Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan

bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak mengadsorpsi ataupun membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme ataupun latar belakangnya. Zat warna mengadsorpsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroorganisme disekelilingya ditingkatkan. Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan struktur sel seperti spora dan bahan infeksi yang mengandung zat pati dan granula fosfat. Pewarnaan yang digunakan untuk melihat salah satu struktur sel disebut pewarnaan khusus. Sedangkan pewarnaan yang digunakan untuk memilahkan mikroorganisme disebut pewarnaan diferensial yang memilahkan bakteri menjadi kelompok gram positif dan gram negatif. Pewarnaan diferensial lainnya ialah pewarnaan ziehl neelsen yang memilihkan bakterinya menjadi kelompok-kelompok tahan asam dan tidak tahan asam (Dwidjoseputro.1998). Pengenalan bentuk mikroba (morfologi), kecuali mikroalgae harus dilakukan pewarnaan terlebih dahulu agar dapat diamati dengan jelas (Hadiutomo. 1990). Pada umumnya bakteri bersifat tembus cahaya, hal ini disebabkan karena banyak bakteri yang tidak mempunyai zat warna (Waluyo, 2004). Tujuan dari pewarnaan adalah untuk mempermudah pengamatan bentuk sel bakteri, memperluas ukuran jazad, mengamati struktur dalam dan luar sel bakteri, dan melihat reaksi jazad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik atau kimia jazad dapat diketahui (Hadiutomo. 1990). Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884. Dengan metode ini. Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu, bakteri gram positif dan bakteri gram negative. Yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bias dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp (Waluyo, 2004). Berhasil tidaknya suatu pewarnaan sangat ditentukan oleh waktu pemberian warna dan umur biakan yang diwarnai (umur biakan yang baik adalah 24 jam). Umumnya zat warna yang digunakan adalah garam-garam yang dibangun oleh ion-ion yang bermuatan positif dan negatif dimana salah satu ion tersebut berwarna. Zat warna dikelompokkan menjadi dua, yaitu zat pewarna yang bersifat asam dan basa. Jika ion yang mengandung warna adalah ion positif maka zat warna tersebut disebut pewarna basa. Dan bila ion yang mengandung warna adalah ion negatif maka zat warna tersebut disebut pewarna negatif (Hadiutomo. 1990). Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan bersifat basa dan asam. Pada zat warna basa bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut disebut kromofor dan memiliki muatan

positif. Sebaliknya, pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna mempunyai muatan negatif zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak ditemukan didinding sel, membran sel dan sitoplasmasewaktu proses pewarnaan muatan positif pada zat warna basa akan berkaitan dengan muatan negatif dalam sel, sehingga mikroorganisme lebih jelas terlihat (Dwidjoseputro.1998). Zat warna asam yang bermuatan negatif lazimnya tidak digunakan untuk mewarnai mikroorganisme, namun biasanya dimanfaatkan untuk mewarnai mikroorganisme, namun biasanya dimanfaatkan untuk mewarnai latar belakang sediaan pewarnaan. Zat warna asam yang bermuatan negatif ini tidak dapat berkaitan dengan muatan negatif yang terdapat pada struktur sel. Kadangkala zat warna negatif digunakan untuk mewarnai bagian sel yang bermuatan positif, perlu diperhatikan bahwa muatan dan daya ikat zat warna terhadap struktur sel dapat berubah bergantung pada pH sekitarnya sewaktu proses pewarnaan (Dwidjoseputro.1998). Prosedur pewarnaan yang menghasilkan pewarnaan mikroorganisme disebut pewarnaan positif dalam prosedur pewarnaan ini dapat digunakan zat warna basa yang yang bermuatan positif maupun zat warna asam yang bermuatan negatif. Sebaliknya pada pewarnaan negatif latar belakang disekeliling mikroorganisme diwarnai untuk meningkatkan kontras dengan mikroorganisme yang tak berwarna. Pewarnaan mencakup penyiapan mikroorganisme dengan melakukan preparat ulas (Dwidjoseputro.1998) Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas kaca objek. Ulasan ini kemudian difiksasi. Jumlah bakteri yang terdapat pada ulasan haruslah cukup banyak sehingga dapat terlihat bentuk dan penataanya sewaktu diamati. Kesalahan yang sering kali dibuat adalah menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat terutama bila suspensi tersebut berasal adari bukan media padat. Sebaliknya pada suatu suspensi bakteri bila terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan sewaktu mencari bakteri pada preparatnya (Sutedjo.1991). Untuk pewarnaan yang mengamati morfologi sel mikroorganisme maka seringkali setelah pembuatan preparat ulas dilakukan fiksasi diikuti oleh pewarnaan. Fiksasi dapat dilakukan dengan cara melewatkan preparat diatas api atau merendamnya dengan metanol. Fiksasi digunakan untuk : 1. Mengamati bakteri oleh karena sel bakteri lebih jelas terlihat setelah diwarnai 2. Melekatkan bakteri pada glass objek 3. Mematikan bakteri Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan satu macam zat warna untuk meningkatkan kontras antara mikroorganisme dan sekelilingnya. Lazim, prosedur pewarnaan ini menggunakan zat warna basa seperti seperti crystal violet, biru metilen, karbol fuchsin basa, safranin atau hijau malakit. Kadang kala digunakan zat warna negatif untuk pewarnaan sederhana : zat warna asam yang sering digunakan adalah nigrosin dan merah kongo (Lay.1994). Prosedur Pewarnaan sederhana mudah dan cepat, sehingga pewarnaan ini sering digunakan untuk melihat bentuk ukuran dan penataan pada mikoorganisme bakteri pada bakteri dikenal bentu yang bulat (coccus), batang (basil), dan spiral. Dengan pewarnaan sederhana dapat

juga terlihat penataan bakteri. Pada coccus dapat terlihat pewarnaan seperti rantai (stertococcus), buah anggur ( stafilococcus), pasangan (diplococcus), bentuk kubus yang terdiri dari 4 atau 8 (saranae) (Lay.1994). Beberapa mikroba sulit diwarnai dengan zat warna yang bersifat basa, tetapi mudah dilihat dengan pewarnaan negatif, pada metode ini mikroba dicampur dengan tinta cina atau nigrosin, kemudian digesekkan diatas kaca objek.Zat warna tidak akan mewarnai bakteri, akan tetapi mewarnai lingkungan sekitar bakteri. Dengan mikroskop mikroba akan terlihat tidak berwarna dengan latar belakang hitam (Lay.1994). Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh seorang ahli bioteknologi dari Denmark yang bernama Christian Gram pada tahun 1884. Menemukan metode pewarnaan secara tidak sengaja. Dengan metode ini. Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu, bakteri gram positif dan bakteri gram negative. Yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp. Pewarnaan gram merupakan pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi. Pewarnaan itu merupakan tahap penting dalam pencirian dan identifikasi bakteri (Lay,1994) Pewarnaan gram memberikan hasil yang baik, bila digunakan biakan segar yang berumur 24-48 jam. Bila digunakan biakan tua, terdapat kemungkinan penyimpanan hasil pewarnaan gram. Pada biakan tua, banyak sel mengalami kerusakan pada dinding-dinding selnya. Kerusakan pada dinding sel ini menyebabkan zat warna dapat keluar sewaktu dicuci dengan lartan pemucat. Ini berarti bahwa bakteri gram positif dengan dinding sel yang rusak tidak lagi dapat memertahankan crystal violet sehingga terlihat sebagai bakteri gram negatif (Lay,1994) Cirri-ciri gram negative: Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10-45mm, berlapis tiga atau multi layer Dinding slnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat dalam lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak mengandung asam laktat. Kurang rentan terhadap senyawa penisilin. Tidak resisten terhadap gangguan fisik Ciri-ciri bakteri gram positif: Struktur dindingnya tebal Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal Bersifat lebih rentan terhadap senyawa penisilin Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu Kristal Komposisi yang dibutuhkan lebih rumit Lebih resisten terhadap gangguan fisik. Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap. Yaitu a. Pemberian cat warna utama (cairan Kristal violet) berwarna ungu

b. Pengintensifan cat warna dengan penambahan larutan mordan c. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alcohol asam d. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin Banyak seenyawa organic berwarna (zat warna) digunakan untuk mewarnai mikroorganisme untuk pemeriksaan mikroskopis dan telah dikembangkan prosedur pewarnaan gram untuk : Mengamati dengan baik morfologi mikroorganisme secara kasar Mengidentifikasi bagian-bagian structural sel mikroorganisme Membantu mengidentifikasi atau membedakan organisme yang serupa http://itatrie.blogspot.com/2012/10/laporan-mikrobiologi-pewarnaan.html Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884. Dengan metode ini, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri gram positif dan gram negatif yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp. (Dwijoseputro, 2003). Pewarnaan Gram termasuk pewarnaan diferensial karena dapat di gunakan untuk membedakan Gram negative dan Gram positif. Pewarnaan ini sering di gunakan dalam klasifikasi dan identifikasi bakteri. Komposisi dinding sel bakteri Gram positif berbeda dengan Gram negative sehingga reaksi pewarnaan Gram berbeda. Perwarnaan Gram menggunakan Gram A (cat Kristal violet), Gram B (Lyugol iodine), Gram C (etanol : aseton = 1:1), Gram D (cat safranin). Hasil reaksi pewarnaan Gram , bakteri Gram positif berwarna violet dan bakteri Gram negative berwarna merah. Gram-positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna kristal violet sewaktu proses pewarnaan Gram sehingga akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop. Bakteri gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna kristal violet sewaktu proses pewarnaan Gram sehingga akan berwarna merah bila diamati dengan mikroskop. . Dinding sel bakteri Gram negatif mempunyai susunan kimia yang lebih rumit dari pada bakteri Gram positif. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri. Bakteri yang digolongkan dalam jenis bakteri gram negatif memiliki lapisan membran yang selapis saja, sedangkan bakteri gram positif memiliki membran yang agak tebal sehingga dapat hidup pada keadaan lingkungan yang ekstrim, seperti pH yang rendah, suhu tinggi dan lain sebagainya Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel. http://ardiunikal.blogspot.com/2011/04/pewarnaan-gram.html

Pewarnaan sederhana yaitu pewarnaan dengan menggunakan satumacam zat warna dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel bakteri dan untuk mengetahui morfologi dan susunan selnya . pewarnaan ini dapat menggunakan pewarnaan basa pasda umumnya antara lain kristal violet , metylen blue , karbol , fuchsin , dan safranin(lay ,1994). Pewarnaan negatif yaitu pewarnaan yang ditujukan terhadap bakteri yang sulit diwarnai, dimana bakterinya tidak diwarnai melainkan latar belakangnya, metode pewarnaan negatif merupakan suatu metode perwarnaan umum, dimana digunakan larutan zat warna yang tidak meresap ke dalam sel-sel bakteri melainkan melatar belakangi sehingga kelihatan atau nampak sebagai bentuk-bentuk kosong tak berwarna(negatif) (Lay.1994). Pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang digunakan untuk mengelompokan bakteri gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna crystal violet dan akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat warna crystal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna air fucsin atau safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan zat warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya. Pewarna yang digunakan dalam pewarnaan gram antara lain : crystal violet, alkohol, safranin, dan iodine (Lay.1994). Pewarnaan spora merupakan pewarnaan dengan menggunakan malachite green dan safranin, yang dalam hasil pewarnaannya akan muncul warna hijau pada sporanya, serta warna merah pada sel vegetatifnya yaitu pada Bacillus subtitulis(Lay.1994). Prinsip pewarnaan sederhana didasarkan pada zat warna yang digunakan hanya terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut yang merupakan suatu cara yang cepat untuk melihat morfologi bakteri secara umum(Dwidjoseputro.1998). Prinsip pewarnaan negatif yaitu suatu metode pewarnaan tidak langsung dimana digunakan larutan zat warna yang tidak meresap kedalam sel bakteru melainkan ke dalam latar belakangnya (Lay.1994) Prinsip pewarnaan gram didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri ; sehingga menyebabkan perbedaan reaksi dengan permeabilitas zat warna dan penambahan larutan pencuci (Dwidjoseputro.1998). Prinsip pewarnaan spora yaitu suatu metode pewarnaan yang menggunakan malachite green dan safranin, yang dalam hasilnya pewarnaan akan muncul warna hijau pada sporanya dan warna merah pada sel vegetatifnya (Lay.1994) Fuchsin carbon, merupakan campuaran fuchsin fenol dan dasar yang digunakan dalam prosedur pewarnaan bakteri. Hal ini umumnya digunakan dalam pewarnaan mikrobkateria karena memiliki ketertarikan untuk asam mycolic yang ditemukan di dinding sel mikroba, carbol fuchsin juga digunakan sebagai antiseptik tropikal (Lay,1994) Crystal violet atau ungu gentian adalah pewarna triarylmethane. Pewarna ini digunakan sebagai histologis noda dalam metode gram klasifikasi bakteri. Crystal violet memiliki sifat sifat anti bakteri, jamur dan obat cacing, dan sebelumnya penting sebagai antiseptik topikal (Sutedjo,1991).

Nigrosin adalah campuran dari pewarna sintesis hitam yang dibuat dengan memanaskan campuran nirobenzena, anilin, dan hidroklorida. Industri utamanya adalah sebagai pewarna untuk lak, pernis, dan tinta penanda pena. Didalam biologi, nigrosin digunakan untuk pewarnaan negatif bakteri. Bentuk dan organisme yang terlihat sebagai warna bebas menguraikan terhadap latar belakang gelap. Keuntungan dari menggunakan metode ini daripada noda positif biasa seperti fuchsin, metilen blue, atau carbol, ialah bahwa fiksasi sebelumnya oleh panas atau alkohol tidak diperlukan sehingga organisme terlihat. Selain itu pewarnaan negatif dengan nigrosin dapat mengungkapkan beberapa mikroorganisme yang tidak dapat diwarnai dengan metode biasa. Lugols yodium, juga dikenal sebagai solusi lugol, merupakan solusi dari iodium dan iodida dalam air. Larutan yodium lugol digunakan sebagai antiseptik dan desinfektan, dan untuk desinfikasi darurat air minum, dan sebagai reagen untuk deteksi pasti di dalam laboratorium, pewarnaan dan tes medis (Dwidjoseputro.1998). Safranin dalah noda biologis yang digunakan dalam histologi dan sitologi. Safranin digunakan sebagai conterstain dalam beberapa protokol pewarnaan. Mewarnai seluruhinti sel darah merah. Ini adalah counterstain klasik dalam gram stain. Hal ini juga dapat digunakan untuk deteksi tulang rawan, musin dan butiran sel mast. Safranin biasanya memilki struktur kimia. Ada juga trimetil safranin kedua senyawa berperilaku dasarnya identik dan aplikasi pewarnaan biologi dan kebanyakan prosedur safranin tidak membedakan diantara keduanya. Persiapan safranin komersial sering mengandung campuran dari kedua jenis. Safranin juga digunakan sebagai indikator redok dalam kimia analitik (Sutedjo,1991) Fiksasi adalah suatu metode persiapan untuk menyiapkan suatu sampel agar tampak realistik dengan menggunakan grutaldehid dengan proses pemabakaran. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada objek glass tanpa merusak struktur selnya (Lay,1994). Menurut hasil pengamatan, pada pewarnaan sederhana dikemukakan bakteri dengan bentuk basil dan berwarna ungu dalam pembesaran 400. Pada pewarnaan negatif, tidak ditemukan terlalu banyak bakteri, ditemukan bakteri dengan bentuk coccus dan pewarnaan negatif mewarnai belakangnya berwarna biru gelap dan bakteri berwarna kuning. Pada pewarnaan gram ditemukan bakteri jenis gram negatif dengan warna merah dan memiliki bentuk basil pada perbesaran mikroskop hingga 400. Sedangkan, pada perwarnaan spora yang menggunakan malachite green dan safranin, spora seharusnya berwarna hijau, tetapi pada hasil pengamatan yang terlihat hanya warna merah dari safranin, yaitu sel vegetatifnya dengan bentuk coccus pada perbesaran 400 di mikroskop. Beberapa faktor kesalahan pada praktikum antara lain pemberian zat warna yang berlebihan sehingga sel bakteri tidak nampak, kurang maksimalnya dalam proses fiksasi sehingga masih ada bakteri yang belum mati, dan faktor yang lain adalah pada proses pencucian terlalu deras dalam membilas zat warna dengan air sehingga dapat menyebabkan bakteri larut terbawa air

http://ratihkuspriyadani.blogspot.com/2010/11/laporan-praktikum-mikrobiologi-umum.html Berdasarkan pengecatan percobaan yang dilakukan maka dapat disimpulkan bahwa :

1. Pewarnaan mikroorganisme dapat dilakukan pengecatan gram, pengecatan sederhana, dan spora. 2. Pewarnaan sederhana digunakan untuk melihat bentuk dan struktur sel bakteri dengan menggunakan satu jenis pewarna seperti safranin atau kristal violet, sedangkan pewarnaan gram digunakan untuk membedakan antara bakteri gram (+) dan gram (-) dengan lebih dari satu zat warna. 3. Bakteri gram negatif pada teknik pewarnaan akan menghasilkan warna merah dan bakteri gram positif akan menghasilkan warna ungu. 4. Pengecatan spora dilakukan dengan memberi warna pada endospora suatu bakteri. Zat pewarna yang digunakan pertama adalah malachit green. Pengecatan spora digunakan untuk mengetahui spora dengan sel vegatatifnya. 5. Pada preparasi smear, ketebalan smear sangat penting dalam pengamatan di mikroskop. Smear yang baik hanya sekali, jika sudah kering, akan nampak lapisan putih yang tipis. 6.Fiksasi panas adalah teknik yang dilakukan supaya smear bakteri tidak tercuci selama prosedur pewarnaan. Fiksasi panas dilakukan dengan melewatkan secara cepat smear yang dikeringanginkan dua-tiga kali pada api bunsen. 7. Pada bakteri Bacillus subtilis dan Staphylococcus aureus termasuk dalam gram positif dikarenakan bakteri tersebut berwarna biru atau ungu pada pewarnaan safranin. Sedangkan bakteri Pseudomonas putida termasuk dalam gram negatif dikarenakan bakteri tersebut berwarna merah IX. Oktober Dwidjoseputro, diakses pada Nurodin, Ade., pewarnaan.html D., pada tanggal 2009. diakses 1989. pada DAFTAR 2010 Dasar-Dasar 29 28 pada Mikrobiologi. Oktober Oktober 29 Oktober Malang 2010 2010 2010 : pewarnaan safranin. PUSTAKA 20:09. Djambatan. 13:28. 20:29. 13:17.

Anonim. 2009.http://www.microbiologybytes.com/video/Pputida.html. Diakses pada tanggal 28

Ekmon, 2008. http://ekmon-saurus.blogspot.com/2008/09/kunci-awal-identifikasi-bakteri.html) Jimmo., 2008. http ://Pembuatan PreParAT dannn PengeCaTAnnyA__ BloG Kita.mht ,. diakses http://adenurodin.blogspot.com/2009/12/pembuatan-preparat-bakteri-

Schlegel, Hans. 1994. Mikrobiologi Umum Edisi Keenam. Yogyakarta: Gajah Mada University

Press. Stanier Roger, Edward Alderberg dan John Ingraham. 1982. Dunia Mikroba 1. Jakarta: Bharata Karya Aksara. X. LAMPIRAN Bacillus subtilis (sederhana)

Bacillus subtilis (gram +)

Staphylococcus aureus (sederhana)

Staphylococcus aureus (gram +)

Pseudomonas putida (sederhana)

Pseudomonas putida (gram -)

Bacillus subtilis (spora)