EFECTO DE LAS VARIABLES OPERACIONALES DEL PROCESO DE FANGOS ACTIVOS EN LA ACTIVIDAD EXOENZIMTICA DEL GRUPO MYCOLATA

A. Zornoza, P. Gil, I. Amors y J.L Alonso

(Dedicado a la memoria del Dr. Gonzalo Cuesta Amat) Instituto Universitario de Ingeniera del Agua y Medio Ambiente (IIAMA). Universitat Politcnica de Valncia, 46022 Valencia, Spain (E-mail: anzorzor@upv.es, iamoros@ihdr.upv.es, jalonso@ihdr.upv.es)

1. INTRODUCCIN.
La formacin de espumas de origen biolgico (foaming) se presenta como uno de los problemas ms importantes de separacin del fango activo que ocurren con frecuencia en las estaciones depuradoras de aguas residuales (EDAR), disminuyendo la calidad del euente tratado (gura 1).

3. RESULTADOS Y DISCUSIN.
Se identic a Gordonia amarae como la especie dominante, dentro del grupo Mycolata y gnero Gordonia sp., en el licor mezcla y en las espumas (gura 5). CT1 y CT2 presentaron mayor abundancia de lamentos que QB, mientras que esta ltima mostr un rango ms amplio (tabla 4).
Tabla 4- Media, desviacin estndar (DE) y rango de la cuantificacin de bacterias filamentosas y actividades enzimticas
EDAR QB Variables biolgicas Gordonia sp. (Gor0596) Gordonia amarae (Gor205) Mycolata (Myc657) Actividad fosfatasa Actividad -glucuronidasa
(ejes F1 y F2: 99,52 %)
3

Fig. 1 Espumas biolgicas en el reactor biolgico y decantador secundario.

Fig. 5 Gordonia amarae. Sonda Gor205, 1000x (FISH)

EDAR CT1 Media DE 4.5 1.1 4.5 1.1 4.2 1.2 1.8 0.8 1.1 0-3 Rango 2-5 2-5 2-5 1-3 1-2

EDAR CT2 Media DE 4.7 0.8 4.7 0.8 4.5 0.5 1.7 0.8 1.4 0.5 Rango 2-5 2-5 4-5 1-3 1-2

Media DE 3.9 1.9 3.9 1.9 3.8 1.8 1.7 0.9 0.8 0.5

Rango 0-5 0-5 0-5 0-3 0-2

Entre las bacterias lamentosas responsables de los episodios de foaming se encuentran los actinomicetos nocardioformes productores de cidos miclicos (grupo mycolata), siendo Gordonia amarae-like organisms (GALO) el que mayores problemas ocasiona en las EDAR.
2

F2 (2,79 %)

EF
0

OD alto

TRHr

Fig. 2 Nocardioformes (GALO). Contraste de fases, 400x (a) y 100x (b).

Algunos estudios han detectado actividad exoenzimtica (AE) fosfatasa y -glucuronidasa en bacterias del grupo mycolata, como los gneros Gordonia y Skermania [1], [5]. Sin embargo, no existen estudios estadsticos multivariantes que relacionen la variacin de dicha AE con las condiciones ambientales en las EDAR. El objetivo de este trabajo fue estudiar la relacin entre la AE (fosfatasa y -glucuronidasa) del grupo mycolata y GALO, integrando la tcnica de hibridacin in situ con sondas marcadas con uorforos (FISH) y el substrato ELF 97, y los parmetros operacionales rutinarios de la EDAR. Para ello se efectu un anlisis de redundancia (RDA), basado en un anlisis de ordenacin ambiental directo del gradiente [4]. Los resultados obtenidos han permitido establecer aquellos parmetros operacionales que explican la variacin de las AE, aportando de esta forma nuevos datos para el control de los episodios de foaming.

La tcnica FISH se basa en la hibridacin directa con una sonda complementaria de una regin del gen 16S rRNA o 23S rRNA. La sonda est marcada de tal forma que los hbridos formados se pueden detectar facilmente con un microoscopio de epiuorescencia.

El RDA de los parmetros operacionales, AE y especies de la EDAR QB (gura 6), EDAR CT CM (CT1+CT2) (gura 7) y la matriz global (QB+CT) (gura 8) muestra una proximidad del conjunto de variables biolgicas. Las AE se relacionaron con temF1 (96,73 %) peratura (Tr) baja, siendo esta inferior en el caso de la Fig. 6 Diagrama de ordenacin del RDA entre parmetros operacionales y variables actividad fosfatasa. biolgicas en la EDAR QB. La relacin de las AE con la edad del fango (EF) pre(ejes F1 y F2: 94,88 %) sent comportamiento contrario en las EDAR; en QB se relacionaron con EF baja y CT lo hizo con valores TRHr altos, debido en esta ltima a su estrecho rango (tabla 3). En la matriz global las AE se relacionaron con valores bajos de la EF. OD alto Glucuronidasa La relacin de las AE con la carga msica (CM) tamFosfatasa EF bin present diferencias entre QB (con alta carga) y G. amarae CT (con baja carga), relacionndose en el caso de la Myc Tr OD medio matriz global con valores cercanos a la media. El CM tiempo de retencin hidralico (TRHr) present OD bajo diferentes rangos en ambas EDAR, el gradiente en F1 (65,14 %) QB mostr una baja variabilidad y en CT las AE se Fig. 7 Diagrama de ordenacin del RDA entre parmetros operacionales y variables asociaron con valores medios. En la matriz global se biolgicas en la EDAR CT. asociaron con valores bajos del TRHr. El nivel de ! oxgeno disuelto (OD) por encima de 0.8 ppm, a pesar (ejes F1 y F2: 96,65 %) de presentar baja variabilidad, inuy positivamente en la abundancia de las AE.
Tr
-1

OD bajo

OD medio

Fosfatasa Glucuronidasa G. amarae Myc

El ndice de actividad fosfatasa de Gordonia amarae fue superior al de actividad -glucuronidasa. Las AE identicadas en el grupo mycolata estn de acuerdo con los resultados encontrados por otros autores [1], [2], [5].

-2

-3

-5

-4

-3

-2

-1

1,6

1,2

F2 (29,73 %)

0,8

0,4

-0,4

-0,8

-1,2

-2,4

-2

-1,6

-1,2

-0,8

-0,4

0,4

0,8

1,2

1,6

2,4

2,8

1,5

EF TRHr OD bajo Tr Fosfatasa Glucuronidasa G. amarae OD alto Myc OD medio CM

F2 (7,41 %)

0,5

-0,5

2. MATERIALES Y MTODOS.
Las muestras de fango activo fueron tomadas en 3 reactores biolgicos de 2 EDAR (CT1, CT2 y QB) de carga media con problemas de foaming durante un periodo de 7 meses (48 muestras). El tratamiento de las muestras en la tcnica FISH se realiz segn las especicaciones descritas en [5]. Las sondas de oligonucletidos utilizadas para la identicacin de las bacterias lamentosas fueron; Myc657 (mycolata),Gor0596 (Gordonia sp.) y Gam205 (Gordonia amarae).

-1

4. CONCLUSIONES.
2 2,5 3 3,5

-1,5

-2

-3

-2,5

-2

-1,5

-1

-0,5

0,5

1,5

F1 (89,24 %)

Fig. 8 Diagrama de ordenacin del RDA entre parmetros operacionales y variables biolgicas en la matriz global (EDAR CT+QB)
Tr: temperatura en el reactor OD: oxgeno disuelto TRHr: tiempo de retencin hidralico en el reactor EF: edad del fango Myc: mycolata CM: carga msica

* La presencia de actividad exoenzimtica fosfatasa y -glucuronidasa de Gordonia amarae en episodios de foaming hacen interesante el empleo de estas tcnicas para su control y seguimiento. * Segn los resultados obtenidos; edad del fango alta, carga msica baja y elevado tiempo de retencin hidrulico en el reactor biolgico se plantean como posibles estrategias operacionales para el control del foaming causado por Gordonia amarae en estaciones depuradoras que operan a media carga. * La baja temperatura en el reactor se asoci con un elevado ndice de actividad exoenzimtica fosfatasa y -glucuronidasa.

Fig. 3 Protocolo de hibridacin en la tcnica FISH.

El indice de abundancia de lamentos (IF) en las muestras se determin mediante criterio subjetivo basado en una escala ordinal de 0 (ninguno) a 5 (>20 l/culo) [3] (tabla 1).
Tabla 1 Escala criterio subjetivo de Eikelboom.
IF 0 1 2 3 4 5 Abundancia Ninguno Pocos Algunos Comn Muy comn Abundante Explicacin No se observan Se observa en un flculo ocasional Comunes pero no presentes en todos los flculos En todos los flculos con una densidad 1-5/floc. En todos los flculos con una densidad 5-20/floc En todos los flculos con unadensidad > 20 fil/floc.

El indice de actividad enzimtica (IA) detectada in situ se evalu con una puntuacin subjetiva clasicando las observaciones en una escala ordinal de 0 (no se detectan clulas del lamento con actividad enzimtica) a 4 (se detecta el 75-100 % de clulas del lamento con actividad enzimtica) (tabla 2).

Tabla 2 Criterio subjetivo de valoracin de la actividad enzimtica

ndice de actividad 0 1 2 3 4 Actividad en el flculo 0 % actividad 0% < actividad 25% 25% < actividad 50% 50% < actividad 75% 75% < actividad 100%

5. REFERENCIAS.
[1] Alonso, J.L., Gil, P., Amors, I., Jones, A.I. and Cuesta, G. (2009) Extracellular phosphatase and glucuronidase activities of mycolata in activated sludge foams.15th International Symposium on the Biology of Actinomycetes. Shanghai (China), 20-25 August 2009. [2] Carr, E.L., Eales, K.L. and Seviour, R.J. (2006) Substrate uptake by Gordonia amarae in activated sludge foams by FISH-MAR. Water Sciencie and technology 54(1):39-45. [3] Eikelboom, D.H. (2000) Process control of activated sludge plants by microscopic investigation. IWA Publishing, London. [4] Leps, J. and Smilauer, P. (1999) Multivariate analysis of ecological data. Faculty of Biological Sciencies, University of South Bohemia, Cesk Budejovice. [5] Schade, M. and Lemmer, H. (2006) In situ enzyme activities of lamentous scum bacteria in municipal activated sludge wastewater treatment plants. Acta Hydrochim. Hydrobiol. 34: 480-490.

O CI NH N CI

Los parmetros operacionales utilizados se muestran en la (tabla 3). Los valores de oxgeno disuelto en el reactor fueron distribuidos en tres intervalos (0.8, 0.8-2 y >2 ppm), expresados en porcentaje de tiempo (%).
Tablaoperacionales 2 Criterio subjetivo de valoracin de la Tabla 3- Media, desviacin estndar y rango de los parmetros actividad enzimtica
EDAR ndice deQB actividad Parmetros Temperatura Carga msica Tiempo de retencin hidrulico Unidades C Kg DBO5/Kg SSVLM.d h dias % % % Media DE 0 Rango 1 21 4 17-29 2 0.24 0.10 30.08-0.47 16.1 1.3 4 14-18 9.3 5.7 35 22 57 23 8 11 5-29 5-69 12-95 0-40 EDAR CT1 Actividad en el flculo
0 % actividad Media DE Rango 0% < actividad 25% 22 4 17-29 25% < actividad 50% 0.29 0.11 0.14-0.57 50% < actividad 75% 75% < actividad 100% 4.2 0.4 3.7-5.0

O 2 Na O P O O

La presencia de la AE se determin utilizando el sustrato ELF (ELF-97, Molecular Probes; www.probes.invitrogen.com) y la metodologa descrita en [5] . Se evaluaron las siguientes enzimas; ELF-97 -D-glucuronidasa (ELF-97 -D-glucuronide) y ELF-97 fosfatasa (ELF-97 endogenous phosphatase detection kit), y estas se identicaron mediante precipitados de cristales (amarillo-verdoso) visibles en la supercie celular con microscopa de epiuorescncia (gura 4).

ENZIMA

EDAR CT2 Media DE 22 4 0.26 0.09 5.5 0.4 6.7 2.7 27 13 43 4 31 12 Rango 17-29 0.15-0.51 5.1-6.2 3-12 0-50 36-49 13-61

SUSTRATO ELF 97 PHOSPHATASE SUSTRATO

HIDROLISIS

PRECIPITADO (Alcohol ELF 97)

Edad del fango Oxgeno bajo (< 0.8 mg/L) Oxgeno medio ( 0.8-2 mg/L) Oxgeno alto ( > 2 mg/L)

5.6 1.6 19 8 46 7 33 13

3-8 3-34 31-63 10-59

SUSTRATO ELF 97 GLUCURONIDE

O CI NH N O C OH O OH HO OH CI

El anlisis estadstico directo del gradiente se realiz con el programa XLSTAT-ADA 2013 (Addinsoft).Todas las variables fueron previamente normalizadas con una transformacin logartmica. El test de permutacin realizado sugiri la conveniencia de utilizar un mtodo lineal (RDA).

Fig. 4 Determinacin de actividades exoenzimticas.

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