PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATLICA DE VALPARASO FACULTAD DE INGENIERA ESCUELA DE INGENIERA BIOQUMICA

Tpicos de Cultivo en Continuo (EIB7032) Anlisis de crecimiento celular en quimiostato bajo simple y doble limitacin por sustrato

Paulina Aguirre. Silvia Rojas. Luciana Santibez. Profesor: Fernando Acevedo Mayo, 2013.

RESUMEN

Las condiciones de cultivo influyen notablemente en la composicin celular y en el funcionamiento metablico de las clulas microbianas. Uno de los parmetros ms importantes en el cultivo microbiano es la disponibilidad de nutrientes, por lo que se han planteado diversos modelos para predecir el comportamiento bajo simple y doble limitacin de nutrientes. El objetivo de este trabajo fue realizar un anlisis comparativo de las predicciones de dos modelos de limitacin doble por sustrato: modelos aditivo y ponderado, tomando como referencia el modelo de Monod para limitacin simple y los para doble limitacin, en un caso de estudio determinado que consiste en un cultivo continuo bajo limitacin por fuente de carbono y nitrgeno, donde se analiz el comportamiento de la productividad volumtrica, concentracin de biomasa y sustratos. Para lo anterior fue necesario desarrollar ecuaciones que describieran el comportamiento de cada variable en funcin de la tasa de dilucin a partir de balances de masa y la relacin entre la velocidad de crecimiento y las concentraciones de sustrato residual presentadas por cada modelo. Los resultados indican que el comportamiento de las variables analizadas en base a los distintos modelos muestra similitudes entre s, lo que estara dado por la estrecha relacin entre el modelo bsico de limitacin simple de Monod y los modelos de limitacin doble utilizados en este caso. El modelo ponderado sera el ms consistente dado que se obtiene un perfil similar al obtenido por limitacin simple segn Monod en funcin de la tasa de dilucin.

NDICE

2.1.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA...............................................................5

1.2.DESARROLLO................................................................................................. 5 2.2.1. DISEO DE MEDIO DE CULTIVO.................................................................6 2.2.2. BALANCES DE CULTIVO CONTINUO.........................................................7 2.2.3. LIMITACIN SIMPLE................................................................................9 2.2.4. DOBLE LIMITACIN POR CARBONO Y NITRGENO, SEGN MODELO ADITIVO........................................................................................................... 10 2.2.5 MODELO PONDERADO DE MANKAD Y BUNGAY.....................................11 3.1. LIMITACIN SIMPLE POR LA FUENTE DE CARBONO.....................................13 3.2. COMPORTAMIENTO DEL CULTIVO CONTINUO POR LIMITACION DOBLE DE SUSTRATO SEGN MODELO ADITIVO.................................................................14 3.3. COMPORTAMIENTO DEL CULTIVO CONTINUO POR LIMITACIN DOBLE DE SUSTRATO DE ACUERDO AL MODELO PONDERADO...........................................15 4.DISCUSIN......................................................................................................... 16 5.CONCLUSIN...................................................................................................... 17

NDICE DE FIGURAS

NDICE DE TABLAS

INTRODUCCIN
Existen varias caractersticas de los microorganismos que estn directamente influenciadas por el ambiente y su composicin qumica. Esto se cumple de tal forma que no podemos hablar de la composicin qumica de un microorganismo sin al mismo tiempo especificar las condiciones medio ambientales en las que

ste se produce.

En este contexto, la disponibilidad de nutrientes es un

parmetro clave en el cultivo de clulas microbianas. En efecto, la limitacin de nutrientes especficos es utilizada en gran cantidad de procesos biotecnolgicos para inducir u optimizar la produccin de ciertos productos microbianos (Egli and Zinn, 2003). Frecuentemente, los medios de cultivo para microorganismos han sido diseados bajo el principio bsico de nutricin biolgica, formulado por Justus von Liebig (1840), la ley del mnimo. Este principio planteaba que en microbiologa siempre exista un nutriente en particular que determina la mxima cantidad de biomasa que puede ser producida en un medio de cultivo definido (Egli and Zinn, 2003; Gottschal, 1993). El modelo ms utilizado en la limitacin simple por sustrato es el de Monod, que indica una relacin algebraica simple y continua que permite realizar fcilmente un anlisis terico del crecimiento celular. Plantea que la dependencia del substrato de la velocidad de crecimiento especfica () es de forma que si la cantidad de substrato es muy grande la tasa especfica se aproxima al valor mximo y si la concentracin del substrato tiende a cero, se aproxima a cero (Bader, 1978; Monod, 1949). Sin embargo, existen evidencias experimentales en la literatura que contradicen el principio de von Liebig, ya que muestran que el crecimiento de cultivos microbianos modelos puede verse limitado capaces por de dos o ms el nutrientes crecimiento simultneamente (Bader, 1978; Zinn et al., 2004). A la par con lo anterior, se desarrollaron matemticos describir microbiano bajo distintos tipos de doble limitacin por sustrato. Tomando en cuenta el crecimiento de un microorganismo en presencia de varios sustratos y asumiendo que cada uno de ellos tiene un efecto de captacin competitiva sobre la captacin de otros sustratos, se plante el modelo aditivo (Blanch and Clark, 1997). Otro modelo empleado en la limitacin por ms de un nutriente es el modelo aditivo ponderado (Mankad and Bungay, 1988). En este caso, la tasa de crecimiento bajo doble limitacin de sustrato es expresada en trminos del promedio ponderado de estas tasas bajo limitacin simple por sustrato. El objetivo de este trabajo fue comparar los comportamientos predichos por el modelo aditivo y el modelo ponderado de Mankad y Bungay. Adems lo anterior fue comparado tambin con el comportamiento bajo limitacin simple por glucosa.

1. METODOLOGA

2.1.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Analizar el comportamiento de un quimiostato en funcin de D (X, S i, Qx, ) sometido a doble limitacin por carbono (glucosa) y nitrgeno (sulfato de amonio) bajo las siguientes condiciones:

Tabla 2.1. Condiciones de operacin conocidas

X a D = 0,30 h-1 max Ks glucosa Ks NH4+ C en clula N en clula Cultivo Rendimientos

7,5 g L-1 0,56 h-1 4,5 mgL-1 0,13 mgL-1 49% 13% Continuo aerobio Constantes con

1.2. DESARROLLO Bajo las condiciones mencionadas, se compar el comportamiento de un cultivo continuo de acuerdo a lo siguiente: i) ii) Limitacin simple por fuente de carbono (glucosa). Limitacin doble por carbono y nitrgeno, segn Modelo Aditivo (suponiendo un solo max). iii) Limitacin doble de acuerdo al Modelo Ponderado de Mankad y Bungay (Mankad and Bungay, 1988). A partir de las ecuaciones de balance de masa propias del sistema de cultivo

continuo y la relacin entre la velocidad de crecimiento y la concentracin de sustrato en el reactor, de cada modelo, se obtuvo las ecuaciones que describen el comportamiento de la productividad, la concentracin de biomasa (X) y sustrato (Si), en funcin la tasa de dilucin (D).

2.2.1. DISEO DE MEDIO DE CULTIVO

Para desarrollar el medio de cultivo es necesario conocer algunos factores como: concentracin celular, composicin elemental de biomasa adems los rendimientos de los nutrientes en la clulas, as como la fuente de cada elemento utilizado como nutriente. Si tomamos como referencia la base indicada en la tabla 2.1 sobre la tasa de dilucin (D) igual 0,3 h -1 con limitacin de nitrgeno y carbono se puede recurrir al clculo de los rendimientos (Y X/C) e (YX/N), considerando el contenido del nutriente en la clula y en el sustrato, planteando las siguientes ecuaciones: Para la fuente de carbono:

(ec. 1)

Para la fuente de nitrgeno:

(ec.2) Para un microorganismo aerobio, se debe considerar un factor de correccin (f ) igual a 0,6 en la ecuacin (ec.1), debido a que no todo el carbono de la fuente de carbono y energa, es metabolizado hacia la generacin de biomasa. A partir de este valor, se puede obtener la concentracin de los sustratos en la alimentacin del quimiostato.

El porcentaje de carbono en glucosa es de un 40% y el de nitrgeno en amonio de un 76%. Por lo tanto los valores de rendimientos para glucosa y nitrgeno son YX/c= 49, YX/N= 1,63, respectivamente.

2.2.2. BALANCES DE CULTIVO CONTINUO Se consider un sistema de quimiostato de mezcla completa, con alimentacin estril, volumen de fermentacin constante, ausencia de inhibidores y en el cual el nico producto obtenido es biomasa (Fig. 1). En base a lo anterior, se plantearon los siguientes balances:

Figura 2.1. Esquema de un quimiostato simple.

Balance general de biomasa

(ec 3)

Considerando volumen constante (ec 4)

Y sea:

(ec 5)

Se obtiene: (ec 6)

En estado estacionario, donde

, se cumple que:

(ec 7) Balance sustratos:

(ec 8)

Suponiendo estado estacionario

(ec 9)

Dado que

(ec 10) Despejando la concentracin de sustrato en el reactor, se obtiene que

(ec 11)

Productividad volumtrica:

(ec 12) Se realizaron los clculos correspondientes con la finalidad de determinar la relacin SC0/SN0 sin omitir las concentraciones Sc y SN de nuestro sistema planteado bajo los modelos aditivo y ponderado de Mankad y Bungay.

2.2.3. LIMITACIN SIMPLE De acuerdo a lo descrito en la seccin 2.2.2 y utilizando la ecuacin de Monod, que describe la velocidad de crecimiento en funcin de la concentracin de sustrato en un cultivo con limitacin simple, tenemos que:

; para carbono

(ec 13)

; para nitrgeno

(ec 14)

Reemplazando la ecuacin 11 en la ecuacin 13 y 14, para carbono y nitrgeno respectivamente, y despejando la variable X tenemos que:

(ec 15)

(ec 16)

A partir de la ecuacin 15 y 16 se obtienen los perfiles de biomasa (X), Concentracin de carbono (Sc) y productividad volumtrica (Q x) en funcin de la tasa de dilucin (D).

2.2.4. DOBLE LIMITACIN POR CARBONO Y NITRGENO, SEGN MODELO ADITIVO. Considerando el modelo aditivo para doble limitacin por carbono y nitrgeno tenemos: (ec 17)

En base a la ecuacin 17 y reemplazando la ecuacin 11 para concentracin de carbono y nitrgeno obtenemos la siguiente ecuacin:

(ec 18) De la ecuacin 18, obtenemos SCO, que posteriormente sirve para determinar la relacin SCo/ SNo

(ec 19)

Reemplazando por los valores numricos de , max, ksc, ksn, X, ecuacin 19 se tiene:

y simplificando la

Luego

As mismo, resolviendo el sistema compuesto por las ecuaciones 13 a la 17, se obtiene la relacin el perfil de comportamiento de la biomasa (X) en funcin de

Sco, Sno,

bajo limitacin doble. Biomasa (X) estar definida por:

(ec 20)

Donde:

2.2.5 MODELO PONDERADO DE MANKAD Y BUNGAY En el modelo ponderado (Mankad and Bungay, 1988) se define la siguiente relacin:

(ec 21)

Donde W1 y W2 son los factores de ponderacin en funcin de K i y Si, y estn definidos de la siguiente manera:

Reemplazando W1 y W2, la ecuacin 21 se puede reescribir de la siguiente manera:

(ec 22)

Utilizando el mismo procedimiento de las secciones 2.2.3 y 2.2.4, se obtuvo las ecuaciones con la finalidad de obtener Sco y posteriormente la relacin SCO/Sno, y concentracin de biomasa. Para este casos en particular, debido la dificultad para visualizar las ecuaciones por su complejidad, se las presenta por secciones. (ec 23) Donde:

Reemplazando por los valores numricos de , max, ksc, ksn, X,

se tiene:

Para el clculo de la concentracin de biomasa (X):

Donde:

Todos los clculos

de

este

trabajo fueron realizados con

la aplicacin

Mathematica 7.0 (Wolfram, 2010).

3. RESULTADOS

Como es de esperar segn lo reportado en la literatura, los resultados muestran diferencias en el comportamiento obtenido bajo la prediccin de los modelos aditivo y ponderado de limitacin doble. Para esquematizar los comportamientos en los distintos casos, se resolvi los sistemas de ecuaciones planteados anteriormente de modo de representar la concentracin celular (X), concentracin del nutriente limitante (Si) y productividad volumtrica de biomasa (Qx) en funcin de la velocidad de dilucin (D).

3.1. LIMITACIN SIMPLE POR LA FUENTE DE CARBONO En el caso de limitacin simple de la fuente de carbono, se utiliz una concentracin de alimentacin de glucosa (S C0) de 15,31 gL-1, valor que se obtuvo a partir de los clculos de diseo del medio de cultivo. En la Figura 3.1 podemos observar que la concentracin celular comienza a disminuir aproximadamente a una D = 0,5 h-1, alcanzando las condiciones de lavado a una tasa de dilucin crtica (Dc)= 0,55 h-1. La concetracin de glucosa residual (S c) se mantiene constante con valores cercanos a cero, y aumenta exponencialmente a partir de D= 0,5 h-1. La productividad volumtrica (Q x) alcanza un valor mximo igual a 3,5 L-1h-1 a un valor de D= a 0,5 h-1, donde posteriormente disminuye drsticamente.

Figura 3.1: Comportamiento de un cultivo continuo bajo limitacin de la fuente de carbono.

3.2. COMPORTAMIENTO DEL CULTIVO CONTINUO POR LIMITACION DOBLE DE SUSTRATO SEGN MODELO ADITIVO Con respecto a la limitacin doble de sustrato de acuerdo al modelo aditivo, se utiliz una concentracin de alimentacin de glucosa (S C0) de 15,31 gL-1 y de nitrgeno (Sno) de 4,60 gL-1, que se obtuvieron a partir del diseo del medio de cultivo. En la Figura 3.2 se representa X, S c, Sn y QX en funcin de la tasa de dilucin (D). Podemos observar que los valores de la concentracin de biomasa disminuyen a partir de un valor de D c = 1,1 h-1, alcanzando las condiciones de lavado; a medida que aumenta la velocidad de crecimiento, aumenta la productividad volumtrica hasta un Q x mximo de 8,23gL-1 h-1, a la misma tasa de dilucin, la concentracin de S c y Sn comienzan a incrementarse.

Figura 3.2. Comportamiento de un cultivo continuo bajo limitacin doble de la fuente de carbono y nitrgeno segn el modelo aditivo.

3.3. COMPORTAMIENTO DEL CULTIVO CONTINUO POR LIMITACIN DOBLE DE SUSTRATO DE ACUERDO AL MODELO PONDERADO. Para el modelo ponderado de Mankad y Bungay se utiliz una

concentracin de alimentacin de glucosa (S C0) de 15,3 gL-1 y de nitrgeno (Sno) de 4,60 gL-1, que se obtuvieron de las ecuaciones de diseo del medio de cultivo. En la Figura 3.3 se representa X, S c, Sn y QX en funcin de la tasa de dilucin (D). Podemos observar que los valores de la concentracin de biomasa disminuyen a partir de un valor de Dc = 0,55 h-1 y que a medida que aumenta la velocidad de crecimiento, aumenta la productividad volumtrica hasta un Q x mximo de 3,58 gL-1h-1, disminuyendo rpidamente. La concentracin de S c y Sn comienzan a incrementarse a un mismo valor de la tasa de dilucin.

Figura 3.3. Comportamiento de un cultivo continuo bajo limitacin doble de la fuente de carbono y nitrgeno segn el modelo ponderado.

4. DISCUSIN
Realizando un anlisis comparativo de los modelos antes mencionados podemos decir lo siguiente: La limitacin simple por fuente de carbono (Fig 3.1), sigue el

comportamiento esperado de acuerdo a lo descrito por la relacin de Monod, en la cual el valor de D de lavado (D c) obtenido es numricamente igual a max (Acevedo et al., 2002). Esto ocurre de igual manera en el modelo ponderado, algo que le da mayor validez que al modelo aditivo. El D crtico de ste ltimo es dos veces mayor al mx obtenido en los otros modelos. Por otro lado visualizando la Figura 3.2, podemos observar como la suma de las velocidades de crecimiento ( mx) en el modelo aditivo, sobredimensionan el sistema provocando un alto valor de D crtico, lo que le resta validez al modelo, puesto que en sistemas con alimentacin estril no es posible alcanzar D crticos

mayores

la

velocidad

de

crecimiento

mximo

del

microorganismo.

Lamentablemente no se encontr referencia donde el modelo aditivo sea vlido experimentalmente. De igual manera se puede sealar que los valores entregados por el modelo aditivo, a tasas de dilucin menores a mx concuerdan con los obtenidos por el modelo ponderado y la ecuacin de Monod, lo que indica que hasta este rango el modelo se ajusta. Matemticamente, en sistemas donde K S2 segundo trmino de la ecuacin es despreciable. Analizando la ecuacin 22, se puede ver que el modelo ponderado guarda posee valores muy elevados, el modelo se ajusta a la ecuacin de Monod debido que el

similitud con el modelo multiplicativo, donde el factor

, siempre

mayor que 1, corrige los bajos valores de que suele entregar el modelo multiplicativo cuando las constantes de afinidad (K s) son mayores a uno; sin embargo, dado los bajos valores de Ks para este caso, este factor no causa un efecto significativo sobre . Se debe indicar adems, que los sistemas de ecuaciones obtenidos para cada caso (modelo aditivo y ponderado) poseen solucin analtica, sin embargo la complejidad de las ecuaciones resultantes hacen difcil su evaluacin, por lo que es necesario el uso de software matemticos avanzados.

5. CONCLUSIN

El comportamiento de las variables obtenidas mediante el modelo ponderado es similar a los perfiles de limitacin simple por Monod en funcin de la tasa de dilucin. Sin embargo se requieren datos experimentales para comprobar la representatividad de este modelo. En cuanto al modelo aditivo, en este caso carece de validez, dado que sobredimensiona el sistema.

REFERENCIAS

Acevedo F, Gentina JC, Illanes A. 2002. Fundamentos de Ingeniera Bioqumica 3rd ed. Valparaso: Ediciones Universitarias de Valparaso. Pontifica Universidad Catlica de Valparaso. Bader FG. 1978. Analysis of Double-Substrate Limited Growth. Biotechnology and bioengineering XX:183202. Blanch HW, Clark DS. 1997. Biochemical Engineering 2nd ed. New York: Marcel Dekker, Inc. Egli T, Zinn M. 2003. The concept of multiple-nutrient-limited growth of microorganisms and its application in biotechnological processes. Biotechnology Advances 22:3543. Gottschal JC. 1993. Growth kinetics and competition - some contemporary comments. Antonie van Leeuwenhoek 63:299313. Mankad T, Bungay HR. 1988. Model for microbial growth with more than one limiting nutrient. Journal of Biotechnology 7:161166. Monod J. 1949. The Growth of Bacterial Cultures. Annual review of microbiology 3:371394. Wolfram. 2010. Mathematica. Champaign, Illinois: Wolfram Research, Inc. Zinn M, Witholt B, Egli T. 2004. Dual nutried limited growth: models, experimental observations, and applications. Journal of Biotechnology 113:263279.

NOMENCLATURA
D = Tasa de dilucin (h-1) X = Concentracin de biomasa en el quimiostato (gL -1) Si = Concentracin de sustrato i en la alimentacin (gL -1) Qx = Productividad volumtrica de biomasa (gL -1h-1). = Velocidad especifica de crecimiento (h -1) max = Velocidad mxima de crecimiento (h-1) ksc = Constante de saturacin con respecto a la fuente de carbono (gL -1) ksn = Constante de saturacin con respecto a la fuente de nitrgeno (gL -1) Y(XC) = Rendimiento de produccin de biomasa con respecto a la fuente de carbono (g biomasa/g glucosa) Y(Xn)= Rendimiento de produccin de biomasa con respecto a la fuente de nitrgeno (g biomasa/g sulfato amonio.) F = Flujo de alimentacin (L h-1) V = Volumen del quimiostato (L) SC = Concentracin de la fuente de carbono en el quimiostato (gL -1) Sn = Concentracin de la fuente de nitrgeno en el quimiostato (gL -1) Sco = Concentracin de la fuente de carbono en la alimentacin del quimiostato (gL-1) Sno= Concentracin de la fuente de nitrgeno en la alimentacin del quimiostato (gL-1)