, Inc. BEH Technology uma marca comercial e ACQUITY e Waters so marcas registradas da Waters Corporation. Phenomenex no afiliada Agilent Technologies ou Waters Corporation. As comparaes das separaes podem no ser representativas para todas as separaes.
Kinetex de 1,3 m
Kinetex de 1,3 m versus Waters ACQUITY 1.7 m BEH
(Agilent 1200SL)
DAD1 A, Sig=210,10 Ref=360,16 (JL072512\JEFF 2012-07-25 14-41-04\GING000002.D) m AU 175 150 125 100 75 50 25 0 -25 3 3.5 4 DAD1 A, Sig=210,10 Ref=360,16 (JL072512\JEFF 2012-07-25 15-08-45\GING000003.D) m AU 175 150 125 100 75 50 25 0 -25 3 3.5 4 4.5 5 5.5 m in 4.5 5 5.5 m in
Acquity Waters ACQUITY 1,7 New m BEH C18
Rs = 3,2
KNX 1.36u C18 360k Kinetex de 1,3 m C18
Rs = 4,3
Agilent uma marca registrada da Agilent Technologies, Inc. BEH Technology uma marca comercial e ACQUITY e Waters so marcas registradas da Waters Corporation. Phenomenex no afiliada Agilent Technologies ou Waters Corporation. As comparaes das separaes podem no ser representativas para todas as separaes.
Resumo: Kinetex para UHPLC:

Igualmente poderoso em sistemas de HPLC e UHPLC Oferece a mesma eficincia que partculas 1.7 m totalmente porosa, porm com uma presso muito menor Aumenta a faixa do fluxo em sistemas de UHPLC para aumentar a capacidade do pico e diminuir os tempos de anlise A primeira partcula CoreCore-Shell subsub-2 m Eficincia = ~300.000 pratos/m ~20 % de melhoria no desempenho comparado as partculas subsub-2 m totalmente porosas O avano mais radical na tecnologia de suporte para HPLC Eficincia potencial >400.000 pratos/m Valor HETP observado de 2,2 = aproximandoaproximando-se de 500.000 placas por metro (ACQUITY UPLC)
ACQUITY e UPLC so marcas registradas da Waters Corporation. Phenomenex no afiliada Waters Corporation.
IV. Informaes Complementares
Seleo de Partculas Kinetex Qual tipo de

sistema LC? HPLC UHPLC
Kinetex de 5 m
Presso: 100100-250 Bar 170.000 p/m
Kinetex de 2,6 m
270.000 p/m
Kinetex de 1,7 m Kinetex de 1,3 m

>300.000 p/m >400.000 p/m
Seleo de Partculas Kinetex

Kinetex de 1,7 m Kinetex de 5 m Kinetex de 2,6 m Kinetex de 1,3 m
Shimadzu LCLC-20A
Waters Alliance
Agilent 1100
Agilent 1290
Waters ACQUITY UPLC
Todas as marcas registradas pertencem a seus respectivos proprietrios. Phenomenex no e afiliada a qualquer uma destas empresas.
Seleo de Fase Estacionria
dP 5 m 2,6 m 1,7 m 1,3 m
C18
XB-C18
C8 2013
Phe-Hex
PFP
HILIC
Controle de Qualidade
Todos os suportes e as colunas empacotadas Kinetex so sujeitos as testes rigorosos e abrangentes para garantir o mais alto nvel de desempenho e reprodutibilidade:
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Distribuio do tamanho da partcula Distribuio do tamanho do poro e rea de superfcie Carga de carbono e rea de cobertura SRM870 (atividade de silanol silanol, , reteno hidrofbica e contaminao de metal) Drogas bsicas Testes especficos da fase (ex: ismeros posicionais) PTM (qualidade da embalagem) Teste de vazamento Teste de queda (transporte)
Controle de Qualidade
Dicas de Desenvolvimento de Mtodo com a Tecnologia CoreCore -Shell Kinetex Kinetex
Sua opinio muito importante para ns! Por favor, reserve alguns minutos para preencher nosso questionrio
1. Reteno de Core-Shell
a b
176
Restek Ultra 5 m C18 150 x 4,6 mm
Maior Sensibilidade
Kinetex 5 m C18 150 x 4,6 mm Menor tempo de anlise Larguras de pico mais estreitas
Isocrtico 65:35 Acetonitrila: gua
VW D1 A, W avelength=254 nm (JL071112\JEFF 2012-07-11 09-41-44\HYP000004.D) m AU 6 . 4 2 8
Kinetex 5 m C18
tR = 6,5 min
400
300
200
100 2 . 1 2 1
3 . 3 5 7
5 . 4 3 8
10
m in
VWD1 A, Wavelength=254 nm (JL071112\JEFF 2012-07-11 10-51-33\HYP000002.D) m AU
160
200 140
120
6.184
tR = 7,2 min
1 0 .0 8 5
rea de superfcie baixa rea de superfcie alta

4 .0 5 5
3.914
55um Hypersil ODS Waters Symmetry m C18
7.219
tR = 10,1 min
100
100
80
60
2 .0 3 8
40
20
00
0 0
22
44
66
88
8 .2 3 4
1010
m in 12
Symmetry e Waters so marcas registradas da Waters Corporation. Phenomenex no afiliada Waters Corporation. As comparaes das separaes podem no ser representativas para todas as separaes.
Gradiente 10% 85% AcCN em 20min
Kinetex 5 m C18
80
60
11.841
tR = 17,8 min
17.883
0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 m in
6.443
20
1.651
Waters Symmetry 5 m C18
80
60 13.552
10.398 10.572
40 5.051
tR = 19,9 min
19.871
40 1.725 10.140 7.5 10 4.944 2.5 5
20
0 0 12.5 15 17.5 20
Symmetry e Waters so marcas registradas da Waters Corporation. Phenomenex no afiliada Waters Corporation. As comparaes das separaes podem no ser representativas para todas as separaes.
Gradiente 10% 50% B 2,5 min; Cadenza 3 m C18 50x2,1mm
Gradiente10% 5% 10% 50% 50% B B 2,5 2,5 min; min; ;; Kinetex Kinetex 5u 5 C18 m 50x2,1mm 50x2,1mm min Kinetex Gradiente 50% B 2,5 min; Kinetex 5 m C18 C18 50x2,1mm min Kinetex
Reduzir a %B de incio para melhorar os primeiros picos

180
2. Fora do Solvente da Amostra

Amostra em Metanol 50% 7 .4 e 4
7 .0 e 4 6 .5 e 4 6 .0 e 4 5 .5 e 4 5 .0 e 4 4 .5 e 4 4 .0 e 4 1 .2 e 5 3 .5 e 4 3 .0 e 4 2 .5 e 4 2 .0 e 4 1 .5 e 4 1 .0 e 4 5 0 0 0 .0 0 .0 1 .0 e 5 8 .0 e 4 6 .0 e 4 1 .8 e 5 1 .6 e 5 Eluio mais rpida ! 1 .4 e 5
Amostra em Metanol 100% 2 .4 e 5

2 .2 e 5 2 .0 e 5
Hydromorphone
Frente
0 .2 4
Morphine
1 .0 6
4 .0 e 4
Norhydrocodone 1 .7 7
1 .5 2 .0 2 .5 3 .0 3 .5 4 .0
1 .3 6
2 .0 e 4
1 .7 9 1 .7 1
0 .9 7 0 .5 1
0 .5 1 .0 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5
1 .8 5 2 .1 5
2 .0 2 .5 3 .0
3 .2 13 .3 6
3 .5
3 .9 7
4 .0
Solventes fortes distorcem os primeiros picos
2. Fora do Solvente Adequao do sistema: da Amostra

Agilent ZORBAX 5 m C18 50 x 2,1 mm
Kinetex 5 m C18 50 x 2,1 mm
Adequao do sistema Parece timo!
2. Fora do Solvente da Amostra Injeo da amostra

Injeo da amostra estranho! Solvente = 90% Metanol
Muito forte !
Adequao do sistema
Solvente = 50% Metanol
3. Velocidade de Aquisio do Detector
3. Velocidade de Aquisio do Detector

Aumentar a faixa de aquisio para melhorar o desempenho:
Faixa do detector = 1HZ Faixa do detector = 10HZ
150 mAU 70 mAU
4. Carregamento de Amostra
XBridge uma marca comercial da Waters Corporation. Phenomenex no afiliada Waters Corporation. As comparaes das separaes podem no ser representativas para todas as separaes.
186
4. Carregamento de Amostra
Reduz a carga de amostra para bases que apresentam alargamentos:
DAD1 C, Sig=254,4 Ref=300,100 (DJ040611\DJGSK 2011-04-06 12-28-48\GSK000010.D) m AU 1 4 .1 5 7 100 80
pKa 9,7
60
40
20
0 12 12.5 13 13.5 14 14.5 15 15.5 16 16.5 m in
50
40
30
20
10
0 12 12.5 13 13.5 14 14.5 15 15.5 16 16.5 m in
30
25
20
2,5 g na coluna; Alargamento USP = 1.17
15
10
0 12 12.5 13 13.5 14 14.5 15 15.5 16 16.5 m in
5. Cuidados com a Coluna

SecurityGuard ULTRA
Maior vida til da coluna Maior produtividade Menos revalidao Menos resoluo de problemas Economize tempo e dinheiro
Protege contra contaminantes qumicos e micropartculas. No altera a cromatografia Fcil de usar Compatvel com praticamente todas as colunas de UHPLC, Core-Shell e sub-2 m de 2,0 a 4,6 mm ID Presso limite de 20.000 psi (1.378 bar)
5. Cuidados com a Coluna Voc prefere?
Aonde voc prefere reter as micro partculas, as partculas do sistema e os contaminantes bacterianos?
Dicas Importantes sobre Core-Shell:

Sob condies isocrticas, as colunas Core-Shell fornecero menos reteno do que as colunas totalmente porosas. Reduza a % orgnica se voc precisa recuperar a reteno perdida. No modo gradiente, a reteno inferior das colunas Core-Shell no to importante. Voc pode iniciar seu gradiente com uma % de B inferior, se necessrio. Cuidado com os efeitos do solvente forte da amostra, principalmente com os compostos que eluem primeiro. Os compostos que eluem primeiros so mais afetados do que os ltimos. O problema mais evidente em colunas Core-Shell, que tendem a ter menos reteno que as totalmente porosas. O solvente da amostra deve ser o mesmo ou mais fraco que a fase mvel inicial. Sempre otimize sua velocidade de aquisio do detector para uma velocidade mais rpida e que seja aceitvel o jeito mais simples de melhorar a sensibilidade e a resoluo. Cuidado com a sobrecarga de amostra, principalmente com analitos bsicos. Se voc observar um alargamento de pico inaceitvel, reduza o volume de injeo e reavalie Proteja o seu investimento usando uma pr coluna de altssimo desempenho
192
Fim Perguntas?

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Desenvolvimento de mtodo de HPLC

Apresentado por: Dr. Jeff Layne 13 de outubro de 2011

O Processo da Cromatografia Lquida

Origem da Cromatografia Lquida

Mikhail Tsvet, 18721872-1919

Bsico das Separaes Cromatogrficas

Fase mvel Fase estacionria

Fase Estacionria Apolar (ex: C18)

Analito na fase aquosa Torneira

CH3 CH3 N CH3 CH3

CH3 N H3C CH3

CH3 Si CH3 CH3 OH OH

Interaes com Hidrognio e Dipolo-Dipolo. Relativamente fraca e progressiva

CH3 Si CH3 CH3 OH OH

Interaes de Troca Inica

Troca inica Interaes fortes e lentas

CH3 Si CH3 CH3 OH OH

A fase mvel ocupa o espao entre as partculas ou o volume intersticial.

A fase mvel enche os poros das partculas porosas.

volume morto frente do solvente t0

Fator de reteno (k)

Fator de reteno (k)

Exemplo: A Separao de Esteroides:

Efeito da mudana de % orgnica

Alargamento de picos devido as interaes secundrias

CH3 Si CH3 CH3 OH OH

Alargamento de picos devido as interaes secundrias

Amitriptyline (pKa 9,4)

Nortriptyline (pKa 9,7)

Protriptyline (pKa 8,2)

Alargamento de picos devido as interaes secundrias

Coluna B C18 50x2,1mm

Max. 1.2e5 cps.

4.0 4.2 Time, min

4.0 4.2 Time, min

Alargamento de picos devido a sobrecarga

2,5 g na coluna; Alargamento USP = 1.17

0 12 12.5 13 13.5 14 14.5 15 15.5 16 16.5 m in

DAD1 C, Sig=254,4 Ref=300,100 (DJ040611\DJGSK 2011-04-06 12-28-48\GSK000008.D) m AU 1 4 .1 6 9

5 g na coluna; Alargamento USP = 1,34

0 12 12.5 13 13.5 14 14.5 15 15.5 16 16.5 m in

DAD1 C, Sig=254,4 Ref=300,100 (DJ040611\DJGSK 2011-04-06 12-28-48\GSK000010.D) m AU 1 4 .1 5 7

12 g na coluna; Alargamento USP = 1,87

0 12 12.5 13 13.5 14 14.5 15 15.5 16 16.5 m in

Frente do pico devido a sobrecarga

DAD1 A, Sig=240,10 Ref=off (MT042211\DJGSK 2011-04-22 09-12-57\MUPIROCIN000001.D) mAU 2250 2.495

Frente devido a sobrecarga

Frente do pico devido aos efeitos do solvente

Amostra em 100% Metanol 2 .4 e 5

Eluio mais rpida ! 1 .4 e 5

Eficincia da coluna (N)

Eficincia da coluna (N)

Largura do pico (W)

A equao de Van Deemter

Velocidade linear (Fluxo) Viscosidade da fase mvel

Efeito do tamanho da partcula na eficincia

Efeito do tamanho da partcula na eficincia

N = ~150.000 pratos/m Presso relativa = 2x

N = ~300.000 pratos/m Presso relativa ~3x

N = ~300.000 pratos/m Presso relativa >4x

Efeito do comprimento da coluna sobre a eficincia

Equilibro entre o comprimento da coluna e o tamanho de partcula

Efeito do fluxo sobre a eficincia

Efeito do fluxo sobre a eficincia