Prctica Aplicacin de la derivatizacin para la determinacin de cido ascrbico en jugo

Introduccin Para construir una recta de calibrado por el mtodo del estndar externo, se preparan 4 5 disoluciones estndar con concentraciones conocidas y crecientes del analito y adems uniformemente distribuidas a lo largo del intervalo seleccionado. Los estndares deben tener igual concentracin de los dems reactivos necesarios para la preparacin de la muestra. Adicionalmente, se prepara un blanco que solo difiere de los estndares en que no contiene al analito. Ya preparados los estndares, se inyectan al cromatgrafo y se grafica su rea (o altura) frente a las respectivas concentraciones. Si su coeficiente de determinacin es mayor a 0.99 se utilizar para determinaciones cuantitativas, de otra forma hay que preparar nuevamente los estndares. La cuantificacin del analito se realiza por interpolacin, usando la ecuacin de la lnea recta obtenida para la calibracin. La recta de calibracin externa tiene la ventaja de que es vlida para una gran cantidad de muestras, siempre y cuando sean preparadas el mismo da que la curva. No obstante, existe el riesgo de errores positivos o negativos, debido a que para una misma concentracin de analito en presencia de la matriz de la muestra, la intensidad de la seal analtica puede ser mayor o menor que la seal obtenida cuando el estndar del analito usando solo el solvente (ausencia de matriz). A dicho fenmeno se conoce como efecto de la matriz. Las determinaciones cuantitativas por GC-MS normalmente se realizan en el modo SIM, en el que el analizador de iones del espectrmetro se ajusta para que sea atravesado por unos cuantos iones, sin realizar los barridos en un amplio intervalo de m/z. La seales de dichos iones se registran en funcin del tiempo, obtenindose un cromatograma para cada m/z. La seleccin del ion a analizar debe presentar la mayor sensibilidad y la mejor selectividad.

Objetivo Determinar la concentracin de cido ascrbico en jugo por GC/MS aplicando la derivatizacin como tratamiento de la muestra. Metodologa Materiales Viales, 1.5 mL Insertos, 500 L Tubos de centrfuga Filtros para jeringa (0.45 m) Jeringas (3 mL) Micropipetas Puntas para micropipetas Equipo Centrfuga Liofilizadora Cromatgrafo de gases Metodologa Procedimiento A. Preparacin de las disoluciones estndar de cido ascrbico 1. Preparar una solucin acuosa de 1000 mg/L de cido ascrbico. 2. A partir de la solucin anterior, tomar el volumen necesario para preparar 1 mL de cada una de las siguientes disoluciones estndar de cido ascrbico: 50, 100, 200, 400, 600, y 800 mg/L. 3. De cada disolucin estndar, tomar una alcuota de 100 L y colocarla en un vial. 4. Reducir el cido ascrbico con mercaptoetanol, segn el procedimiento C. 5. Liofilizar la solucin obtenida y derivatizar con HDMS, segn procedimiento D. Procedimiento B. Tratamiento del jugo y de la muestra problema 1. 2. 3. 4. Tomar una alcuota de 10 mL del jugo. Centrifugar a 5000 rpm durante 4 minutos. Filtrar el sobrenadante a travs de filtro de membrana de 0.45 m. Recolectar el filtrado en un vial. Sustancias cido L-ascrbico (99.5% de pureza) Mercaptoetanol Hexametildisilazano (HMDS) Acetonitrilo grado HPLC

Llevar a cabo los procedimientos C y D por duplicado para cada muestra.

Procedimiento C. Reduccin del cido ascrbico del jugo y de los estndares 1. Tomar 100 L del filtrado en el caso del jugo, y 100 L de la solucin problema. 2. Aadir a cada muestra 100 L de mercaptoetanol 10 mM con el objeto de reducir todo el cido ascrbico que haya sido oxidado. De esta forma, se determinar el contenido total de cido ascrbico. 3. Incubar cada muestra durante 10 min a temperatura ambiente. 4. Liofilizar las soluciones obtenidas. Procedimiento D. Derivatizacin de las muestras y de los estndares 1. A cada una de las muestras liofilizadas (para disminuir la descomposicin del cido ascrbico por efecto del agua y el oxgeno) aadir en el siguiente orden 800 L de acetonitrilo y 200 L de HMDS (relacin final 4:1) para obtener el derivado sililado del cido ascrbico. 2. Introducir al horno de microondas durante 5 min a 180 W de forma que la energa requerida para la reaccin de derivatizacin se dirija ms homogneamente a los enlaces qumicos, asegurando y acelerando el proceso de sililacin, evitando as la posible descomposicin trmica de la muestra por simple calentamiento. 3. Colocar los viales en el auto muestreador. Condiciones cromatogrficas y de deteccin 30 m x 0.25 ID x 0.25 um 5% difenil, 95% dimetil polisiloxano He 0.8 mL/min Split - con divisin (50:1) 300 1 L Relacin, Valor, C Mantener, min C/min 150 1.96 30C 320 5.88 Masas, modo SCAN y modo SIM * Detector 300 C Temperatura de la interfase * Para el modo SIM es necesario proporcionar ventanas de tiempo. Una ventana de tiempo es un intervalo de tiempo durante el cual el detector va a estar buscando los iones de las m/z seleccionados. El criterio para una buena ventana de tiempo generalmente considera 1 min tomando como base el tR del analito o compuesto a determinar. Ejemplo, tR = 10 min, ventana de tiempo: lmite inferior 9 min (10 -1 min), y lmite superior 11 min (10 + 1 min). Dimensiones de la columna Fase estacionaria Fase mvil Flujo Modo de inyeccin Temperatura de inyector Volumen de inyeccin Programa de temperatura