Diseo de Foto-Bioreactores para el Cultivo Micro Algas Oleaginosas

Parte 1. Teora y Generalidades

Reinhardt Acua Torres Introduccin
La crisis del petrleo y la dependencia forzada de los pases no productores de petrleo, de los que s lo producen, afecta no solo a la economa de los primeros; sino tambin, a su autonoma e independencia alimentaria y productiva. Por esa razn, los biocombustibles alcanzan cada vez una mayor relevancia como combustibles alternativos de menor impacto ecolgico. El fitoplancton y una extensa variedad de micro algas fotosintticas, se caracterizan, aparte de ser el alimento de gran parte de la vida marina animal, por contener (ciertas familias y variedades) grandes cantidades de aceites 1- Planta Productora de Biocombustibles A partir de Micro algas Fotosintticas esenciales de alto a mediano peso molecular. Estos aceites pueden reformados mediante diferentes mtodos para obtener combustibles de alto peso molecular y potencial energtico y flamante, similar al biodiesel. El objeto de este artculo es dar las pautas de diseo y de operacin para la construccin de fotobioreactores destinados al cultivo a gran escala de esos microorganismos fotosintticos.

El Concepto de un Foto Bioreactor para el Cultivo Micro Algas Oleaginosas

Un fotobioreactor es un contenedor biolgico artificial cuyo ambiente interno es capaz de generar las condiciones necesarias para que la fotosntesis de las clorofilas existentes en microorganismos, clulas o tejidos fotosintticos que en ellos se cultiva, crezca y se desarrollen de manera rpida y eficiente para generar biomasa y los productos metablicos que se encuentren dentro de ella. En este sentido, el trmino fotobioreactor se refiere a sistemas cerrados para el medio ambiente externo; es 2- Fotobioreactor Moss con decir, que no tienen intercambio Physcomitrella patens directo de gases y contaminantes con el medio ambiente externo.

Biotecnolgicamente este tipo de bioreactor se utiliza para el cultivo de micro algas con el propsito de fijar CO2 para la produccin de biomasa, mediante la reaccin de la fotosntesis que se lleva a cabo por la clorofila que contienen las microalgas. Las microalgas son microorganismos oxignicos fotoautotrficos que 3- Microalgas fotosintticas realizan fotosntesis mediante la siguiente reaccin de sntesis:

El CO2 es el reactivo limitante de la velocidad de reaccin en los fotobioreactores cuyo propsito de utilizacin es el cultivo de microalgas. El propsito de diseo de estos fotobioreactores es cultivar microalgas (biomasa) para producir aceites esenciales de alto peso molecular (producto metablico). Constructivamente existen tres tipos bsicos de fotobioreactores para el cultivo de microalgas; siendo que la fotosntesis es el otro el factor determinante que interviene en el bioproceso, la intensidad de la energa solar disponible es el parmetro unificador. Los tres tipos bsicos de fotobioreactores para el cultivo de microalgas son: Fotobioreactor de Placa: Un bioreactor de la placa consiste en una serie de paneles o placas interconectadas dispuestas vertical u horizontalmente en cajas rectangulares; a menudo se divide en dos partes para efecto de una agitacin con recirculacin del lquido (cultivo) del bioreactor. Esas conexiones se utilizan tambin para realizar el proceso de llenado y vaciado, la introduccin de gas (CO2) y el transporte de sustancias nutritivas, fcil. La introduccin de los gases de combustin se produce por la parte inferior de la caja o panel, para asegurarse de que el dixido de carbono tiene suficiente tiempo para interactuar con las microalgas en el seno del lquido del reactor. Fotobioreactor Tubular:

Un bioreactor tubular se compone de una serie tubos dispuestos vertical u horizontalmente, conectados a un sistema de tuberas. El cultivo es lquido con biomasa en suspensin (microalgas) y debe ser capaz de circular por la tubera. Los tubos deben estar hechos de material transparente como plstico o vidrio y la circulacin se mantiene constante por efecto de una bomba impulsora al final del sistema. El gas (CO2) se introduce al final y al principio del sistema de tubos; de esta forma se evitan los problemas de difusin que ocasionan deficiencia de dixido de carbono y alta concentracin de oxgeno, al final de la unidad durante la circulacin del fluido (cultivo). Fotobioreactor de Columna de Burbujas:

4- Fotobioreactor panel de platos 5- Fotobioreactor tubular vertical

Un bioreactor de columna de burbujas de fotos consiste en la columna vertical cilndrica, hecha de material transparente, que permite la introduccin de gas, por la parte inferior de la columna, en condicin de flujo turbulento (Re>3000), para un ptimo intercambio de gases.

Este tipo de bioreactores se construyen con un dimetro mximo de 30 cm (el rango es: 20 cm a 30 cm) con el fin de garantizar el suministro necesario de energa luminosa, ya sea de una fuente natural (luz solar) 6- Fotobioreactor o de una artificial (luz elctrica).
de Columna de Burbujas

Los Aspectos Tcnicos del Diseo

El mayor problema cuando se utiliza luz solar es que sta es muy variable en intensidad; segn sea: la regin (latitud), el clima (soleado, oscuro) y la estacionalidad del tiempo (estaciones); eso determina que la construccin est limitada al tamao ms pequeo de dimetro. No obstante, existen mtodos para recoger o concentrar la luz del sol como colectores solares en forma de cono o parablicos y la transferencia de luz con cables de fibra de vidrio ( fibra ptica) que se adapten al perfil del bioreactor. En la gran escala, el consumo de energa debido a las bombas y el costo de fabricacin de CO2, pueden pesar ms que el CO2 capturado por el bioreactor. En forma general, el diseo de un fotobioreactor para el cultivo microalgas a gran escala, para uso como biocombustible, debe considerar los siguientes aspectos: Control preciso de la dinmica de fluidos, Nmero de Reynolds optimizado, Control retroalimentado feedback de las variables de: turbidez, temperatura, pH, DO, DBO, opacidad, colorimetra, espectro radiometra diferencial de area y de inmersin, Paneles o fuentes radiadores de flujo lumnico homogneo de alto rendimiento, bajo consumo, larga vida y bajo coste, Sistemas de microfiltracin de fcil limpieza, Automatizacin del control de flujo de gases (CO 2) y adicin de nutrientes, Precmaras de mezcla y tolvas para la recogida del producto, Monitorizacin y control informtico computadorizado. Estos aspectos implican 4 diferentes reas del diseo del fotobioreactor que tienen que ver con: El aprovechamiento de la energa luminosa: ciclos luz-oscuridad, trayectoria de la luz y geometra de fotobioreactores; Los aspectos fisiolgicos: fotoinhibicin por oxgeno, cultivos de alta densidad celular, ultra alta densidad celular, heterotrofa y mixotrofa; Los aspectos hidrodinmicos: nmero de Reynolds, estrs hidrodinmico, agitacin, mezclado y turbidez; Los fenmenos de transferencia: masa, calor y momentum. Operativamente, un fotobioreactor para el cultivo de microalgas combina en uno solo, 4 tipos de bioreactores:

Un quimiostato: de ambiente qumico esttico; es un bioreactor al que continuamente se le agrega medio fresco, a la misma velocidad en el lquido de cultivo, se remueve del sistema, para mantener el volumen de cultivo constante. Su operacin est diseada para que al cambiar la velocidad con que se agrega el medio de cultivo fresco al bioreactor, la tasa de crecimiento del microorganismo se pueda controlar fcilmente. Dado que la tasa de flujo medio se controla para mantener el volumen de cultivo constante, con un flujo continuo, la alimentacin (flujo de entrada) y la salida o efluente (flujo de salida), deben ser iguales en un quimiostato. Un turbidoestato es un dispositivo de cultivo continuo similar a un quimiostato; su nombre deriva de turbidez esttica (ambiente); en comparacin con el quimiostato, este bioreactor tiene una retroalimentacin entre la turbidez y la tasa de dilucin del recipiente de cultivo. La relacin terica entre el crecimiento en un quimiostato y el crecimiento en un turbidoestato es similar, en el sentido de que, ambos tcnicamente tienen un volumen fijo y una tasa de flujo fija y por lo tanto, la tasa de dilucin es fija. En el estado de equilibrio, cuando las clulas son uniformes, el funcionamiento de un quimiostato y turbidoestato son idnticos . Es slo cuando el crecimiento no es homogneo que las diferencias se hacen manifiestas; eso ocurre cuando las clulas en crecimiento se encuentran: fuera de equilibrio, estn mutando, o estn creciendo a su tasa de crecimiento mximo. En este ltimo caso (cuando las clulas estn creciendo a su tasa de crecimiento mximo) es muy difcil establecer el quimiostato a la tasa de dilucin constante adecuada; por esa razn, el turbidoestato utiliza un espectrofotmetro/turbidmetro para medir la densidad ptica del cultivo que se asocia a su densidad celular, para el control de la tasa de dilucin constante adecuada. No obstante, existen otras opciones tales como, la permitividad dielctrica para medir y controlar tasa de dilucin en un turbidoestato.
7- Bioreactor de tanque agitado (CSTR) operado como un quimiostato.

Un auxoestato es un dispositivo de cultivo continuo similar a un turbidoestato, se diferencia de ste en que su funcionamiento utilice la informacin obtenida por retroalimentacin de una cmara de crecimiento celular, para controlar: el caudal del medio de cultivo (alimentacin fresca), el pH (acidez), la temperatura y el mantenimiento interno (agitacin, viscosidad, etc.) a una medida constante. Auxo era la diosa griega del crecimiento de primavera, y como un prefijo representa nutrientes. El uso tpico de los auxoestatos es para controlar la acidez (pH) en un cultivo bacteriano con retroalimentacin entre la tasa de crecimiento y un medidor de pH, como se observa en la figura. No obstante, en un auxoestato para el cultivo de microalgas deben medirse y controlarse el flujo y concentracin del CO 2, la intensidad y 8- Auxoestato para el cultivo el periodo de iluminacin y la densidad celular del cultivo bacterial por control de pH celular.

Operacin Continua y Cultivo de Microalgas en un Fotobioreactor

Operacin Continua Para un componente i cualquiera de un cultivo celular, incluida la biomasa, se puede plantear el siguiente balance de materia en el bioreactor: d(VCi)/dt = F1Ci1 F2Ci + Vrfi Vrci (1)Donde V es el volumen de cultivo, F 1 es caudal de alimentacin, F 2 el de salida, Ci1 la concentracin del componente "i" en la alimentacin y C i la concentracin en el caudal de salida; rfi y rci son la velocidad de formacin (f) y la velocidad de consumo (c) del componente "i" respectivamente. Bajo el supuesto de que, el cultivo est perfectamente mezclado (mezcla perfecta), se puede asumir que C i es idntica a la concentracin que hay dentro del bioreactor. En una operacin continua, el volumen vara con en el tiempo, de acuerdo a la ecuacin: dV/dt = F1 F2 (2). En un quimioestato, los caudales o flujos de entrada y de salida son iguales y dado que el volumen es constante; la ecuacin 1 se reduce a: V dCi/dt = F (Ci1 Ci) + V(rfi rci) (3). Bioreactor de Inculo
10- Esquema de un bioreactor "fed batch"

Para iniciar un cultivo continuo a gran escala, se debe realizar previamente el inculo del bioreactor a gran escala , desde un bioreactor a pequea, dedicado exclusivamente, al cultivo por 9- Esquema de un lotes batch. Las quimioestato microalgas son organismos fotosintticos auttrofos por lo que, adems de luz de calidad para realizar la fotosntesis, necesitan CO2 como substrato limitante de la velocidad de crecimiento para poder dividirse. Un bioreactor de inculo para el cultivo de microalgas debe ser por lo tanto, un fotobioreactor alimentado fed batch por una corriente S de CO2 como substrato limitante de la velocidad de crecimiento . Una vez establecido el inculo, se comienza a alimentar con medio fresco a un caudal F, la entrada y a recolectar la biomasa o producto, por un rebalse o lavado; para que se mantenga el volumen constante. En un bioreactor alimentado, el caudal de salida es nulo (F2 = 0) por lo que, el volumen aumenta con el tiempo y en funcin del caudal de entrada (F1). Las condiciones de operacin del bioreactor de inculo son: F1 = F; dV/dt = F (4) y V dCi/dt = F (Ci1) + V(rfi rci) (5). El Tiempo de Residencia El volumen V permanece dentro del operador diferencial pues vara con el tiempo. Por ese motivo, un cultivo alimentado tiene duracin limitada en el tiempo que se conoce como tiempo de residencia, ya que, el volumen no puede incrementarse ms all del volumen til que tiene el bioreactor . El tiempo de residencia () es la cantidad promedio de tiempo que pasa una clula dentro del bioreactor. Esta medida vara directamente con la cantidad de sustancia en el sistema y en su forma genrica est dado por la ecuacin: = V/F (6). En el caso de sistemas vivos, la cantidad de substancia debe transformarse y modificarse por concentracin para adaptarse al concepto de sistema biolgico, con eso, la ecuacin 6 se transforma en: C = Co exp (-k) (7). Donde; C = Concentracin, Co = concentracin inicial, exp = exponencial, k = constante de velocidad de reaccin, = tiempo de residencia del bioreactor. Ecuaciones y Balances de Materia en el Cultivo Continuo

En el estado estacionario la tasa de crecimiento especfico () de un microorganismo es igual a la tasa de dilucin (D). La tasa de dilucin se define como la tasa de flujo promedio entre el volumen del cultivo del bioreactor: D = F/V (8). Balance General de Materia: V dCi/dt = F (Ci1 Ci) + V(rfi rci) (3) Balance Materia del Componente X (Biomasa): V dX/dt = -FX + V rfx (9) Balance Materia del Substrato Limitante de la Velocidad S: V dS/dt = F (S1 S) V(rs) (10) Balance de Materia del Producto P: V dP/dt = -FP + V rp (11) Cintica y Crecimiento Bacteriano
11- Fases del crecimiento bacteriano

Cada microorganismo que crece en un sustrato en particular tiene una tasa mxima de crecimiento especfico (m) que se alcanza despus de la fase exponencial de crecimiento, al llegar la fase estacionaria de crecimiento. Dado que, tasa de dilucin se define como la tasa de flujo promedio entre el volumen del cultivo del bioreactor, D define el comportamiento operacional del bioreactor; si se elige una tasa de dilucin mayor que m, habr acumulacin y eventualmente, el volumen del cultivo llegar a ser mayor que el volumen del bioreactor ; el cultivo no podr sostenerse a s mismo en el bioreactor y habr lavado; es decir, se removern las clulas del cultivo, a mayor velocidad de lo crecen o se reproducen . Cuando la tasa de dilucin menor que m, la acumulacin ser negativa, las clulas y el cultivo estarn siempre en su fase exponencial y no se alcanzar nunca el estado estacionario. Bajo condiciones controladas, las cianobacterias pueden duplicar su poblacin cuatro veces al da. Ecuaciones Cinticas en el Estado Estacionario El caudal de salida o lavado contiene clulas maduras y medio de cultivo parcialmente agotado. En base a la ecuacin de balance general de materia (ecuacin 3), se pueden establecer los balances de materia para: la biomasa X, el substrato limitante de la velocidad S y el producto P. En el estado estacionario: rX = m (12). Resulta: F / V = D = m (13). La concentracin media del substrato limitante de la velocidad S` en estado estacionario es: S` = KsD / m D (14). La velocidad de consumo de substrato en el estado estacionario es: rs = D (S1 S`) (15). El rendimiento celular de biomasa se define como la relacin entre la biomasa producida y el sustrato consumido (usualmente la fuente de carbono y energa): Yx/s = -dX/dS (16).

Por la ecuacin (16) la velocidad de consumo de substrato en funcin del rendimiento celular de biomasa en el estado estacionario es: rs = mX / Yx/s (17). La concentracin de biomasa en funcin del rendimiento celular de biomasa en estado estacionario es: X` = Yx/s (S1 S`) (18). La velocidad de dilucin crtica D c en el estado estacionario es: Dc = m S1 / Ks + S1 (19). Ks se conoce como constante de saturacin; el valor de Ks est inversamente relacionado con la afinidad del microorganismo por el sustrato. Cuando la afinidad del microorganismo por el sustrato es muy alta como ocurre en el cultivo de microalgas, S1 Ks y Dc = m, lo cual es un criterio til para elegir un valor de D apropiado. La ecuacin de formacin de producto en estado estacionario es: P` = rp / D (20). O bien: P` = qpX` / D (21). P es la concentracin de producto en estado estacionario. El rendimiento de producto se define como la relacin entre el producto obtenido y el sustrato consumido (usualmente la fuente de carbono y energa): Yx/s = -dP/dS (22).

El Cultivo de Microalgas
El cultivo de algas es una forma de acuicultura que se ocupa del cultivo de especies de algas, mayoritariamente, microalgas, organismos fotosintticos auttrofos que forman parte del fitoplancton tambin denominadas micrfitas. El combustible de algas es un biocombustible de tercera generacin, fabricado a partir de los productos oleaginosos de microalgas; por esa razn, la investigacin sobre algas para la produccin masiva de aceite se centra principalmente sobre esas especies. Sus principales representantes son las diatomeas y las cianobacterias. La mayora de las diatomeas son unicelulares , aunque pueden existir como colonias en forma de filamentos o cintas (por ejemplo, Fragillaria ); las diatomeas son los principales productores en la cadena alimentaria; su rasgo caracterstico es que estn encerrados dentro de una pared de clula nica hecha de slice (dixido de silicio hidratado) llamado frustule. A pesar de ser grandes productoras de aceites, el frstule, ms bien, la slice del que est hecho, es un serio inconveniente para una produccin industrial de biocombustible, razn por la cual, las diatomeas no son utilizadas para ese bioproceso industrial. Cianobacterias

Las cianobacterias (Cyanobacteria, gr. kyans, "azul") son un filo del reino Bacteria (nico del dominio del mismo nombre) que comprende las bacterias capaces de realizar fotosntesis oxignica y a sus descendientes, los plastos, por endosimbiosis. Las cianobacterias fueron consideradas durante mucho tiempo como cianfitas (Cyanophyta, literalmente "plantas azules") o cianofceas (Cyanophyceae, literalmente "algas azules"), castellanizndose el nombre como algas verdeazuladas. Cuando se descubri la distincin entre clula procariota y eucariota se constat que taxonmicamente son las nicas "algas" procariotas y los nicos procariotas que llevan a cabo fotosntesis; y el trmino "Cianobacteria" empez a ganar preferencia. Actualmente, las cianobacterias son un filo de bacterias que obtienen su energa a travs de la fotosntesis por lo que, tambin se les denomina oxifotobacterias (Oxyphotobacteria); los anlisis genticos han venido a situar a las cianobacterias entre las bacterias gramnegativas.
13Cianobacterias: Croococales

12- Cianobacterias: Lyngbya

Clasificacin cientfica Cianobacterias Reino: Bacteria Filo: Cyanobacter ia

rdenes

Gloeobacterales Chroococcales Pleurocapsales Oscillatoriales Nostocales Stigonematales

La taxonoma de las cianobacterias est actualmente en revisin y dista mucho de ser definitiva. Las croococales (Chroococcales) son un orden de cianobacterias unicelulares que se agrupan en colonias y forman falsos filamentos; no tienen heterocistes por lo tanto, son incapaces de fijar nitrgeno; con frecuencia poseen revestimientos gelatinosos. Las oscilatoriales (Oscillatoriales) son un orden de cianobacterias filamentosas sin ramificacin, o con falsa 14- Cianobacterias: ramificacin; son carentes de heterocistes y acinetos. Las Oscillatoria oscilatoriales incluyen

numerosos gneros entre los que destacan Oscillatoria y Spirulina. Oscillatoria es un gnero de cianobacterias antiguamente incluido en la divisin Cyanophyta que, junto a la divisin Prochlorophyta formaban un grupo de procariotas auttrofos. Establecimiento de Cultivos de Microalgas Se han desarrollado diversos mtodos para obtener cultivos monoespecficos (de una sola especie) y axnicos (libres de contaminantes) de microalgas, que en sntesis se pueden resumir bajo el siguiente esquema. Aislamiento Los mtodos bsicos de aislamiento para microalgas son: Filtracin Diluciones Sucesivas

16- Aislamiento y purificacin de microalgas por el mtodo de diluciones sucesivas y subcultivos repetidos.

Purificacin
15- Mtodo de filtracin a travs de una columna empacada con algodn.

Los mtodos bsicos purificacin para microalgas son:

Pipeteo Capilar: se utiliza para separar microalgas mayores de 10: se usa una pipeta de tubo capilar como instrumento para capturar microalgas, a travs del microscopio ptico; luego se separan las clulas en pequeas gotas con solucin de nutrientes y se colocan alrededor de una Caja de Petri o en portaobjetos escavados para que formen cepas. Las cepas seleccionadas son purificadas por cultivos sucesivos. Rayado de Placas de Agar: se utiliza para microalgas menores de

separar 10: se transfieren

17- Purificacin de cepas de microalgas mayores de 10 mediante el mtodo de micropipeta (pipeteo capilar) y cultivos sucesivos.

se prepara con y con una

pequeas gotas de plancton con un asa de siembra, extendiendo por estras (rompiendo un poco el agar). Este agar una solucin nutritiva para microalgas relacin de 11.5% w/v de agar
18- Mtodo de purificacin de colonias de microalgas por rayado en placa de agar.

disuelto en el medio nutritivo, se incuba la placa bajo iluminacin a 1820. De este primer crecimiento se transfiere a tubos con agar inclinado sembrando por estras o bien, se transfiere a medios lquidos en subcultivos sucesivos para su purificacin, de tal manera que en cada dilucin se reduzca el nmero de organismos en una gota, es recomendable combinar la tcnica de diluciones con la de transferencia en placa de agar o tubo inclinado para obtener cultivos clonajes (de una sola colonia o clula) y poder establecer el cultivo mono especfico. Despus de 10 das, pequeas colonias aparecen sobre la superficie del agar, que se pueden transferir mediante el Mtodo de Hocking o de la micropipeta a medios lquidos. Control Bacteriolgico Para prevenir el desarrollo bacteriolgico en los cultivos de Preparacin del Medio de microalgas es necesario determinar la concentracin Zobell: ptima de antibitico que inhibe el crecimiento de Tripticasa 1.0 gr cepas contaminantes; as como el antibitico ideal Extracto de levadura 1.0 gr para dicho propsito. Para eso, primero es necesario Fosfato Frrico 5 mg preparar un medio de cultivo como el siguiente:
Agar Agua envejecida meses) pH = 7.0 7.2 (3 15.0 gr 1 litro

En Cajas de Petri, con tapa no muy gruesa. Con un asa de Platino picar el agar con la muestra que se desea analizar y colocar a la luz o en una incubadora con iluminacin apropiada por un periodo de 2 a 3 das para observar si hay crecimiento bacteriano. Si el cultivo presenta bacterias se debe 1 2 3 4 5 realizar un ensayo factorial, sometiendo a TUBO la accin combinada de al menos dos 0.2 Volumen ml 3.0 2.0 1.0 0.5 5 tipos diferentes de antibiticos, se recomiendan tres, en cinco diferentes 12.00 8.00 4.00 2.00 Penicilina g/ml 500 concentraciones; por ejemplo: 0 0 0 0
Estreptomicina g/ml 8.000 4.00 2.00 1.00 250 0 0 0

Medios de Cultivo para Microalgas Se han desarrollado diferentes medios de cultivo para microalgas cuyas frmulas tienen diferentes usos o propsitos: Enriquecer el agua de mar natural, Enriquecer el agua dulce natural, Medios artificiales para: Agua de mar Agua dulce Medios especficos para: especies especficas, Medios selectivos para especies seleccionadas.

Los medios artificiales permiten resultados constantes en contraste con, los medios para enriquecer que tienen resultados variables debido a, entre otros factores, que dependen del lugar y las caractersticas del agua donde se colectan y el tiempo de almacenamiento de la misma. El fitoplancton se desarrolla y multiplica en relacin de las condiciones fisicoqumicas del medio; en trminos generales los macronutrientes son los factores limitantes del crecimiento y dirigen el metabolismo basal o primario mientras que, los micronutrientes se requieren en cantidades menores y son indispensables para el metabolismo secundario . Los macronutrientes son: el Carbono, Nitrgeno, Fsforo, Silicio, Magnesio, Potasio y Calcio; en tanto que, los micronutrientes son: Hierro, Manganeso, Cobre, Zinc, Sodio, Molibdeno, Cloro y Cobalto. Algunos medios de cultivo para microalgas son.
* Se recomienda usar el agua filtrada y pasteurizada y adicionar los ingredientes. MEDIO ENRIQUECIDO MEDIO MIGUEL (ALLEN-NELSON, 1910) Solucin A: KNO3 20. 2 g H2O 100 ml Solucin B: Na2HPO412H2O 4g CaCl26H2O 4g HCl conc. 2 ml FeCl3 2 ml H2O 80 ml Agregar 2 ml de la Solucin A y 1 ml de la Solucin B En un litro de agua de mar natural, calentar a 70C por 20 min. MEDIO ERD-SAHREIBER ENRIQUECIDO (FOYN, 1934a,b) NaNO3 10 mg Na2HPO412H2O 2 mg Extracto de suelo 5 ml Agua de mar 100 ml MEDIO ERD-SCHREIBER *Agua de mar 1 litro Extracto de suelo 50 ml NaNO3 0.2 g Na2HPO4.12H2O 0.03 g MEDIO DE YASHIMA Para cultivo masivo de clorofceas marinas Sulfato de Amonio (para la 100 agricultura 21%) g/t Superfosfato de Calcio (para 15 g/t la agricultura 21%) Urea (para la agricultura 21%) 15 g/t 3050 Clewat 32 g/t Componentes de Clewat 32: 0.385 FeCl2 (como fuente de Fe) % ZnCl2 (como fuente de Zn) 0.166

% 0.775 MnCl2 (como fuente de Mn) % 0.017 CoCl2 (como fuente de Co) % 0.007 CuSO4 (como fuente de Cu) % (NH4)6Mo7O24 (como fuente de 0.632 Mo) % 2.470 H3 BO3 (como fuente de B) % 0.005 EDTA % MEDIO DE YASHIMA MODIFICADO (HIRATA, 1975) Medio de Yashima (en la misma concentracin) Peptona 50 g/t 0.005 Peptidasa % 0.005 Diaminasa % (recomendado para cultivos axnicos) MEDIO DE CULTIVO STEIN PARA AGUA DULCE (Guillard, In: Stein, 1979) b. Micronutrientes: Na2EDTA 4.36 g/l FeCl3.6H2O 3.15 g/l CuSO4.5H2O 0.01 g/l 0.022 ZnSO4.7H2O g/l CoCl2.6H2O 0.01 g/l MnCl24H2O 0.18 g/l 0.006 Na2MoO4.2H2O g/l De la solucin a se obtiene 1ml y se adiciona c. Vitaminas: a 1l de agua esterilizada. Tiamina HCl

Biotina Cianocobalamin 0.5 g/l a De la solucin b se obtiene 1ml y se adiciona a 1l de agua esterilizada. De la solucin c se obtiene 1ml y se adiciona a 1l de agua esterilizada. d. Tris: Hidroximetil metano

0.1 mg/l 0.5 g/l

Amino 50g/200 dest.

ml

H 2O

De la solucin d se obtiene 2 ml y adiciona a 1l de agua esterilizada. Nota: Una vez preparado el medio de cultivo, debe ajustarse de pH a 7.2 con HCl para no obtener un pH cido.

Cultivo de Microalgas en Fotobioreactores

TABLA 1 CARACTERISTICAS DE ALGUNAS DE LAS ESPECIES DE MICROALGAS UNICELULARES UTILIZADAS EN ACUACULTURA (COLL-MORALES J., 1983) GENERO TEMPERATUR CICLO DE A LUZ OPTIMA DIAMETRO MEDIO

Phaeodactylum (diato 10 h mea) Skeletonema (diatom 13.1 h ea) Dunaliella (cloroficea) 24 h Chlorella (cloroficea) 7.7 h

25C 18C 16C 25C 18C 2025C 20C

10.4 >20 17.8 5 18.4 10 10.2

Tetraselmis (clorofice 18 h a) Monochrysis (crisofic 15.3 h ea) Isochrysis (crisoficea) 30.2 h

Crecimiento Celular El crecimiento y la divisin celular de las microalgas son afectados por la intensidad de la luz y el fotoperodo (horas de iluminacin y obscuridad) en relacin con la temperatura como muestra la Tabla 1. La duracin del ciclo de luz as como la temperatura ptima son susceptibles de variacin de acuerdo con la seleccin de la variedad (especie). Crecimiento en Biomasa El crecimiento fotosinttico en plantas requiere luz, dixido sales inorgnicas para que stas desarrollen sus sistemas cumplan diversas funciones metablicas. En el caso de las microalgas, casi toda la superficie del microorganismo realiza la funcin fotosinttica , lo que se obtiene un mayor rendimiento en la fotosinttica (transformacin de la energa lumnica a energa qumica ). Esto coloca a las microalgas en la base de la cadena trfica , transmitiendo la energa al resto de escalones. El crecimiento medio de las microalgas precisa una serie de elementos inorgnicos de carbono, agua y tisulares y por funcin

19- Esquema piramidal de la cadena trfica

bsicos y carbono (C) como elemento orgnico principal para constituir la clula. Los denominados elementos esenciales son: carbono (C), nitrgeno (N), fsforo (P), metales; y en algunos casos silicio (Si). Requerimientos Principales de los Cultivos de Microalgas
TABLA 2 REQUERIMIENTOS MICROALGAS REQUERIMIENTOS PRINCIPALES COMPUESTOS QUIMICOS DE LOS

Fsicos

Luz Temperatura Salinidad pH Redox

La tabla 2 recoge los principales requerimientos fsicos y VALORES de nutricin en los cultivos de microalgas, 2,000 4,000 en valores lux aproximados.
CULTIVOS DE

15 22C 0.37 79 CO2CO3 O2H2O N2NH4+ NO3 PO4 SO4 Sales g/100 ml g/100 ml g/100 ml g/100 ml g/100 ml g/100 ml

Nutritivo C s O, H N P S Na, K, Ca, Mg

Fe, Zn, Mn, B, Br, Si Sales Cu, Co, Cl, I, Sr, Rb, Sales Al Vitaminas B12, tiamina, biotina

mg/100 ml g/100 ml g/100 ml

En cada caso particular (especie) se deben establecer las necesidades particulares de la especie que se vaya a cultivar; en las condiciones concretas de cultivo que se van a utilizar; para determinar la condicin optima de crecimiento. Ciertos nutrientes como el fsforo deben ser suministrados en exceso debido a que, en la mayora de sus formas, se encuentra como complejos metlicos por lo que, no todo el fsforo es bioasimilable. Si se utiliza agua del mar como soluto, sta puede ser suplementada con fertilizantes comerciales nitrogenados y fosforados; y con pequeas cantidades de otros micronutrientes. Control de pH y Dosificacin de CO2 En un sistema continuo de cultivo de microalgas el CO2 debe ser suministrado de manera continua; durante los fotoperiodos de horas de luz y controlando su dosificacin mediante sensores de pH que minimicen las prdidas y regulen la acidez. En bioreactores tubulares el pH al final del tubo (reactor) se eleva al disminuir la concentracin de
20- Sistema de inyeccin de CO2

CO2 debido a su alto consumo por parte de los microorganismos algales. La concentracin de CO2 disuelto (COD) puede ser controlada mediante su inyeccin en las zonas de estancamiento ; es decir, donde la concentracin ya no permite obtener una capacidad mxima fijadora. El pH se debe controlar junto con el COD debido al que el equilibrio del CO2 con el agua depende tanto de la temperatura de la acidez del medio de cultivo. Fotosntesis Oxignica y Eficiencia Fotosinttica La eficiencia fotosinttica (EF) se define como la fraccin de energa de luz que se fija como energa qumica durante el crecimiento foto autotrfico. En la fotosntesis de las plantas, como mnimo se requieren 10 fotones de luz (cuantos) para producir un mol de O2 .Los requerimientos nutricionales mnimos para el metabolismo celular de la mayora de especies de bacterias pueden ser estimados usando la siguiente aproximacin a la formula molecular de su biomasa : C 0.48 - H 1.83 - N 0.11 - P 0.01 (23). No obstante, las microalgas por ser microorganismos auttrofos fotosintticos, poseen un metabolismo diferente y su composicin representativa de la biomasa debe representarse por la siguiente frmula: CH 1.78 - O 0.36 - N 0.12 (24) que corresponde a los 14 cuantos de fotones necesarios para fijar un mol de CO2 en la biomasa, sobre la base de amonio como fuente de nitrgeno . En esa misma base, un mol de CO2 fijado resulta en un Cmol de biomasa (= 21,25 g de peso seco) con una entalpia de combustin de 547,8 Cmol kJ -1. En la fotosntesis normal slo la luz de longitudes de onda entre los 400nm y 700nm son aprovechables por la planta; esto representa el 42,3% de la energa del espectro total de luz solar y se llama radiacin fotosinttica activa (PAR); el contenido promedio de energa de los cuantos de luz en ese rango del espectro es de 218 kJ/mol cuanto. En cultivos de microalgas, la combinacin activa de todos los elementos, se calcula que como mximo el 9% de la energa solar disponible (teniendo en cuenta todas las longitudes de onda) se puede en convertir en energa qumica con produccin de biomasa nueva; eso significa que el rango de PAR la eficiencia es del 21,4%. La fotosntesis oxignica es la modalidad de fotosntesis en la que el agua es el donante primario de electrones y que, por lo tanto, libera oxgeno (O2) como subproducto. La fotosntesis oxignica es propia de las cianobacterias y de sus descendientes por endosimbiosis. El Fotoperiodo El fotoperiodo es un factor que regula la divisin celular , en diatomeas la reproduccin asexual (divisin) ocurre durante el perodo de luz y ste es acelerado bajo iluminacin continua. En contraste las especies formadoras de auxoesporas (esporas sexuales) como las cianobacterias, forman clulas del mismo tamao durante el perodo de obscuridad. Por tanto, el fotoperiodo o perodo de iluminacin debe ajustarse de acuerdo con los objetivos del cultivo; as como, con el espcimen y la variedad que se cultiva. Un fotoperiodo continuo de iluminacin prolongada puede producir el crecimiento rpido del cultivo, pero puede

21- Fotobioreactor vertical en fotoperiodo activo

afectar a formacin de auxoesporas. Un fotoperiodo normal, con horas de luz y obscuridad semejante al fotoperiodo solar, mantiene un crecimiento normal y saludable. En condiciones controladas, un fotoperiodo de 16/8 horas luz/oscuridad ha mostrado ser ptimo para cultivos de cianobacterias, en gran variedad de especies. La Curva Dosis-Respuesta a la Energa Luminosa No toda la radiacin lumnica (luz) puede ser aprovechada por o en el cultivo de organismos fotoautotrficos. La tasa de fotosntesis celular (F) es la capacidad de captacin de fotones que tiene una clula fotosinttica y depende de la energa luminosa (E) que reciben las clulas. La radiacin fotosintticamente activa (F/E) es la cantidad de radiacin integrada del rango de longitudes de onda que son capaces de producir actividad fotosinttica en plantas y otros organismos fotosintticos como microalgas y bacterias. Ese rango est comprendido entre los 400nm y los 700nm y corresponde tambin aproximadamente 22- Respuesta de un ojo humano tipo a con el espectro visible por el ojo humano. la luz El aprovechamiento de la energa radiante durante la fotosntesis est relacionado con la curva dosisrespuesta que describe esa relacin como una respuesta tpica del crecimiento celular respecto a la intensidad luminosa. A bajos niveles de intensidad luminosa la rapidez de la fotosntesis aumenta con la intensidad de luz; pero cuando el nivel de energa incidente supera cierto valor crtico (Ek) la actividad 23- Curva Dosis-Respuesta a la Energa fotosinttica decae y solo induce pequeos Luminosa cambios en F. La constante Ek es especfica y caracterstica para cada organismo , e indica el nivel de energa luminosa al que comienza a saturarse el fotosistema del microorganismo. Cuando la energa incidente supera el nivel crtico, el efecto causa la inhibicin de los fotosistemas celulares ; lo cual, puede ocasionar el deterioro del cultivo celular e incluso causar un dao irreversible. Eficiencia y Eficacia Luminosa La eficacia luminosa de la radiacin () mide la parte de energa electromagntica que se usa para iluminar y se obtiene dividiendo el flujo luminoso (F) entre el flujo radiante (), = F/ (25). En el sistema internacional SI la eficacia luminosa se expresada en lmenes por vatio (lm/W). La eficacia luminosa tiene un valor mximo posible de 683 lm/W que para el caso de la luz monocromtica corresponde a una longitud de onda de 555 nanmetros (verde).

La eficacia luminosa de una fuente de luz () o rendimiento luminoso mide la parte de energa elctrica que se usa para iluminar y se obtiene dividiendo el flujo luminoso emitido (F) entre la potencia (P) elctrica consumida, = F/P (26). Por otro lado, la eficiencia luminosa (F/E) mide la eficiencia con la que la luz incidente es utilizada por la clula o el microorganismo fotosinttico ; es decir, la fraccin de energa luminosa incidente que es convertida a energa qumica por el fotosistema.
Unidades de fotometra del SI Magnitud Energa luminosa Flujo luminoso Intensidad luminosa Luminancia Iluminancia Emitancia luminosa Eficacia luminosa Smb olo Qv F Iv Lv Ev Mv Unidad del SI lumen segundo lumen (= cdsr) candela (= lm/sr) candela por metro cuadrado lux (= lm/m2) lux (= lm/m2) lumen por vatio Abr ev. lms lm cd cd/ m2 lx lx lm/ W Notas A veces se usa la denominacin talbot, ajena al SI Medida de la potencia luminosa percibida Una unidad bsica del SI A veces se usa la denominacin nit, ajena al SI Usado para medir la incidencia de la luz sobre una superficie Usado para medir la luz emitida por una superficie razn entre flujo luminoso y flujo radiante