Adaptado por: Susana Ruiz Castro

Gonsalves and Ishii, 1980

Protocolo de aislamiento de PRSV

Procedimiento (TODO EN FRIO 4  ˚C)
Extracción cruda:
Colectar tejido de hoja (se recomiendan 100g)       100 g
Moler tejido en vaso de licuadora enfriado con:

2vol (w/v) de buffer fosfato de potasio 0.5M pH 7.5___200ml
0.01 M de EDTA  ___4 ml
0.1 % de sulfito de sodio ___0.2 gr
Agregar 0.5 vol de tetracloruro de carbono  ___50 ml
0.5 vol de cloroformo ___50 ml

Moler en velocidad alta durante 2 minutos
Centrifugar  en botellas GSA a 8000 rpm durante 12 min.
Guardar sobrenadante y filtrar a través de gasa esteril
Agregar 8 % (w/v) PEG 8000 ___32 gr___

Agitar a 4 oC durante 2 horas.
Transferir a botellas GSA, centrifugar a 8000 rpm durante 10 min.
GUARDAR PASTILLAS
Resuspenderlas en 1/5 del volumen original con buffer PE   40 mls
PE (0.1 M fosfato de potasio pH 7.5 y 0.01M de EDTA) 
Centrifugar en rotor  SS34 durante 10 min a 8000 rpm.
GUARDAR SOBRENADANTES, medir volumen___(40 mls aprox) 

Agregar lo siguiente:
5% (w/v) PEG 8000 __2 grs______ 
NaCl 0.3 M      ___4 mls____ 
Agitar a 4 oC durante 1 hora.
Centrifugar en rotor SS34 durante 10 minutos a 8000 rpm
GUARDAR PASTILLAS
Resuspender pastillas en 1/50 del volumen original con buffer PE ­­­ 4 mls
Agregar a la solución viral 0.15gr deCsS04 por mililitro 

Purificación del virus en gradiente de CsSo4:

Preparar solución con CsSo4 con lo siguiente:
5.3g de CsSo4 (es un gradiente de 53% de CsSo4)
10 mls de buffer PE
Agregar a tubos SW 50.1 lo siguiente:
3.5 ml de solución CsSo4
Agregar 1.5 ml solución viral en la superficie de la solución CsSo4
Centrifugar a 30 000 rpm durante 20 a 6oC.

Aislamiento del virus del gradiente de CsSo4:

La banda viral debe de mostrarse a 1 cm de la base del tubo.
Colectar la banda con un aguja no. 18 y jeringa de 1 ml, evitando la 
banda de "basura" arriba de la viral.
Dializar la muestra en buffer PE 0.01M y 0.01 M EDTA (Toda la noche con agitación)

Cuantificación del virus:

Volumen de solución viral:               ___________ mls
Diluir 1:500 ó 1:100 en 500 µl de H2O
Registrar absorbancia 260/280 de la dilución:
 Adaptado por: Susana Ruiz Castro
Gonsalves and Ishii, 1980

Abs. 260 nm = ____________
Abs. 280 nm = ____________
260/280 = ____________  (virus puro 260/280= 1.18).
Para estimar la concentración de virus:

Abs. 260 nm X Factor de dilución =      _______ mg/ml 
                    2.4
Rendimiento =     _________mg/  100g tejido