A N L I S I S III

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO FESC CAMPO 1 Profesores: Vargas Martnez Mara Gabriela Hernndez Matamoros Pablo Equipo: 3 REPORTE DE LABORATORIO: Prctica convencional de Cromatografa de Lquidos de Alta Resolucin (HPLC). Determinacin de clorhidrato de fenilefrina en medicamentos comerciales, mediante una curva de calibracin. Grupo: 1552 Qumico Farmacutico Bilogo Fecha de entrega: 14 de septiembre del 2006

OBJETIVOS: Conocer los componentes bsicos del cromatgrafo de lquidos de alta resolucin (HPLC), as como su manejo y cuidados necesarios. Seleccionar las condiciones instrumentales ptimas para la cuantificacin de Clorhidrato de Fenilefrina en medicamentos comerciales. Aplicar los conocimientos tericos adquiridos para efectuar adecuadamente la cuantificacin de Clorhidrato de fenilefrina en medicamentos comerciales mediante la realizacin de una curva de calibracin en HPLC. De manera experimental, conocer las partes que componen al equipo para Cromatografa de Lquidos de Alta Resolucin, as como su funcionamiento mediante su uso en la cuantificacin de clorhidrato de fenilefrina en un producto farmacutico. Interpretar de manera adecuada el cromatograma obtenido posterior a la lectura de los sistemas para la

LABORATOR IO

graficacin de la curva de calibracin y de sta manera correlacionarla con la de nuestro analito problema. Identificar y analizar los parmetros del cromatograma, como tiempo de retardo (tr), ancho de la columna (w) y altura, y de sta manera obtener matemticamente el nmero de platos tericos y el AEPT, finalizando con su anlisis en la interpretacin de los resultados. Concluir de manera concreta si el mtodo de HPLC fue adecuado para la cuantificacin de clorhidrato de fenilefrina en la muestra farmacutica, y de sta manera obtener el % presente en el problema y establecer si cae el resultado dentro de los lmites de aceptacin.

INTRODUCCIN: La cromatografa de lquidos de alta eficacia es la tcnica analtica de separacin y cuantificacin ms ampliamente utilizado, con unas ventas anuales de equipo de HPLC que se aproximan a la cifra de mil millones de dlares. Las razones de la popularidad de sta tcnica son su sensibilidad, su fcil adaptacin a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la separacin de especies no voltiles o termolbiles y, sobre todo, su gran aplicabilidad a sustancias que son de primordial inters en la industria, en muchos campos de la ciencia y para la sociedad en general. Algunos ejemplos de stos materiales incluyen: aminocidos, protenas, cidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, frmacos, terpenoides, plaguicidas, antibiticos, esteroides, especies organometlicas y una variedad de sustancias inorgnicas. Con el objeto de alcanzar un caudal de eluyente razonablemente con rellenos de tamao de partcula entre 2 y 10 m, que, por otra parte, son comunes en la moderna cromatografa de lquidos, re requieren presiones de cientos de kg-fuerza por centmetro cuadrado. Como consecuencia de estas elevadas presiones el equipo de HPLC debe contar con sistemas de bombeo, que stos a su vez deben cumplir con ciertos requisitos, como la generacin de presiones por encima de 6.000 psi, un flujo libre de pulsaciones, un intervalo de caudales de 0.1 a 10ml/min, el control y la reproducibilidad del caudal mejor del 0.5 por 100 relativo y componentes resistentes a la corrosin (juntas de acero inoxidable o Tefln). Debe subrayarse que las altas presiones que genera las bombas de HPLC no constituyen un riesgo de explosin, debido a que los lquidos no son muy compresibles. Las columnas para HPLC se construyen de ordinario con tubo de acero inoxidable de dimetro interno uniforme, aunque en algunas ocasiones se encuentran tubos de vidrio de paredes resistentes. La mayora

tiene una longitud entre 10 y 30 cm, en algunas ocasiones se pueden encontrar columnas configuradas con forma helicoidal aunque el resultado es una cierta prdida de eficacia. El dimetro interno es a menudo de 4 a 10 mm y los tamaos de las partculas de los rellenos ms comunes son 5 o 10 m. Se han utilizado 2 tipos de relleno: el peculiar y el de partcula porosa; el primero consiste en bolas de vidrio o de polmero, no porosas y esfricas con unos dimetros caractersticos de 30 a 40 m, en la superficie de stas bolsas se depositan una capa delgada y porosa de slice, almina, de una resina sinttica de poliestireno-divinilbenceno o de una resina de intercambio inico. Los tpicos rellenos de partculas porosas estn formados por micropartculas porosas con dimetro entre 3 y 10 m y con la menor dispersin posible con respecto a un tamao determinado. Las partculas son de slice, almina, de una resina sinttica de poliestirenopolivinilbenceno o resinas de intercambio inico, aunque las de slice son ms utilizadas. En enlace siloxano (Si-O-Si) por medio del cual la fase estacionaria se une al soporte es estable en un intervalo moderado de pH (tpicamente 2 a 8). La cobertura aproximada es de 4 mol de grupos R por metro cuadrado de rea superficial del soporte, con muy poca salida de fase estacionaria desde la columna durante la cromatografa. Se obtienen excelentes separaciones con una fase estacionaria ligada sobre partculas microporosas con dimetro de 3 a 5 m. Es comn obtener 50 000 a 100 000 platos tericos por metro de longitud de columna. Cuando una fase polar est unida al soporte y se utiliza un solvente menos polar como fase mvil, se habla de cromatografa de fase normal , la fuerza eluotrpica del solvente aumenta por la adicin de un solvente ms polar. El esquema ms importante y comn en el que se utiliza una fase con enlace no polar y un solvente polar se denomina cromatografa de fase inversa, en este caso, la fuerza eluotrpica aumenta por la adicin del solvente menos polar. Esta ltima permite realizar excelentes separaciones y elimina la formacin de colas en los picos asociada con la absorcin de compuestos polares por empaques polares.

MATERIALES Y REACTIVOS: 1 vaso de p.p. 250ml 6 matraces aforados de 10ml 1 matraz aforado de 50ml 1 matraz aforado de 25ml 6 pipetas volumtricas: 1ml, 2ml, 3ml, 4ml y 5ml 1 micropipeta de 100l 1 agitador de vidrio 1 balanza analtica 1 balanza digital 1 cromatgrafo de lquidos de alta resolucin

1 pizeta 1 esptula 1 perilla Fase mvil: cido actico-Trietanolamina-Agua (1.5:0.5:98) Reactivo analtico de fenilefrina Agua destilada Agua desionizada Solucin oftlmica con clorhidrato de fenilefrina

DIAGRAMA DE FLUJO DEL PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:

Preparacin de la fase mvil cido acticoTrietanolaminaAgua (1.5:0.5:98): Preparacin de la solucin estndar de fenilefrina: Preparacin del problema con la solucin oftlmica: SISTEMA #6

150ml agua desion. + 3ml c. Actico + 1ml trietanolamina Filtra r. Aforar a 200ml . Pesar 25mf fenilefrin Tomar 1ml Aforar a 25ml Aforar a 25ml Ultrasonido .

Dilui r

Tomar 0.1ml de la sol. Oft+lmica

Ultrasonido (sonicar). Dilui r. Aforar a 50ml.

Una vez preparadas las soluciones, sigue la preparacin de los sistemas: Sistema Sol. Stock Sol. Prob. Aforo 1 1ml 10ml 2 2ml 10ml 3 3ml 10ml 4 4ml 10ml 5 5ml 10ml 6 0.1ml 50ml

Nota: El sistema 6 (columna sombreada) es el que se describi con los diagramas anteriormente, no se vuelve a diluir.

Las condiciones de trabajo son: Tipo de columna: C-18 de 25cm mvil: 1.5 ml/min Detector: UV-VIS a 272nm

Flujo de fase Volumen de

Se procede a la lectura de los sistemas, comenzando del ms concentrado al ms diluido, para posteriormente leer los problemas.

Equipo de HPLC. inyector. RESULTADOS: Tabla No. 1 Siste ppm Tr ma 1 3.992 1.21 5 2 7.984 1.33 9 3 11.97 1.33 rea1.3 207,424 429,711 829,681 rea1.3+
1.5

Sistema

W 0.207 0.255 0.345

608,996 429,711 829,681

Altur a 2.9 5.5 8.2

N 551.22 8 441.16 4 237.78

AEPT 0.0272 0.0340 0.0630

6 4 5 15.96 8 19.96 0

0 1.34 7 1.35 3 1,124,3 56 944,076 1,124,3 56 1,527,2 66 0.344 0.219 11.4 14.2

5 245.32 3 610.69 9 0.0611 0.0245

Las grficas se muestran a continuacin. ANLISIS DE RESULTADOS: El clculo de las concentraciones expresadas en ppm de cada sistema son: Clculo de la concentracin del stock: Peso de reactivo analtico de fenilefrina: 25mg.
25mgRCFen 99.8mgRAFen 1mmolFen x x = 4.909 x10 3 M 25ml 100mgRCFen 203.67 mgFen

Para el Sistema 1:
39.92 ppmFenx

4.909 x10 3 M 1.9636 x10 4 mmolFen 203.67 mgFen 1000ml x1ml = x x = 39.92 ppmFen 25ml 1ml 1mmolFen 1l

1ml = 3.992 ppm 10ml

Anlogo con los dems sistemas, slo vara el volumen de alcuota (1ml, 2ml, 3ml, 4ml y 5ml). Las ecuaciones de las curvas anteriores son: Tabla No. 2. Ecuacin de la curva rea1.3 vs ppm. Curva de calibracin de fenilefrina rea1.3 vs ppm A= 56,664.9 = b r2 = 0.8218 B= 54,307.3396 = m Ecuacin: rea=54,307.3396(ppm)+56,664.9 r = 0.9065 Tabla No. 3. Ecuacin de la curva rea1.3+1.5 vs ppm. Curva de calibracin de fenilefrina rea1.3+1.5 vs ppm A= 144,646.5 = b r2 = 0.8491 B= 63,406.4378 = m Ecuacin: rea=63,406.4378(ppm)+144,646.5 r = 0.9214 Tabla No. 4. Ecuacin de la curva Altura vs ppm. Curva de calibracin de fenilefrina Altura vs ppm A= -0.11 = b r2 = 0.9986 B= 0.7139 = m Ecuacin: ltura= 0.7139(ppm)-0.11 r = 0.9993 Podemos observar entre la linealidad de las curvas contempladas con el rea, no corresponden con un comportamiento de tipo lineal, aunque los

datos de rea de 1.3 + 1.5 obtuvieron un coeficiente de determinacin ligeramente ms grande, debido quiz a que se est contemplando el rea bajo toda la curva o pico, sin embargo, en el de rea 1.3, slo se contempla una fraccin de rea y por lo tanto es ms errneo el anlisis. Sin embargo se decidi trabajar con los datos de altura, ya que podemos observar que el coeficiente de determinacin es mayor de 0.98 y por lo tanto tiene un mejor comportamiento lineal, adems de que en los cromatogramas se observ claramente como iba ascendiendo la altura con forme la concentracin iba aumentando, mientras que en el rea, en los sistemas 1 y 5 se observ un doble pico y en los sistemas 2, 3 y 4 slo se observ 1 solo pico. En anlisis que efectuamos en relacin con lo anterior, podemos decir que de cierta manera influy la fase mvil, ya que para la lectura de los sistemas 1 y 5 que precisamente es el ms concentrado y el ms diluido, se utiliz un frasco y para los dems sistemas se utiliz otro, aunque tericamente contienen los mismos componentes en la misma proporcin. Podemos decir que probablemente en la fase mvil del primer frasco de lectura tena menos trietanolamina, ya que al haber menos trietanolamina, quedan grupos Si-OH sin reaccionar con sta e interactan con la fenilefrina, observndose un dato de tiempo de retardo extra, que precisamente corresponde a aquella pequea fraccin de fenilefrina que se tard en la columna por interaccionar con ella. Para haber evitado el error, podramos hacer 2 cosas, una de ellas es utilizar una columna donde se le halla hecho una segunda reaccin para eliminar la interferencia que observamos a causa de los grupos R-Si-OH residuales, o podramos haber incrementado el pH de la solucin de fenilefrina para volverla menos inica y por lo tanto no interacciona con los grupos R-Si-OH. Decimos que la fenilefrina interaccion con dichos grupos ya que como la fenilefrina, por tener nitrgeno, se puede protonar a pH cido, volverse ms inica y por lo tanto ms polar e interaccionar con los grupos polares OH del grupo R-Si-OH. Sin embargo al aumentar el pH, provocamos que el nitrgeno est desprotonado y por lo tanto sea menos inico y menos polar y de sta manera ya no interacciona con los hidrfilo del R-Si-OH. Pero como el error estuvo en la fase mvil, quiz la explicacin anterior fue lo que pas. La trietanolamina que tambin tiene nitrgeno, reacciona con los grupos residuales de R-Si-OH y la vuelve menos polar, y al pasar la fenilefrina no interacciona con ella. D acuerdo con la siguiente tabla: Tabla No. 5. Datos estadsticos de tr, N y AEPT. Dato Desviacin Promedio estndar Coeficiente de variacin

tr N AEPT

0.05148 153.4347 0.01670

1.3168 417.2398 0.04196

0.039 0.3677 0.398

Donde: Tr = tiempo de retardo N = nmero de platos tericos AEPT = altura equivalente del plato terico W = ancho de la base del pico Donde, de manera sencilla, el tiempo de retardo es aquel tiempo que est presente el analito en la columna, o bien el tiempo que interacciona el analito con la columna. El plato terico son pequeos equilibrios que se dan dentro de la columna, la cual hace ms eficiente cuando el nmero de platos tericos es mayor, el fundamente es similar al de destilacin fraccionada. La AEPT es con relacin a la longitud de la columna. Al tener coeficientes de variacin menores al 2.0%, podemos decir que nuestro datos estn dentro de los lmites de confianza. Como el rea bajo la curva del pico y la altura son proporcionales a la concentracin, tomaremos la altura para cuantificar por lo antes mencionado. Ahora proseguiremos a la cuantificacin: Con los datos de la curva de calibracin Altura vs ppm de la Tabla No. 4: 8.65cm x = 12.27 ppm; donde el 8.65 es la altura del pico de nuestro analito problema (fenilefrina9.
12.27 mg 50ml x = 6.135 ppm 1l 0.1ml

Si el marbete deca: Por cada 100ml hay 500mg de fenilefrina. Por lo tanto: Ahora: 6.135mg ------ 1 litro X ------ 0.1 litro (100ml) X = 122.7% X= 613.5mg

500 mg ----- 100% 613.5mg ----X

Por lo visto, no entra dentro de los lmites de aceptacin 96-105%, sino que se excede dentro de ste intervalo. Lo podramos considerar como no aceptable debido a que hasta sobrepasa el intervalo, sin embargo el exceso de masa que obtuvimos podra ser a que se utiliz el frasco de fase mvil de la primera lectura, o a que se tom en cuenta la altura del pico ms alto sin tomar en cuenta el doble pico, debido a todos estos factores que influyeron, no podemos decir que el resultado es o no aceptable, ya que los resultados no son confiables porque no se obtuvieron con la misma fase mvil. Sin embargo podramos decir que podra estar dentro de los

parmetros ya que al disminuir el error, podra traer como consecuencia la disminucin del % y por lo tanto entrara dentro del intervalo de confianza. CONCLUSIONES: Concluimos, que se cumpli con la expectativa de la prctica, que fue manejar el equipo de HPLC y en base a los resultados obtenidos, analticamente cuantificar el contenido de fenilefrina en una muestra farmacutica, adems se conoci las partes de cromatgrafo de lquidos de alta resolucin y su funcionamiento, as como aprender como se leen muestras utilizando los pasos adecuados y de sta manera supimos analizar de manera general un cromatograma, identificando aquellas propiedades que son proporcionales a la concentracin para poder cuantificar, como el rea bajo la curva del pico y la altura del pico; matemticamente calculamos datos tericos como nmero de platos tericos y la altura equivalente del plato terico (AEPT). En base a las datos anteriores, se cuantific fenilefrina de manera correcta aunque el resultado fue un poco exagerado en el % del contenido de ste en la muestra farmacutica. Por lo tanto, concluimos que todos los objetivos citados al inicio de ste reporte de laboratorio se cumplieron satisfactoriamente. OBSERVACIONES: El proceso de sonicacin, se realiz para eliminar el oxgeno presente en la disolucin, es decir, las posibles burbujas que pudieran estar presente y que por lo tanto alterara el Tr del analito y de la presin de la bomba. En los datos experimentales se sum ambas reas, el de 1.3 y 1.5 ya que podramos pensar que, como se muestra en la figura, se podra tener un error debido a que el rea sombreada se estara sumando 2 veces, sin embargo, lo que hace el equipo es que en el momento de presentarse un pico (hombro), a un costado de otro pico, traza una lnea a la mitad de ambos picos y cada valor de rea representa a una mitad y por lo tanto si se pueden sumar.

Se llev a cabo una cromatografa de fase inversa, ya que nuestra columna es no polar por presentar cadenas de 18 C y una fase mvil polar por presentar agua en una proporcin de 98 con respecto a los dems. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS: Harris, D. 1992. Anlisis Qumico Cuantitativo. Editorial Iberoamericana. Mxico, D.F. Willard, H. 1991. Mtodos instrumentales de anlisis. Editorial Iberoamericana. Mxico, D.F.

 Skoog, D. A. 2001. Principio de Anlisis Instrumental. 5 Edicin. Editorial Mc Graw-Hill. Madrid, Espaa.