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RESUMEN

La utilizaci6n de sistemas analticos de qumica en fase s6lida en los laboratorios c1inicos se remonta a los aos 50. Las primeras tcnicas desarrolladas permitieron la determinacin de glucosa en orina, dada su significacin c1inica en el diagnstico y seguimiento de pacientes diabticos (Clinistix, Ames; S-Glukotest, Boehringer Mannheim). Se trataba de tiras-reactivas que contenan los reactivos en estado desecado. Ofrecan resultados cualitativos, determinados visualmente por el propio operador, comparando el color desarrollado en la reaccin con una tabla de colores de referencia. Actualmente se siguen utilizando y estn basadas en los mismos principios que las aparecidas hace 40 aos. Posteriormente, la ampliacin del nmero de constituyentes analizables en orina (leucocitos, hemoglobina, cuerpos cetnicos, albumina, etc.) condujo a la aparici6n de tiras reactivas multiparametricas (N-Multistix<l' SG, Ames; Combur-9-Test0 , Boehringer Mannheim; etc.), que ailll hoy dia se utilizan en muchos laboratorios c1inicos para e1 amilisis rutinario de las orinas.
INNDICE

OBJETIVO MARCO TEORICO

ANALIZADORES PARA QUMICA CLINICA EN FASE SLIDA Analizadores en pequeos laboratorios y consultas mdicas: Tiras reactivas (qumica en fase slida) Fotometra de reflectancia Potenciometra Analizadores de glucosa para control de insulinodependientes Analizadores para anlisis sistemticos de orina.

BIBLIOGRAFIA ANEXOS

QUMICA SECA La tecnologa de qumica seca tiene sus inicios en los aos 70s. En 1976 ya se tenan algunos avances pero fue hasta 1978 cuando realmente se hizo la introduccin de esta tecnologa. Actualmente se cuenta con un analizador automatizado que utiliza la tecnologa de qumica seca, el cual emplea un sistema de multicapas en un soporte de plstico. Este contiene todos los reactivos necesarios para analizar la muestra, utilizando 10L de suero, plasma, lquido cefalorraqudeo u orina, la cual es aplicada a una lmina o slide que contiene reactivos que permiten la deteccin y cuantificacin del analito en estudio. Existen diferentes tipos de slide, dependiendo del tipo de anlisis por realizar: Colorimtricas la cual hace una determinacin de punto final, ya que hace la medicin una vez terminada la reaccin, ejemplo: glucosa, cido rico, colesterol. Enzimticas, se llevan a cabo varias lecturas durante el curso de la reaccin, ejemplo: lactato deshidrogenasa, amilasa, lipasa. En ambas la concentracin del analito se cuantifica a travs de una medicin espectrofotomtrica. Potenciomtricas, mide el diferencial de potencial entre la muestra y el fluido de referencia, por medio de un electrodo de ion selectivo. Permite medir la concentracin de electrolitos.

Un slide tpico consta de cuatro capas y se clasifican de acuerdo a la funcin que cumplan: Capa difusora: es una capa porosa que permite distribuir uniformemente la muestra adems de funcionar como filtro, ya que no deja pasar molculas como protenas, lpidos, hemoglobina, o bilirrubina. Sirve tambin como pantalla para al reflexin de la luz. Capa de reaccin: contiene sustancias que pueden ser enzimas o cualquier sustancia qumica, que se encuentra en condiciones muy controladas que intervienen en la reaccin.

Capa indicadora: contiene el colorante para formar un complejo colorido, que ser proporcional a la concentracin del analito, la cual se cuantifica por espectrofotometra de reflexin. Capa de soporte: es la base de la laminilla donde estn depositadas las dems capas. Est fabricada con un material de plstico transparente que permite que pase la luz para que la reaccin pueda ser medida. La tecnologa de qumica seca tiene varias ventajas: Excelente precisin y exactitud, el control de calidad, se corre una vez al da, la calibracin es estable por seis meses o cada cambio de lote, utiliza 10L de muestra por prueba y cada muestra usa una punta diferente disminuyendo el peligro de contaminacin. El equipo es sencillo de utilizar, la manipulacin de la muestra se reduce a colocar el lquido por analizar en el equipo, y programar los anlisis deseados.

http://www.bioacademia.com.mx/miembros/tecnologia/0009.html

3. REACTIVOS PARA QUMICA SECA

Los reactivos de qumica seca constituyen la manera de introducir la muestra en los fotmetros de reflexin. Son unidades de reaccin con una slida: poseen en forma deshidratada, todos los componentes que se necesitan para la identificacin de un analito determinado. Modo de empleo: la muestra que contiene el analito a determinar (suero, plasma, sangre total, orina) se aplica sobre la superficie del reactivo en fase slida, y a partir de esta difunde a la matriz, disolviendo los componentes de reaccin que contiene; cuando los reactivos se disuelven se produce la reaccin, que se cuantificara por fotometra de reflectancia. Todos los sistemas constan de tres partes:

Parte soporte

Est constituida por una lamina de plstico, sobre la cual se construye el reactivo de fase solida.

Parte reflectante

Su funcin es reflejar la luz; est hecha de materiales reflectantes como metales, o materiales fibrosos como el papel.

Parte reactiva

Contiene, en forma deshidratada todos los reactivos y sustancias auxiliares necesarias para que se produzca una reaccin. Los reactivos son reconstituidos mediante rehidratacin por el agua de la muestra A veces se aaden otras capas con funciones complementarias como una capa difusora (con lo cual la muestra difunde rpidamente hacia los laterales y se distribuye uniformemente) o una capa separadora de plasma (la utilizan los sistemas preparados para trabajar con sangre total, su funcin es retener las clulas y permitir el paso del plasma hacia la matriz del reactivo).

La estructura de las capas depende del sistema reactivo de fase solida que se trate, variando de unos a Otros.

4. SISTEMAS REACTIVOS

Los reactivos de fase slida empleados en la qumica seca se engloban en dos tipos: las tiras reactivas y las pelculas multicapa.

Tiras reactivas
Se utilizan para: -anlisis de orina -autocontrol de la glucemia -en sistemas de diagnstico rpido en la consulta mdica y a la cabecera del enfermo. Consisten, bsicamente en un soporte de plstico que sirve de soporte a una matriz de celulosa que contiene los reactivos secos necesarios para que se produzca una reaccin con el componente a estudiar. Tira reactiva del sistema Seralyzer (Ames): consiste en una matriz de celulosa impregnada de reactivos secos que se unen a una lamina soporte de

plstico; sobre ella lleva una franja cdigo, que tiene como finalidad ser leda cuando se la inserta en el instrumento. Tira reactiva del sistema Reflotron (Boheringer Mannheim): consta de una lmina soporte al cual se le adhiere el sistema reactivo separado en dos zonas: -una est unida a la lamina. Incluye una serie de capas destinadas a la preparacin de la muestra. -la otra se encuentra inicialmente separada de la lmina soporte, y se pone en contacto con ella por simple presin cuando se desea que el plasma entre en contacto con los reactivos para desencadenar la reaccin; esta zona lleva en su superficie una laminilla transparente a travs de la cual se realizara la lectura. La disposicin en dos bloques hace posible que la parte destinada a la preparacin de la muestra se puedan llevar a cabo etapas de preincubacin o eliminacin de interferentes. Esta tira incorpora tambin una capa separadora de fibra de vidrio para la obtencin de plasma, con lo cual evitamos la centrifugacin previa al anlisis. Ventajas de las tiras: al mantener los reactivos deshidratados aportan una prolongada estabilidad al sistema, que puede ser de meses e incluso de uno o dos aos.

Pelculas multicapa o slides

Estn constituidas por diferentes capas muy finas, a travs de las cuales se van produciendo todas las etapas necesarias para la determinacin cuantitativa del analito. Tiene la apariencia de una diapositiva y est constituido por cuatro capas (que incluyen todos los componentes del sistema). El sistema de ms amplia implantacin es el Ektachem (Kodak).

Capa difusora: sobre

ella se deposita la muestra. Lleva sustancias capaces de reflejar la luz, es la superficie reflectante. Homogeneza la muestra antes de que llegue a la capa reactiva, distribuyndola por toda la superficie. Retiene clulas, cristales y pequeas y grandes molculas, as la muestra se convierte en un filtrado libre de protenas, eliminndose las interferencias.

Capa reactiva: pueden ser una o varias, son las que Capa soporte: est

contienen los reactivos.

hecha de plstico transparente y sobre ella se depositan

todas las dems capas una tras otra. Tiene doble funcin: servir de soporte y dejar pasar la luz, ya que la lectura se hace por la parte inferior (la opuesta a la de la aplicacin de la muestra).

5. INSTRUMENTOS DE MEDIDA PARA BIOQUIMICA SANGUNEA

Son tres los sistemas que se emplean actualmente. Dos de ellos trabajan con tiras reactivas: Seralyzer y Reflotron; el tercero trabaja con slides o reactivos multicapa.

Seralyzer (Ames)
Emplea tiras reactivas. Tras aplicarle la muestra de suero se coloca la tira en una plataforma termostatizada a 37 que se introduce en el aparato. All es irradiado por un haz de luz que incide sobre la zona reactiva de la tira; all se produce la reflexin. Los valores de reflectancia son convertidos en valores de concentracin.

Reflotron
-Emplea tiras reactivas. Se puede trabajar con sangre total, suero o plasma; ya que incorpora una capa separadora, que consigue la separacin de los eritrocitos del plasma. -Despus de aplicar la muestra, la tira reactiva se introduce en el aparato. El plasma pasa al reservorio situado en la parte inferior de la tira; la reaccin comienza cuando (por accin del aparato) se presiona la capa reactiva sobre la capa reservorio del plasma. -La luz reflejada por la zona de reaccin se recoge en un detector de medida, que convierte los valores de reflectancia en valores de concentracin.

Ektachem
Emplea los slides. Ofrecen medianos y grandes analizadores, cuya finalidad es ser utilizados en el laboratorio clnico. La muestra de suero se aplica en la superficie del slide por el autoanalizador, luego es transferida a una cmara de incubacin. La muestra se difunde a travs de las capas, producindose la reaccin. La lectura se produce por irradiacin que incide en la cara inferior del slide. La luz reflejada es recogida por un detector.

6. SISTEMAS PARA ANLISIS DE ORINA

Los dos sistemas ms difundidos para anlisis de orina son: Sistema Clinitek y Sistema Urotron. Ambos incluyen las tiras reactivas y los lectores de tira de orina. Estructura de las tiras reactivas: -un soporte (lamina de plstico blanca). -zonas de papel impregnando con los reactivos, que van fijados al soporte. -cada zona reactiva tiene impregnados reactivos distintos, de manera que cada uno tomara una coloracin diferente cuya intensidad depender de la concentracin del componente en la orina.

Modo de empleo:
1. Sumergir la tira reactiva en la orina 2. Eliminar el exceso de orina 3. Leer el resultado. Se puede hacer visualmente sobre una carta de colores o empleando un fotmetro de reflexin.

Sistema Clinitek
Se emplea la tira reactiva Multistix-10-SG. Est preparada para la determinacin de diez parmetros: Glucosa Bilirrubina Cuerpos cetnicos densidad sangre pH protenas urobilingeno nitritos leucocitos. Esta tira aporta la ventaja de poder hacer la determinacin de densidad de la orina sobre una de las zonas reactivas.

Sistema Urotron
Se emplea la tira reactiva COMBUR-9-TEST. Est preparada para la determinacin de nueve parmetros: glucosa bilirrubina cuerpos cetnicos angre pH protenas

urobilingeno nitritos leucocitos.

7. VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA QUIMICA SECA

VENTAJAS:
el usuario solo necesita aplicar la muestra al reactivo en fase slida para iniciar el anlisis, que tiene lugar en unos minutos no se precisa preparacin previa de los reactivos. Son nicos para cada parmetro y desechables. Tienen larga estabilidad Son fciles de almacenar.

DESVENTAJAS:
Su costo es ms elevado que el de la qumica convencional No es prctico para laboratorios con gran carga de trabajo, ya que por cada tira solo se puede realizar la determinacin de un analito.

UTILIDADES DE LA QUMICA SECA

Se pueden hacer todo tipo de determinaciones bioqumicas, electrolitos, enzimas, perfil lipdico y pruebas derivadas. En los laboratorios clnicos de hoy en da, se emplea esta tcnica para el anlisis de orina, mediante el uso de la tira reactiva. CUADRO RESUMEN DE LOS TEMAS 1-6

Tema 7 - CENTRIFUGACIN
Fundamentos de las tcnicas de centrifugacin - es una tcnica de separacin de particulas que se basa en la distinta velocidad de desplazamiento de las partculas en un medio lquido al ser sometidas a un campo centrifugo ; cuando se centrifuga una solucin => se rompe la homogeneidad y se produce la separacin de solvente y soluto y las 1s partculas en sedimentar son las de mayor masa. Velocidad de sedimentacin - es proporcional a la masa de la partcula y esta propiedad nos permite separar partculas de diferente masa => a (+) masa => (+) velocidad de sedimentacin. ge (gravedad efectiva) - es el tiempo que provoca la sedimentacin forzada cuando se acelera; para acelerar la sedimentacin se puede aumentar la W (velocidad angular); a (+) W => (+) velocidad de sedimentacin; la velocidad de sedimentacin es util para caracterizar partculas y en concreto se usa un valor que llamamos coeficiente de sedimentacin, que es una caracterstica de todas las partculas que nos da informacin de dicha partcula; conocerlo, nos facilita conocer => tamao, densidad y forma de las partculas y adems nos permite disear mtodos de aislamiento de partculas.

Tipos de centrifugas: 1)- de sobre mesa o baja velocidad o "clnicas": son de pequeo tamao, no necesitan refrigeracin, max.velocidad hasta 10.000 rpm, tiles para partculas grandes (clulas, precipitados,...) 2)- microfugas: son una variante de la anterior; tubos cortos para volmenes muy pequeos, no necesitan refrigeracin, velocidad mas de 10.000 rpm, para volmenes pequeos, se usan en biologia molcular. 3)- alta velocidad: velocidad entre 18.000 y 25.000 rpm, necesitan refrigeracin, algunas tienen sistema de vacio, tiles para separar fracciones celulares (membranas, orgnulos) pero no sirven para virus ni ribosomas o macromolculas. 4)- ultra-centrifugas: velocidad a partir de 50.000 rpm, necesitan refrigeracin, sistema de vacio; hay 2 tipos => 1.analticas (analizan las propiedades de la sedimentacin, tienen detectores, determinan la concentracin de parametros mediante la DO) 2.preparativas(preparar la muestra para luego analizar => aislar virus, macromolculas)

Tipos de rotores:

a)- flotantes o basculantes: posicin de 90 con el eje, los tubos utilizados estn unidos al brazo del rotor por su parte superior; se usan para volmenes pequeos de muestra; se utiliza en biologa molecular. b)- de ngulo fijo/angulares: en ngulo fijo (+ o - entre 20-30 con el eje); son paravolmenes mas grandes y se usan en clnica habitualmente; c)- rotores verticales: se produce en vertical (ngulo 0); para volmenes muy grandes; se consigue un "pellet" (sedimento muy poco concentrado); gradiente de densidad isopcnica.

Centrifugacin analtica - con esta se pretende estimar propiedades fsicas de alguna partcula en concreto, es decir, sus propiedades hidrodinmicas; para esto se tiene que cumplir: - aplicacin en sustancias, en mezclas lo + puras posibles y no a grandes mezclas - se pueden aplicar velocidades elevadas de giro sin que repercute en la muestra - rotor utilizado: deben permitir alinear el tubo con los sistemas pticos que miden la sedimentacin en cada momento.

Caractersticas: - poco volumen de muestra - pureza elevada - velocidad de giro elevada - en BQ se utiliza para determinar el coeficiente de sedimentacin y saber que particulas, que composicin tiene la muestra - los sistemas pticos miden la DO de la muestra Aplicaciones: - averiguar la pureza de un compuesto - determinar la proporcin relativa de sus componentes - en investigacin => para conocer e interpretar las estructuras moleculares de diferentes compuestos.

Centrifugacin preparativa - a diferencia de la anterior, es la tcnica que nos permite preparar o adecuar la muestra para su posterior anlisis; hay 2 mtodos: A)- Centrifugacin preparativa diferencial; es el mtodo mas comn de separacin que nos permite separar las partculas en funcin de su velocidad de sedimentacin(e.j.sangre); el resultado es la obtencin de un sobrenadante y un "pellet" (material sedimentado); es inespecfico, ya que a priori, no se conoce en que fraccin va a quedar cada partcula; muy til para separar clulas y orgnulos sub. celulares.

B)- Centrifugacin preparativa en gradiente de densidad: es mas compleja que la anterior; presenta muchas ventajas ya que permite la separacin de varios o todos los componentes de la muestra; en los tubos hay un fluido que de arriba abajo va de menos a mas denso; esto permite separar la muestra por gradiente; la muestra se va colando segn su masa y densidad; esto implica la utilizacin de un soporte fluido cuya densidad aumenta de la parte superior hacia la parte inferior; las caractersticas de este gradientes del fluido son: - material inerte (no altera la muestra) - que no se vea alterado por cambios de temperatura (resistente) - que no absorba radiacin UV (no interfiera en la medicin) - ser isoosmotico (ni hipo ni hiper respecto a la muestra) - no ser corrosivo, inflamable - ser asptico - el intervalo de densidad debe ser suficiente - re-utilizable Ejemplos de fluidos gradientes que pueden separar las partculas de inters: - Sacarosa (alta viscosidad => para estudio de protenas) - Ficoll (polisacrido de alto peso molcula; menos viscoso que la anterior; para separacin de clulas y orgnulos subcelulares) - Percoll (menos viscoso que las anteriores; para estudios de fisiologa vegetal (micro-algas) y en investigacin. Hay 2 tipos de fluidos - zonal (masa) y isopcnica (densidad) Zonal - se lleva a cabo mediante un gradiente de densidad y las partculas se separan en funcin de su masa; a (+) masa (+) velocidad de sedimentacin (+) abajo; para protenas, macro-molculas, y estructuras subcelulares; caractersticas => si parte de la muestra tiene poco peso no podr con la centrifugacin atravesar las zonas mas densas del fluido; cuanto (+) grande => se sedimentara (+) abajo (atravesar las zonas mas densas); la densidad mxima del soporte tiene que ser inferior o como mucho igual a la de densidad mxima de la muestra, porque si es muy denso no podrn atravesar, pero si es muy bajo quedarn apelotonados todas abajo. Isopcnica - cada partcula se quedar (se coloca) donde encuentra su propia densidad; para lipoprotenas (LDL) segn su densidades; caractersticas => la densidad mxima del soporte fluido tiene que ser mayor a la densidad mxima de la muestra (porque si la muestra tiene componentes de 15 de densidad y el liquido solo 10, cuando centrifugamos los de 15, 13, 11... quedarn abajo sin separarse).

Definicin de gradiente de densidad - es la distribucin no homognea de un fluido en la que concentracin del mismo va de menos a mas (columna) consiguindose as una distribucin gradual de densidad.