10 Estudio Cerveza y Sistema Inmunologico 69 PDF

Consumo moderado de cerveza.
Estudio nutricional e inmunolgico en humanos y animales de experimentacin
Este trabajo ha sido realizado por el siguiente grupo de investigacin: Ligia Esperanza Daz Dra. Marcela Gonzlez-Gross Javier Romeo Dra. Ana Isabel Vallejo Dra. Ascensin Marcos.
GRUPO INMUNONUTRICIN. DPTO. METABOLISMO Y NUTRICIN. INSTITUTO DEL FRO CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS. MADRID, ESPAA. DPTO. DE FISIOLOGA. FACULTAD DE MEDICINA Y ODONTOLOGA. UPV/EHU
SUMARIO
1 2 3
INTRODUCCIN ...................................................................................... 6 ANTECEDENTES ........................................................................................7 HIPTESIS DE TRABAJO .......................................................................... 9

3.1. Estudio en humanos . ....................................................................... 9 3.2. Estudio en animales de experimentacin . ........................................ 9
OBJETIVOS ........................................................................................... 10
4.1. Estudio en humanos ....................................................................... 10 4.2. Estudio en animales de experimentacin ........................................ 10
METODOLOGA ...................................................................................... 11
5.1. Metodologa del estudio en humanos . ............................................. 11 5.1.1. Sujetos ..........................................................................................11 5.1.2. Diseo experimental ........................................................................11 5.1.3. Parmetros estudiados .....................................................................12 5.1.4. Descripcin de la metodologa ..........................................................14 5.1.5. Tratamiento estadstico de los datos obtenidos en humanos .................24 5.2. Metodologa del estudio en animales de experimentacin ................ 25 5.2.1. Animales de experimentacin ...........................................................25 5.2.2. Diseo experimental ........................................................................25 5.2.3. Metodologa ...................................................................................27 5.2.4. Desarrollo de los estudios.................................................................28 5.2.5. Tcnicas analticas ..........................................................................28 5.2.6. Tratamiento estadstico de los datos obtenidos en animales de experimentacin .......................................................34
DATOS EXPERIMENTALES ........................................................................ 36

6.1. Estudio en humanos ....................................................................... 36 6.2. Estudio en animales de experimentacin ..........................................51
RESULTADOS ...........................................................................................54
7.1. Estudio en humanos . ........................................................................54 7.1.1. Parmetros dietticos........................................................................54 7.1.2. Parmetros antropomtricos...............................................................56 7.1.3. Parmetros hematolgicos .................................................................62 7.1.4. Parmetros bioqumicos.....................................................................81 7.1.5. Parmetros inmunolgicos .................................................................92 7.2. Estudio en animales de experimentacin . ........................................107 7.2.1. Parmetros dietticos ......................................................................107 7.2.2. Parmetros ponderales.....................................................................108 7.2.3. Parmetros inmunolgicos ...............................................................115
DISCUSIN ...........................................................................................128
8.1. Estudio en humanos. .......................................................................128 8.1.1. Parmetros dietticos ......................................................................128 8.1.2. Parmetros antropomtricos .............................................................128 8.1.3. Parmetros hematolgicos................................................................129 8.1.4. Parmetros bioqumicos ...................................................................130 8.1.5. Parmetros inmunolgicos ...............................................................134 8.2. Estudio en animales de experimentacin. .........................................137 8.2.1. Parmetros ponderales.....................................................................137 8.2.2. Parmetros inmunolgicos ...............................................................137
CONCLUSIONES .....................................................................................140
9.1. Estudio en humanos. .......................................................................140 9.2. Estudio en animales de experimentacin. .........................................140
BIBLIOGRAFA ..................................................................................141
o
INTRODUCCIN
En los albores del siglo XXI, asistimos con cierta complacencia al avance del conocimiento cientfico en materia de nutricin, contribuyendo sin duda a llevar a la prctica la mxima de la Organizacin Mundial de la Salud de "aadir vida a los aos". En la actualidad, la mayora de los pases estn revisando las ingestas recomendadas de energa y nutrientes con el fin de incorporar el posible potencial preventivo que algunos o varios de ellos ejercen sobre las enfermedades crnicas no transmisibles que afectan a gran parte de la poblacin mundial. Resulta extremadamente novedosa la inclusin de algunos as denominados "no nutrientes" (o compuestos vegetales secundarios) a estas recomendaciones, ya que aunque no son esenciales para la vida humana, su ingesta parece relacionada con un efecto beneficioso sobre la salud. Tanto nutrientes como no nutrientes se encuentran en los alimentos y bebidas que consumimos y la eleccin y combinacin ptima de stos nos conducir a una dieta "funcional" y a una alimentacin saludable. La cerveza, debido a sus propiedades refrescantes y organolpticas, es una bebida de alta aceptacin en la poblacin. Su bajo contenido alcohlica y apreciable de nutrientes y compuestos vegetales secundarios ha aumentado el inters cientfico por conocer los efectos que un consumo moderado ejerce sobre la salud. En la evaluacin del estado nutricional, adems del anlisis de otros parmetros, el estudio de la inmunocompetencia es clave, debido a que es muy sensible a los cambios que pueden surgir en la ingesta y almacenes corporales de nutrientes. La constatacin de la escasez de bibliografa cientfica en relacin con los efectos del consumo moderado de cerveza sobre la salud, y la casi inexistente de los efectos sobre el sistema inmune, nos llev al planteamiento del presente estudio, cuyo objetivo ha sido comprobar si un consumo moderado de cerveza uede ejercer un efecto beneficioso sobre el estado nutricional e inmunolgico. El estudio que se presenta resulta completamente novedoso a nivel mundial.
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ANTECEDENTES
La asociacin entre el consumo de alcohol y los posibles beneficios o riesgos derivados de su consumo dependen, adems de factores individuales, de las cantidades consumidas, si bien hasta la fecha no se ha podido demostrar claramente que un tipo de bebida sea ms beneficioso que otro, dada la escasez de estudios realizados sobre este tema. En la bibliografa, el consumo moderado se fija en 10-12 g y 20-24 g de alcohol/da para mujeres y hombres, respectivamente, debido a la mayor susceptibilidad de las mujeres para metabolizar el alcohol (Gonzlez-Gross y col., 2000; Dietary Guidelines, 2002). El tipo de bebida no se ha considerado importante al definir el consumo moderado, porque slo se limita a la cantidad de alcohol. Sin embargo, aquellas bebidas alcohlicas que contienen antioxidantes y vitaminas del grupo B, como por ejemplo la cerveza, pueden ejercer un beneficio adicional sobre algunos parmetros nutricionales, ms all del efecto del alcohol per se sobre los factores de riesgo cardiovasculares (Gonzlez-Gross y col., 2000; Ghiselli y col., 2000). El impacto general sobre la salud de un consumo de alcohol moderado no ha sido determinado an y mucho menos el de la cerveza. Los datos hallados en diferentes estudios (Keys,1980; Wilt y col., 1997; Groenbaek y col., 1999) y revisiones bibliogrficas (Gonzlez-Gross y col., 2000; Cook, 1998) sugieren un efecto beneficioso del consumo moderado de alcohol sobre la morbilidad cardiovascular, probablemente debido al efecto protector del alcohol sobre el desarrollo de la ateriosclerosis. El beneficio neto del consumo moderado de alcohol, teniendo en cuenta todos los marcadores biolgicos conocidos de enfermedad coronaria, se sita en una reduccin del riesgo del 24,7% en el metanlisis realizado por Rimm y col. (1996). La induccin de mediadores inflamatorios y quimioquinas, particularmente la MCP-1 (Protena Quimiotctica de Monocitos-1), como resultado de la activacin de clulas endoteliales y monocitos, han sido identificados como un elemento clave en la iniciacin y progresin de la formacin de la placa ateromatosa (Gu y col., 1998). Por tanto, la disminucin del MCP-1 y citoquinas inflamatorias (IL-1) y la produccin de IFN-, trae como consecuencia un efecto beneficioso en el componente inflamatorio de la formacin de la placa ateromatosa (Szabo y col., 1996, 1999). Segn nuestro conocimiento, el efecto del consumo moderado de cerveza sobre el sistema inmune no ha sido estudiado hasta la fecha. Se plantea la hiptesis de que su contenido en antioxidantes pueda proteger a las clulas inmunocompetentes frente a diversas agresiones (Percival y Sims., 2000), al igual que su-
cede con su contenido nada despreciable en vitaminas del grupo B (GonzlezGross y col, 2000). En una revisin reciente realizada por nuestro grupo (Daz y col., 2002), se concluye que extrapolando los datos obtenidos en otros estudios, en especial en consumo crnico de alcohol, el consumo de cantidades moderadas parece tener un impacto beneficioso sobre el sistema inmune. As, se ha observado que dicho consumo moderado presenta un comportamiento en forma de curva gaussiana frente a ambos extremos: abstinencia y consumo elevado, de manera similar a la curva en forma de U que traza el consumo moderado de alcohol frente a la mortalidad por enfermedad cardiovascular. Por todo ello, se considera que el consumo moderado de cerveza podra tener unas consecuencias beneficiosas, tanto para la inmunidad humoral como para la inmunidad celular. En este contexto, se ha realizado el trabajo de investigacin que se presenta a continuacin, con el fin de esclarecer este aspecto tan importante, y determinar si un consumo moderado de cerveza puede mejorar el estado de salud de los adultos sanos y, en particular, potenciar su respuesta inmune. Con el fin de determinar el efecto de un consumo moderado de cerveza sobre los rganos linfoides primarios y secundarios se ha realizado un estudio adicional en animales de experimentacin descartando por un lado, posibles efectos perjudiciales del consumo moderado de alcohol y evaluando si la cerveza debido a su aporte de nutrientes, ejerce a cantidades moderadas un efecto beneficioso sobre los parmetros inmunolgicos.
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HIPTESIS DE TRABAJO
3.1. ESTUDIOS
EN
HUMANOS
HIPTESIS GENERAL El consumo moderado de cerveza puede ejercer un efecto beneficioso sobre la salud en adultos sanos; efecto que se puede determinar por la evaluacin del estado nutricional e inmunolgico.
3.2. ESTUDIOS
EN
ANIMALES
DE
EXPERIMENTACIN
HIPTESIS GENERAL El estudio de rganos linfoides primarios y secundarios en animales de experimentacin permite descartar un efecto perjudicial de un consumo moderado de alcohol y establecer una mejora de la inmunocompetencia mediante el consumo de cantidades moderadas de cerveza.
o OBJETIVOS
4.1. ESTUDIOS
OBJETIVO GENERAL
EN
HUMANOS
Estudiar la relacin entre un consumo moderado de cerveza y el estado nutricional e inmunolgico y establecer aquellos parmetros que pueden ser considerados biomarcadores de los efectos del consumo moderado de cerveza.
4.2. ESTUDIOS
OBJETIVO GENERAL
EN
ANIMALES
DE
EXPERIMENTACIN
Estudiar la relacin entre un consumo moderado de cerveza y la influencia sobre la inmunocompetencia (rganos linfoides primarios y secundarios y sangre perifrica), as como establecer aquellos parmetros que pueden ser considerados biomarcadores de los efectos del consumo moderado de cerveza.
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c METODOLOGA
5.1. METODOLOGA
5.1.1. SUJETOS
DEL
ESTUDIO
EN
HUMANOS
El estudio se llev a cabo en 57 sujetos sanos de ambos sexos con edades comprendidas entre los 25 y 50 aos, que se presentaron voluntariamente al estudio. Despus de una reunin informativa, todos los sujetos firmaron el informe con su consentimiento informado. Las caractersticas de la muestra se detallan en el Cuadro 1. Cuadro 1. Caractersticas de la muestra.
Mujeres (n= 27) Edad (aos) Peso (kg) Talla (cm) IMC (kg/m2) 37,669,19 60,894,26 159,550,04 24,022,75 Varones (n=30) 35,006,11 73,008,32 172,870,75 24,452,63
Ninguno de los voluntarios tena antecedentes familiares ni personales de abuso de alcohol ni patologas que desaconsejaran un consumo moderado de bebidas alcohlicas. 5.1.2. DISEO EXPERIMENTAL Se eligi un diseo de intervencin longitudinal en el que cada sujeto fue su propio control. El perodo experimental fue de dos meses, durante los cuales todos los sujetos siguieron con sus hbitos de vida y de alimentacin. La nica modificacin introducida fue referente al consumo de bebidas alcohlicas. Durante el primer mes, todos los sujetos tuvieron que abstenerse de cualquier consumo de alcohol. Durante el segundo mes, tuvieron que consumir la cantidad correspondiente a lo que hemos definido como consumo moderado de cerveza, es decir, 330 ml de cerveza de 4,5% vol. (12 g de alcohol para mujeres) y 660 ml de cerveza de 4,5% vol. (24 g de alcohol para varones). En los puntos (a) (antes de comenzar el estudio), (b) (al mes de abstinencia de alcohol) y (c) (al mes de consumo moderado de cerveza) se realizaron diversas pruebas analticas, tal y como se muestra en el Cuadro 2.
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Cuadro 2. Diseo experimental del estudio.

Perodo 1: Estilo de vida normal Alimentacin habitual Abstinencia completa de alcohol a b Perodo 2: Estilo de vida normal Alimentacin habitual Consumo moderado de cerveza c
30 das
30 das
Antropometra Hematologa Bioqumica Inmunologa

RCA: Registro de Consumo de Alimentos
RCA 7 das Antropometra Hematologa Bioqumica Inmunologa
RCA 7 das Antropometra Hematologa Bioqumica Inmunologa
5.1.3. PARMETROS ESTUDIADOS Cuadro 3. Parmetros dietticos

Energa y nutrientes Energa Protenas Carbohidratos Lpidos Fibra Vitaminas Minerales Alcohol Grupos de alimentos Cereales Lcteos Huevos Azcares Aceites Verduras y hortalizas Legumbres Frutas Carnes Pescados Bebidas alcohlicas Bebidas no alcohlicas Salsas y condimentos Precocinados Aperitivos
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Cuadro 4. Parmetros antropomtricos e ndices calculados

Parmetros Antropomtricos Edad Talla Peso Pliegues cutneos Bicipital Tricipital Subescapular Suprailaco Permetro del brazo (bceps normal) Permetro cintura Permetro cadera ndice de masa corporal (ndice de Quetelet) (IMC) ndice cintura-cadera
Cuadro 5. Parmetros biolgicos

Parmetros hematolgicos Serie roja: Hemates Hemoglobina Hematocrito Volumen corpuscular medio Hemoglobina corpuscular media Concentracin de hemoglobina corpuscular media ndice de dispersin de hemates Serie blanca: Leucocitos: Neutrfilos Linfocitos Monocitos Eosinfilos Basfilos Plaquetas: Recuento de plaquetas Volumen plaquetar medio Distribucin de plaquetas Plaquetocrito Parmetros bioqumicos Glucosa basal Colesterol total Colesterol-HDL Colesterol-LDL Triglicridos Transaminasas cido rico Urea Protenas totales Albmina Prealbmina Ferritina Parmetros inmunolgicos Capacidad fagoctica y oxidativa de neutrfilos Factores de complemento C3 y C4 Determinacin de subpoblaciones linfocitarias Test cutneo de hipersensibilidad retardada Determinacin de citoquinas Inmunoglobulinas IgG, IgA, IgM
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5.1.4. DESCRIPCIN
DE LA
METODOLOGA
5.1.4.1. PARMETROS
DIETTICOS
La evaluacin diettica en los sujetos fue realizada a travs de la tcnica de "registro de consumo de alimentos" durante 7 das consecutivos en el perodo de abstinencia (b) y durante la ltima semana de un consumo moderado de cerveza (c). Una vez conocido el consumo de alimentos y bebidas se transform en energa y nutrientes utilizando el programa informtico perteneciente al grupo de programas para estudios de alimentacin "GEA" (Carbajal y Molinero, 2002). De este modo, se calcularon las ingestas de:
I I I I I I I
Energa Protenas Carbohidratos Lpidos totales Fibra Minerales: calcio, hierro, yodo, magnesio, zinc, sodio, potasio, fsforo, selenio Vitaminas: vitamina B1, vitamina B2, equivalentes de niacina, vitamina B6, folato, vitamina B12, vitamina C, vitamina A (equivalentes de retinol), retinol, carotenos, vitamina D, vitamina E Colesterol y cidos grasos: colesterol, cidos grasos saturados, cidos grasos monoinsaturados, cidos grasos polinsaturados, cidos grasos cis, cidos grasos trans y cidos grasos no identificados Alcohol
ANTROPOMTRICOS
5.1.4.2. PARMETROS 5.1.4.2.1. TALLA
Se midi mediante tallmetro incorporado a la bscula modelo Seca 714 (rango 60 200 cm). El individuo se coloca de pie, descalzo, con la cabeza de forma que el plano de Frankfurt, que une el borde inferior de la rbita de los ojos y el superior del meato auditivo externo sea horizontal, con los pies juntos, rodillas estiradas, talones, nalgas y espalda en contacto con la pieza vertical del aparato medidor.
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Los brazos permanecen colgantes a lo largo de los costados con las palmas dirigidas hacia los muslos. La pieza horizontal y mvil del aparato se baja hasta contactar con la cabeza del individuo, presionando ligeramente el pelo. En el marcador se lee la unidad completa ms cercana. 5.1.4.2.2. PESO Se midi mediante bscula modelo Seca 714 con precisin de 100 g (rango 0,1130 kg). La medicin se realiza con el individuo en ropa interior, colocado encima de la bscula, sin apoyarse en ningn sitio. Se anota la unidad completa ms prxima. 5.1.4.2.3. MEDIDA
DE PLIEGUES CUTNEOS
Todos los pliegues se midieron en el lado no dominante del cuerpo utilizando un lipocalibre HOLTAIN (presin constante, 10 g/mm2 y precisin, 0,2 mm). Las medidas fueron realizadas por triplicado, calculndose la media de los tres valores obtenidos. De esta forma, se consigue una mayor fiabilidad de los resultados. Para la medida del espesor del tejido adiposo subyacente a la piel, se separ un pliegue de tejido superficial sujetndolo firmemente con los dedos pulgar e ndice de la mano izquierda, teniendo especial cuidado en no arrastrar con el pliegue alguna fibra de tejido muscular y situando sobre l y alejado unos 2 cm de los dedos el lipocalibre. Las mediciones se leyeron a los 2 segundos permitiendo que la lectura del lipocalibre se estabilizara. Los pliegues medidos fueron:
I
Pliegue bicipital (mm) Se separ un pellizco superficial en el brazo izquierdo, sobre la cara anterior del bceps braquial, en posicin vertical y en el punto medio entre el acromion y olcranon (la misma zona donde se midi el permetro del brazo). Pliegue tricipital (mm) Se realiz la medida en el mismo lugar que el bicipital pero sobre la regin posterior del brazo izquierdo, encima del trceps, tambin en posicin vertical.
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Pliegue subescapular (mm) Se midi en la espalda, con los brazos paralelos al cuerpo, sobre el vrtice inferior de la escpula izquierda, de forma que el pliegue siguiese la lnea que marca el borde de la misma. La direccin del pliegue es oblicuo, formando 45 con la lnea horizontal y siguiendo la lnea de pliegues de la piel (Tanner y Whitehouse, 1962).
I I
Pliegue suprailaco (mm) Se midi sobre la cresta ilaca izquierda y por debajo de las costillas flotantes sobre la lnea que baja desde el centro de la axila.
DEL BRAZO
5.1.4.2.4. PERMETRO
La medicin del permetro del brazo se realiz segn las normas establecidas por Lohman y col. (1988), con el antebrazo pegado al cuerpo, relajado y contrado en posicin horizontal, en el punto medio entre el acromion y el olcranon del brazo no dominante. Se utiliz una cinta mtrica de acero HOLTAIN (rango 0-150 cm). 5.1.4.2.5. PERMETRO
DE LA CINTURA
El individuo de pie, con el abdomen relajado, los miembros superiores colgando junto a los costados y con los pies juntos. Se midi la lnea horizontal que se encuentra equidistante de la ltima costilla y la cresta ilaca, mediante cinta mtrica de acero HOLTAIN. 5.1.4.2.6. PERMETRO
DE LA CADERA
En la misma posicin adoptada para la medida del permetro de la cintura, se considera permetro de la cadera al mximo que se consigue pasando una cinta mtrica de forma horizontal a nivel de la cadera. 5.1.4.2.7. NDICE
DE MASA CORPORAL
O ndice de Quetelet, viene expresado por la relacin (WHO, 1986): Peso (kg)/Talla2 (m2).
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5.1.4.2.8. NDICE
CINTURA/CADERA
Se expresa por la relacin de permetro cintura/permetro cadera. 5.1.4.3. PARMETROS 5.1.4.3.1. SERIE
HEMATOLGICOS
ERITROCITARIA
El recuento de hemates y las determinaciones de hemoglobina, hematocrito e ndices hemticos: volumen corpuscular medio (VCM), hemoglobina corpuscular media (HCM), concentracin de hemoglobina corpuscular media (CHCM), y el ndice de dispersin de hemates (RDW), se realizaron en un contador automtico H1 (Technicon-Bayer). 5.1.4.3.2. SERIE
LEUCOCITARIA
Recuento de leucocitos totales y su perfil mediante la determinacin de la frmula leucocitaria. El recuento de leucocitos totales, linfocitos, monocitos, neutrfilos, eosinfilos y basfilos, as como la frmula leucocitaria se realizaron, simultneamente con los parmetros de la serie roja, en un contador H1 (Technicon-Bayer). 5.1.4.3.3. SERIE
TROMBOCTICA
El recuento de plaquetas, as como los parmetros relacionados: volumen plaquetar medio (VPM), ndice de distribucin de plaquetas (PDW), y plaquetocrito (PTC), se realizaron en un contador automtico H1 (Technicon-Bayer). 5.1.4.4. PARMETROS
BIOQUMICOS
Los niveles de glucosa, colesterol, colesterol-HDL, colesterol-LDL, triglicridos, transaminasas, cido rico, urea, protenas totales, albmina, prealbmina y ferritina se realizaron en un autoanalizador Merck modelo AU 510 (Merck Diagnostic).
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5.1.4.5. PARMETROS 5.1.4.5.1. CAPACIDAD
INMUNOLGICOS
FAGOCTICA Y OXIDATIVA
La fagocitosis consta de varios pasos: quimiotaxis de la clula fagoctica, opsonizacin, absorcin de la bacteria, formacin del fagosoma, fagocitosis o englobamiento y, finalmente, destruccin y muerte del agente extrao. Al englobar la clula fagoctica a la bacteria, se desarrolla en el interior del fagosoma un mecanismo bactericida que causa acidificacin y oxidacin enzimtica. Mediante incubacin con un fluorocromo, el anticuerpo (Ac) aumenta la actividad enzimtica dando como resultado un incremento de la intensidad de la fluorescencia, que se puede medir por citometra de flujo. La determinacin de la capacidad de englobamiento de leucocitos se llev a cabo mediante un test comercial (Phagotest, Orpegen Pharma). Este test permite determinar cuantitativamente el nmero de clulas capaces de ingerir bacterias y la actividad especfica por clula (nmero de bacterias internalizadas). Se parte de dos tubos a los que se aaden 100 l de sangre con heparina. Un tubo se incuba durante 10 minutos con 20 l de bacterias (Escherichia coli) opsonizadas a 37C, mientras que el otro tubo, que es el control negativo, permanece en hielo. El proceso de fagocitosis se detiene al poner las muestras en hielo y aadiendo 100 l de la solucin correspondiente. Esta solucin permite discriminar entre las bacterias slo adheridas a la superficie de las que han sido captadas e ingeridas, ya que destruye la fluorescencia de las bacterias no ingeridas. Se lavan dos veces con 2 ml de solucin de lavado y se centrifugan a 2500 rpm, a 4C durante 5 minutos. Se aaden a los dos tubos 2 ml de solucin con capacidad fijadora y lisadora y se dejan incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos, con el fin de que los eritrocitos queden lisados y los leucocitos fijados. Posteriormente se centrifuga y se lava con la solucin de lavado. Finalmente se aaden 100 l de ioduro de propidio, que permite discriminar las clulas eucariotas de los agregados y/o bacterias. Se mantienen a 0C durante unos 15 minutos y se procede al anlisis de las muestras en el citmetro de flujo. Tras la fagocitosis se produce en el neutrfilo un aumento del consumo de oxgeno conocido como estallido respiratorio. Tras la degranulacin, una familia de oxidasas dependientes de NADPH son proyectadas al interior de las vacuolas fagocticas. Estas oxidasas actan convirtiendo el oxgeno molecular
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en oxgeno altamente reactivo, que se dismuta espontneamente para formar perxido de hidrgeno y otros potentes agentes oxidantes. Esta va proporciona alguno de los efectos antimicrobianos ms importantes del neutrfilo. El test conocido por Burstest (Orpegen Pharma) permite determinar tanto cuantitativamente como cualitativamente este proceso y consta de los siguientes pasos: Como partculas estimulantes se utilizan bacterias opsonizadas de Escherichia coli sin marcar, y el pptido quimiotctico N-formil-MetLeuPhe (FMLP), como estimulantes de baja actividad. Como substrato fluorognico se utiliza dihidrorodamina (DHR)123. Se activan las clulas inicialmente, partiendo de tres tubos con 100 l de sangre heparinizada (a 0C durante 15 minutos). Se aaden 20 l de bacteria Escherichia coli a un tubo, 20 l del pptido quimiotctico (FMLP) a otro y el tercer tubo se utiliza como control. Mientras que el tubo control permanece en hielo, los otros dos se agitan y se incuban durante 10 minutos a una temperatura de 37C. Tras la estimulacin, los neutrfilos producen metabolitos derivados de la oxidacin (anin superxido, perxido de hidrgeno y cido hipocloroso), que eliminan las bacterias que se encuentran en el fagosoma. La formacin de productos oxidantes durante la respiracin oxidativa puede ser monitorizada mediante la adicin y consecuente oxidacin de 20 l de substrato DHR 123 (no fluorescente) que se oxida y pasa a rodamina 123 (fluorescente). Se incuban durante 10 minutos a 37C para permitir la reaccin que acabamos de describir, y pasado este tiempo se aaden 2 ml de solucin con capacidad fijadora y lisante y se deja incubar a temperatura ambiente 20 minutos, con el fin de que los eritrocitos queden lisados y los leucocitos fijados. Posteriormente se centrifuga y se lava con solucin de lavado. Finalmente se aaden 100 l de la solucin que permite discriminar las clulas eucariotas de los posibles agregados y/o bacterias. Se mantienen a 0C durante unos 15 minutos y se procede al anlisis del porcentaje de clulas que han producido radicales de oxgeno, as como la intensidad media de fluorescencia en el citmetro de flujo. 5.1.4.5.2. FACTORES
DEL SISTEMA DEL COMPLEMENTO:
C3 Y C4
Las concentraciones sricas de los factores del complemento C3 y C4 se determinaron por nefelometra (Behring 100).
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5.1.4.5.3. RECUENTO
Y PORCENTAJE DE SUBPOBLACIONES LINFOCITARIAS
Las subpoblaciones linfocitarias [clulas T totales (CD2), clulas T maduras (CD3), clulas T helper o cooperadoras (CD4), clulas T citotxicas o supresoras (CD8) y clulas B (CD19)], se determinaron mediante la incubacin de sangre venosa, anticoagulada con EDTA-K3, con el anticuerpo monoclonal correspondiente a cada subpoblacin (CD4/CD8 (Leu-3a/2a), conjugado con un fluorocromo (isocianato de fluorescena (FITC) el CD4 y ficoeritrina (PE) el CD8, CD3/CD19 (Leu-4/12 conjugado con FITC y PE respectivamente, CD2 (Leu-5b) conjugado con PE, BectonDickinson, Missiauga, ON), en un Q-PREP EPICS (Coulter Diagnostics). Este sistema consta de un reactivo lisante de eritrocitos (InmunoPrep A), un estabilizador de leucocitos (Inmunoprep B), y un fijador de membrana celular (Inmunoprep C). Posteriormente, las muestras marcadas se analizaron por citometra de flujo, ya que ste es un mtodo analtico que permite la medida de emisin de fluorescencia y dispersin de luz, producidas por la iluminacin apropiada de las clulas o partculas microscpicas de una en una y arrastradas por un flujo portador, a medida que desfilan frente a un sistema de deteccin (Cuadro 6). Cuadro 6. Esquema de la citometra de flujo
PMT
5
PMT
4
Flujo celular
Filtros Dicrmicos
PMT
2 1
PMT
3
Filtros
PMT
1
FSC
detector
LASER
Original from Purdue University Cytometry Laboratories modified by R.F. Murphy & A. lvarez
20
Los citmetros de flujo utilizados fueron: Fascan (Becton-Dickinson) y Epics XL (Coulter) y consta de:
I
Sistema hidrulico: Rodea la suspensin celular en flujo con una vaina externa, formada por un fluido libre de partculas, que mueve la muestra a velocidad constante y controlada a travs de la zona de deteccin ("cmara de flujo"), donde las clulas o partculas son expuestas, una a una, al haz iluminador. Sistema de iluminacin: Produce un haz de luz que ilumina la muestra. La mayor parte de los citmetros (como es nuestro caso) utilizan luz lser, por ser coherente, monocromtica, polarizada, estrecha, estable y de intensidad conocida, aunque hay sistemas que disponen de lmparas de mercurio. Sistema ptico: Enfoca la iluminacin de las partculas de muestra, detecta la luz dispersada por ellas y selecciona la fluorescencia emitida a medida que las partculas atraviesan el haz luminoso. Sistema electrnico: Proporciona una iluminacin de intensidad constante, detecta y amplifica la respuesta de las partculas en forma de pulso analgico, transforma las seales en forma digital y controla el proceso de separacin celular electromagntica (Cell Sorting). Sistema de adquisicin y anlisis de datos: En la mayor parte de los citmetros modernos es compatible con ordenadores personales y sistemas operativos comunes (plataformas Ms-DOS, Windows y MacIntosh). Permite la adquisicin multiparamtrica de datos y el anlisis en tiempo real y en modo de lista (matrices de datos no correlacionados), as como el anlisis restringido a subpoblaciones seleccionadas ("acotamiento"). Los datos se presentan en forma de histogramas monoparamtricos o representaciones biparamtricas de la distribucin, junto con informacin estadstica de las distribuciones. Existen diferentes programas comerciales de apoyo, utilizables en ordenadores independientes (lvarez y col., 2000).
Tras este anlisis, se calcul el cociente CD4/CD8, como indicador del estado nutricional (Marcos y col., 1997). 5.1.4.5.4. FUNCIN
INMUNE CELULAR
"IN
VIVO":
Se utiliz un sistema de multipuntura de ocho cabezas. Siete de ellas contienen 0,03 ml de antgeno estril y la octava, utilizada como control negativo contie-
21
nen 0,03 ml de glicerina. Los antgenos empleados fueron Ttanos, Difteria, Estreptococo grupo C, Tuberculina, Candida albicans, Trychophyton mentagrophytes y Proteus mirabilis (Multitest CMI, delayed hipersensitivity skin test kit. Merieux Institute, Miami, Florida). El test se aplic intradrmicamente en el antebrazo y pasadas 48 horas se procedi a la lectura de los dimetros de induracin producidos por cada antgeno. Cuando el dimetro era inferior a 2 mm, la reaccin a ese antgeno se consider negativa. Se sumaron los milmetros de la induracin de las respuestas positivas, es decir, cuando el dimetro era igual o superior a 2 mm, y el valor total se defini como score. Se consideraron los criterios de valoracin de respuestas definidos por Jaurrieta y col. (1981) para mujeres y hombres de la poblacin espaola: Cuadro 7. Valoracin del test de hipersensibilidad retardada cutnea
Mujeres Score=0: respuesta anrgica Score= 0-5 mm: hipoergia Score 5-10 mm: respuesta baja Score >10 mm: respuesta normal. Anergia relativa: respuesta a un solo antgeno Hombres Score=0: respuesta anrgica Score= 0-10 mm: hipoergia Score= 10-20 mm: respuesta baja Score >20 mm: respuesta normal. Anergia relativa: respuesta a un solo antgeno
5.1.4.5.5. FUNCIN INMUNE (CYTOMETRIC BEAS ARRAY).
CELULAR
"IN
VITRO": SECRECIN DE CITOQUINAS MEDIDAS POR
CBA
La secrecin de citoquinas se determin en sobrenadantes procedentes de cultivos celulares tras 48 horas de incubacin con un mitgeno. Se parte de sangre heparinizada que se diluye con solucin salina (1/1) y se procede a la separacin de linfocitos en gradiente de densidad (1,077 0,001g/ml) de Ficoll (Ficoll-Hypaque, Lymphoprep, Nyegaard, Oslo, Norway). El proceso de separacin se basa en la diferencia de densidad que existe entre los distintos tipos celulares. Las clulas mononucleares y las plaquetas se depositan en la parte superior del gradiente, porque tienen menor densidad que ste. Los glbulos rojos y los granulocitos tienen mayor densidad y se depositan en el fondo del tubo. Con una pipeta Pasteur se retira la banda de linfocitos. Se reali-
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zan dos lavados en medio RPMI-1640 (BioWhittaker, Verviers, Belgium) y se ajusta a una concentracin de 106 clulas por cada 1 ml de medio de cultivo. Dichas clulas se resuspenden en el medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero bovino (BioWhittaker) despus de descomplementarlo y con una concentracin al 1% de penicilina/estreptomicina (5000UI/ml:5000mg/ml, BioWhittaker). Tras esto, se procede a la estimulacin con phytohemaglutinina (PHA; Gibco BRL, Paisley, UK), mitgeno que activa a todas las clulas por igual, es decir, no tiene especificidad por un subtipo celular, a una concentracin final 7 mg/106 clulas e incubacin 37C en una atmsfera humidificada al 5% de CO2 durante 48 horas, perodo tras el cual se extraen los sobrenadantes y se almacenan a 20C para su posterior procesamiento. La determinacin de IL-2, IFN-, IL-4, IL-10, TNF-, IL-6 se llev a cabo por duplicado por medio de la tcnica de CBA, usando los kits de Becton-Dickinson (Human Th1 y Th2 cytokine CBA). La secrecin de citoquinas medidas por citometra de flujo combina el fundamento de las tcnicas de inmunoensayo con la citometra de flujo. Seis grupos de microesferas de poliestireno de igual tamao (7,5 mm de dimetro) son teidas con distintas intensidades de fluorescencia. Cada partcula ha sido unida mediante enlace covalente con un anticuerpo (Ac) (Pharmingen, San Diego, CA) frente a una de 6 citoquinas (IL-2, IFN-, IL-4, IL-10, TNF-, IL-6), representando una poblacin concreta con una intensidad FL-3 de fluorescencia determinada. Este complejo Ac-partcula es capaz de unirse a la citoquina correspondiente y ser detectada de forma simultnea en la mezcla. La citoquina presente en la muestra, que se une al complejo, puede ser detectada por inmunoensayo directo usando 6 anticuerpos diferentes unidos a ficoeritrina (detector) (PE), (FL2). Tanto los estndares con concentraciones de 0-5000 pg/ml como los reactivos (Ac-partcula, detector-PE) son mezclas de las 6 citoquinas. La mezcla de 50 l de Ac-microesfera, 50 l de detector-PE, y 50 l de muestra o de estndares, se incuba durante 4 horas a temperatura ambiente y en ausencia de luz. Despus, se lava para eliminar el reactivo que no se ha unido y se procede a la lectura en el citmetro. Se obtienen 6 curvas standard. 5.1.4.5.6. TASA
SRICA DE INMUNOGLOBULINAS: IGG, IGA E IGM
Las concentraciones sricas de inmunoglobulinas IgG, IgA e IgM se determinaron por nefelometra (Behring-100).
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La tcnica de inmunonefelometra permite una rpida medida cuantitativa de precipitacin, en algunos casos facilitada con ltex, para la determinacin de protenas. Las protenas presentes en la muestra reaccionan con antisueros altamente especficos para formar complejos antgeno-anticuerpo insolubles. La medida de la dispersin que sufre un rayo luminoso al atravesar esta suspensin es proporcional a la concentracin de antgeno o protena que nos interesa, en situacin de anticuerpo en exceso. La aglutinacin facilitada por ltex se usa en reacciones de antgeno-anticuerpo que no permiten la formacin de inmunocomplejos suficientemente grandes para ser medidos. En dicho caso el anticuerpo se encuentra absorbido a la superficie de partculas de ltex, que en contacto con el antgeno proporcionan una aglutinacin medible. 5.1.5. TRATAMIENTO ESTADSTICO DE LOS DATOS OBTENIDOS EN HUMANOS El tratamiento estadstico de los datos de parmetros analizados en sujetos sanos, se llev a cabo en el Centro Tcnico de Informtica (CTI) del Consejo Superior de Investigaciones Cientficas (CSIC), mediante el programa estadstico SPSS 11.O en Windows XP.
I
Anlisis descriptivo univariante Se realiz un clculo de los estadsticos bsicos (medias y varianzas) y se realizaron pruebas de ajuste de las distribuciones de las distintas variables de la muestra, observndose que todas seguan una distribucin normal, salvo las citoquinas. Se determinaron los valores missingdata y outliers que pudieran ser sesgos en la muestra. Modelos lineales generales Se realiz el anlisis de varianza (ANOVA) de medidas repetidas Basal (a), Abstinencia (b) y Cerveza (c) y factor fijo el Sexo para cada parmetro. En los casos en que la distribucin normal no pudo ser asegurada, se aplicaron pruebas estadsticas no paramtricas para cada sexo. Test de Wilcoxon comparando pares: [(a)-(b),] [(a)-(c)] y [(b)-(c)]. Modelos multivariantes Se realiz una seleccin de las variables de mayor inters en el estudio; a partir de aqu se realizaron los siguientes anlisis:
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Se realiz una estimacin de missing-data para las variables sealadas basada
en la media del grupo y la dependencia lineal. Se realiz anlisis factorial en componentes principales, estudindose la matriz de correlacin entre los parmetros Basal (a), Abstinencia (b) y Cerveza (c). La representacin grfica se realiz por Grficos de Box-Wiskers sobre los grupos: Basal (a), Abstinencia (b) y Cerveza (c).
5.2. METODOLOGA DEL ESTUDIO EN ANIMALES DE EXPERIMENTACIN

5.2.1. ANIMALES
DE EXPERIMENTACIN
Para esta experiencia se utilizaron 40 ratas machos de raza Wistar en crecimiento, con una edad de 8 semanas, de peso inicial promedio de 240 g, conseguidos a partir del criadero del Instituto de Nutricin y Bromatologa del Consejo Superior de Investigaciones Cientficas (CSIC-UCM). 5.2.2. DISEO EXPERIMENTAL Tras un perodo de adaptacin de cinco das al nuevo habitculo y a las condiciones de la experimentacin controladas:
I
Jaulas individuales de metabolismo Temperatura 22C 1 en el habitculo Foto-perodo da/noche de 12 horas (8-20 horas) Humedad relativa entre 50 y 70%
Los 40 animales fueron divididos en cuatro grupos de 10 individuos. La dieta de referencia elegida fue la AIN93-G, especfica para ratas en crecimiento segn las recomendaciones de American Institute of Nutrition (1993) y cuya composicin se detalla en el Cuadro 8.
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Cuadro 8. Composicin de la dieta (AIN93G)

Ingredientes Almidn de maz Casena (85% Protena) Dextrinas Sacarosa Aceite de soja Fibra Minerales Vitaminas L-cistena Colina Terbutilhidroquinona g/kg Dieta 397,486 200,000 132,000 100,000 70,000 50,000 35,000 10,000 3,000 2,500 0,014
Los grupos se establecieron teniendo como base el tipo de bebida en cada uno de ellos.
I I I I
Grupo 1: 10 ratas cuya bebida fue agua Grupo 2: 10 ratas cuya bebida fue cerveza diluida con agua Grupo 3: 10 ratas cuya bebida fue cerveza sin alcohol diluida con agua Grupo 4: 10 ratas cuya bebida fue etanol diluido con agua
La concentracin moderada de alcohol para los animales de experimentacin se defini como 0,28 g alcohol para una rata de 240 g, equivalente a 20 g alcohol para un sujeto de 70 kg. La concentracin de etanol en cada uno de los grupos de estudio fue ajustada segn el peso inicial y el incremento de peso en cada individuo a lo largo del tiempo de estudio, con el fin de proveer, indistintamente del tipo de bebida, una concentracin que correspondiese a un consumo moderado de alcohol. Durante las cuatro semanas de duracin del estudio, la ingesta de dieta y de bebida se registr en forma diaria y el peso fue controlado tres veces por semana. Los cuatro grupos comieron y bebieron ad libitum. Los resultados de los grupos objeto de estudio fueron comparados entre s
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y frente al grupo control (1), formado por los 10 animales que como bebida consuman agua. 5.2.3. METODOLOGA Cuadro 9. Parmetros dietticos y ponderales estudiados en animales
Parmetros Dietticos Ingesta diaria de dieta AIN93G Ingesta de bebida Parmetros Ponderales Peso corporal (PC) Ganancia de peso (GP) Porcentaje de incremento de peso (% IP) Eficacia alimentaria (EA) Peso de timo (PT) Peso de bazo (PB) ndice timo-somtico (ITS) ndice espleno-somtico (IES)
Cuadro 10. Parmetros inmunolgicos estudiados en animales

Sangre Perifrica Recuento y porcentaje de subpoblaciones linfocitarias CD2 CD3 CD4 CD8 CD161 CD45RA Cocientes linfocitarios CD4/CD8 CD2/CD45RA Capacidad fagoctica de los neutrfilos Funcin inmune celular in vitro: secrecin de citoquinas: IL-2, TNF-. Bazo Porcentaje de subpoblaciones linfocitarias CD2 CD3 CD4 CD8 CD45RA Cocientes linfocitarios CD4/CD8 CD2/CD45RA Timo Porcentaje de subpoblaciones linfocitarias CD4+CD8+ CD4+CD8CD4-CD8+ Cociente linfocitario CD4/CD8 Placas de Peyer Porcentaje de subpoblaciones linfocitarias CD2 CD3 CD4 CD8 CD161 CD45RA Cocientes linfocitarios CD4/CD8 CD2/CD45RA
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5.2.4. DESARROLLO
DE LOS
ESTUDIOS
Tras someter las ratas a un consumo moderado de etanol durante 4 semanas, fueron decapitadas y se les extrajo 4 cc de sangre, 3,0 ml de sangre en heparina de litio 143 U.I y 1,0 ml en tubo seco. Mantenida a temperatura ambiente, por un tiempo mximo no superior a 30 minutos, la muestra heparinizada fue usada para el aislamiento de la banda de linfocitos y la muestra en tubo seco para obtencin del suero. Una vez obtenidas las muestras de sangre se procede a la fijacin del animal sobre la tabla de diseccin en posicin decbito supino, con ayuda de gomas enganchadas en las cuatro patas y se procede a la diseccin, se obtienen intactos el bazo, timo e intestino. Se pesan los rganos y se mantienen en solucin isotnica fra para su anlisis. Todas las muestras fueron procesadas transcurrido un tiempo de 30 a 45 min. despus del sacrificio del animal. 5.2.5. TCNICAS ANALTICAS El procedimiento quirrgico para la obtencin de los rganos linfoides especializados (timo, bazo y placas de Peyer), se inici limpiando cuidadosamente la zona ventral del animal, procediendo a abrir y separar la piel. A continuacin, mediante el empleo de tijeras curvas, se realiz la apertura, levantando la piel y practicando una pequea incisin en la lnea media ventral. Empleando las mismas tijeras se abri la piel desde el ano hasta la altura del labio inferior. Concluida la incisin se procedi a retirar la piel hacia los lados, separndola de la capa muscular. La diseccin del abdomen se inici realizando una incisin sobre la lnea alba del plano muscular a lo largo de todo el abdomen. Esta incisin se inicia desde el punto situado un centmetro por encima de los orificios genitales hasta el extremo caudal del esternn a la altura del cartlago xifoides. A continuacin se efectuaron incisiones transversales a derecha e izquierda al nivel de la caja torcica y de los miembros posteriores. Se separaron los labios de la incisin y se fijaron con pinzas hemostticas. La extraccin del bazo e intestino se realiz tras la apertura total del abdomen, se cort el msculo esterno-hioideo por la lnea media separando a ambos lados, con el fin de encontrar y extraer en su totalidad el timo. Una vez pesados en balanza analtica (METTLER AE 260 Delta Range) de precisin 0,1 mg el timo y bazo, y realizada la extraccin del intestino delgado y grue-
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so de la totalidad de las placas de Peyer, se procedi a la dilaceracin de los rganos, homogenizacin, centrifugacin y aplicacin de lavados con solucin tampn para la obtencin de linfocitos. Los eritrocitos contenidos en bazo fueron eliminados por adicin de una solucin lisante de cloruro amnico y posteriormente mediante lavados consecutivos con suero salino para eliminar los restos de membrana y hemoglobina de los mismos. 5.2.5.1. PARMETROS
DIETTICOS
La evaluacin diettica en las ratas se realiz a travs del registro del consumo diario de la dieta en gramos sobre sustancia fresca (ssf) y sobre sustancia seca (sss) y la medicin de los mililitros de bebida ingeridos por cada animal. 5.2.5.2. PARMETROS 5.2.5.2.1. PESO
PONDERALES
CORPORAL
El peso corporal de los animales se determin en una balanza electrnica marca METTLER PM 3000 de precisin 0,1 g. 5.2.5.2.2. GANANCIA
DE PESO
(GP)
La ganancia de peso se calcul hallando la diferencia entre el peso final (PF) y peso inicial (PI). 5.2.5.2.3. PORCENTAJE
DE INCREMENTO DE PESO
(%IP)
El porcentaje de incremento de peso (% IP), se calcul a partir de los valores de peso inicial (PI), peso final (PF), utilizando la ecuacin: %IP= [(PF-PI)/100]PI 5.2.5.2.4. EFICACIA
ALIMENTARIA
(EA)
La eficacia alimentaria (EA) se calcul a partir del incremento de peso (IP) por da (g) y por sustancia seca (ss) ingerida por da.
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El valor de sustancia seca se obtiene a travs del clculo de la humedad de la dieta, por prdida de peso en estufa a 105C hasta peso constante (A.O.A.C., 1980). EA = IP (g)/ss (g) 5.2.5.2.5. PESO
DEL TIMO
(PT)
El peso se determin usando una balanza analtica (METTLER AE 260 Delta Range) de precisin 0,1 mg, una vez retiradas las membranas que lo adheran. 5.2.5.2.6. PESO
DEL BAZO
(PB)
El peso se determin usando una balanza analtica (METTLER AE 260 Delta Range) de precisin 0,1 mg, una vez retiradas las membranas que lo adheran. 5.2.5.2.7. NDICE
TIMO-SOMTICO
(ITS)
El ndice timo-somtico (ITS) se calcul a partir de los valores de peso de timo (PT), peso corporal final (PF), utilizando la siguiente ecuacin: ITS= [PT /PF]x100 5.2.5.2.8. NDICE
ESPLENO-SOMTICO
(IES)
El ndice espleno-somtico (IES) se calcul a partir de los valores de peso de bazo (PB), peso corporal final (PF), utilizando la siguiente ecuacin: IES= [PB /PF]x100 5.2.5.3. PARMETROS 5.2.5.3.1. SANGRE
INMUNOLGICOS
PERIFRICA
5.2.5.3.1.1. Recuento y porcentaje de subpoblaciones linfocitarias Las subpoblaciones linfocitarias (clulas T totales (CD2), clulas T maduras (CD3), clulas T helper o cooperadoras (CD4), clulas T citotxicas o supresoras (CD8), clulas B (CD45RA) y clulas natural killer (CD161), se determinaron mediante la incubacin de sangre anticoagulada con heparina, con el anticuerpo monoclonal
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correspondiente a cada subpoblacin usando dos controles: Control 1: GOAT Antimouse IgG:RPE-RAT 0,5 mg Control 2: GOAT Antimouse IgG:FITC-RAT 0,5 mg y las subpoblaciones: Mouse Anti Rat CD2:FITC 0,1mg, Mouse Anti Rat CD3:FITC 0,1 mg, Mouse Anti Rat CD4:RPE 0,1 mg, Mouse Anti Rat CD8:RPE-C y 5 0,1 mg, Mouse Anti Rat CD161:FITC 0,1 mg (NK), Mouse Anti Rat CD45RA:RPE 0,1 mg (CD19). Se utilizaron tres soluciones para preparar la muestra antes de marcarla con los anticuerpos monoclonales: solucin lisante de eritrocitos, estabilizador de leucocitos y un fijador de membrana celular. Posteriormente, las muestras marcadas se analizaron por citometra de flujo, como se ha indicado previamente en el apartado del estudio en humanos (Cuadro 6). Tras estos anlisis se calcularon los cocientes CD4/CD8 y CD2/CD45RA 5.2.5.3.1.2. Capacidad fagoctica Esta funcin de los fagocitos se ha explicado previamente en el apartado 5.1.4.5.1 correspondiente al estudio en humanos. 5.2.5.3.1.3. Funcin inmune celular in vitro Se lleva a cabo el aislamiento de linfocitos y se determina la secrecin de citoquinas por ELISA (enzyme-linked inmunosorbent assay) (Bender MedSystems, Vienna, Austria) tras la estimulacin con un mitgeno. El aislamiento de linfocitos se realiza mediante centrifugacin en gradiente de densidad (1,0770,001 g/ml) de Ficoll (Lymphoprep). Es un mtodo rpido y muy simple de purificacin de clulas mononucleares de sangre perifrica entre las que estn los linfocitos. El proceso de separacin se basa en la diferencia de densidad que existe entre las clulas mononucleares y otros elementos de la muestra de sangre. Las clulas mononucleares y las plaquetas se depositan en la parte superior del gradiente, porque tienen menor densidad que ste. Los glbulos rojos y los granulocitos tienen mayor densidad y se depositan en el fondo del tubo. Mediante pipeta Pasteur se retira la banda de linfocitos. Se realizan dos lavados en el medio RPMI-1640 (BioWhittaker, Verviers, Belgium). Finalmente las clulas aisladas se resuspenden en el medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (BioWhittaker), despus de descomplementarlo, y con una concentracin al 1% de penicilina/estreptomicina (5000 UI/ml:5000 g/ml, BioWhittaker), ajustndolas a una concentracin de 106 cel/ml de medio de cul-
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tivo. Se procede a la estimulacin con el mitgeno phytohemaglutinina (PHA; Gibco BRL, Paisley, UK) a una concentracin final de 7x10-4 % (P/V). Las clulas en cultivo se incuban durante 48h a 37C en una atmsfera humidificada que contiene una proporcin de 5% de CO2. Tras el periodo de incubacin el sobrenadante de cultivo se resuspende y se recolecta para su centrifugacin, almacenndose a -20C hasta su posterior utilizacin. En el presente estudio, se han determinado las citoquinas IL-2 y TNF- por duplicado utilizando la tcnica de ELISA. El mtodo de ELISA es un ensayo de inmunoadsorcin acoplado a una actividad enzimtica para la deteccin cuantitativa de, en nuestro caso, citoquinas en sobrenadantes de cultivos celulares, suero humano, plasma u otros fluidos. Se basa en la unin especfica de la citoquina contenida en la muestra a anticuerpos monoclonales especficos inmovilizados sobre la superficie de placas de titulacin. Para ello, las muestras y estndares apropiados se incuban en dichas placas con el anticuerpo, de forma que el antgeno a determinar (citoquina presente en la muestra) o el estndar se une a los anticuerpos fijados al pocillo. Un segundo anticuerpo monoclonal anti-citoquina, conjugado con biotina, se aade tambin en esta incubacin, el cual se une a la citoquina capturada por el primer anticuerpo. Tras la incubacin, se elimina el segundo anticuerpo no unido mediante lavados repetidos en una solucin buffer y se incuba de nuevo en presencia de un conjugado Streptavidina-HRP (horseradish peroxidase conjugate), que se unir al conjugado de biotina. Con otra serie de lavados se elimina la Streptavidina-HRP no unida y se aade una solucin de Tetrametilbencidina (TMB), que sirve de sustrato a la HRP. Con la reaccin enzimtica se forma un compuesto coloreado en proporcin a la cantidad de citoquina presente en la muestra. La reaccin se detiene mediante la adicin de cido sulfrico (H2SO4) y se mide la absorbancia a 450 nm. Se prepara una curva estndar a partir de las siete concentraciones conocidas (estndares) de citoquina utilizada y se determina la concentracin de la muestra a partir de la absorbancia medida. 5.2.5.3.2. BAZO 5.2.5.3.2.1. Recuento y porcentaje de subpoblaciones linfocitarias Una vez pesado el rgano, se mantiene sobre una placa Petri con unos mililitros de suero salino. Una vez se ha eliminado cualquier membrana se procede a la maceracin del rgano sobre una malla fina de acero inoxidable estril de 3x3 cm
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poniendo el rgano sobre ella y presionando contra la misma con el mbolo de una jeringa para homogenizar sus tejidos, proceso que finaliza cuando se obtiene una solucin rojiza. Dicha solucin se filtra a travs de una malla de 20 m de poro para eliminar cualquier tipo de clulas que pudiesen haber interferido con el procedimiento, por ejemplo tejido adiposo o conjuntivo. El resto se recoge en un tubo tipo Falcon de fondo cnico. Se realiza un lavado aadiendo suero salino hasta un volumen final de 14 ml y se centrifuga durante 7 min. a 1000 rpm. Se obtiene por centrifugacin diferencial el sobrenadante que se elimina por decantacin y el precipitado se resuspende y ajusta a un volumen de 2 ml. A este volumen se agregan 5 ml de una solucin lisante de cloruro amnico (ClNH4) al 0,85 %, dejando que acte durante 10 min. a temperatura ambiente. Despus de una segunda centrifugacin (7 min. a 1000 rpm), se aade suero salino hasta un volumen final de 15 ml y se centrifuga una vez ms a 1000 rpm durante 7 minutos, se elimina el sobrenadante y tras resuspender el precipitado, se le aade suero salino hasta un volumen de 5 ml. Finalizado el procedimiento de purificacin de los linfocitos de bazo, se establece la cantidad de linfocitos/ml, realizando un recuento en cmara de Neubauer. Se realiza una ltima centrifugacin a las mismas revoluciones y tiempo que la anterior y se ajusta el volumen a 1x106 cel/ml. A continuacin se realiza el marcaje de las clulas con los anticuerpos monoclonales controles: IgG-FITC, IgG-RPE Cy5, y los fenotipos: CD4-RPE, CD8-RPE, CD3-FITC, CD45RA-RPE, CD2-FITC, CD161FITC, y se incuba durante 30 min. a temperatura ambiente protegido de la luz directa. Posteriormente, las muestras marcadas se analizan por citometra de flujo del mismo modo como se ha explicado en el apartado anterior. 5.2.5.3.3. TIMO 5.2.5.3.3.1. Recuento y porcentaje de subpoblaciones linfocitarias: Una vez pesado, el timo se lava con solucin salina 0,9 % y se procede a su maceracin del mismo modo como se ha indicado para el caso del bazo. 5.2.5.3.4. Placas de Peyer Una vez extrada la totalidad del intestino delgado y grueso, se procede a lavar el interior a presin con ayuda de una jeringa de 5 cc con suero salino para eliminar
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las heces. Con ayuda de pinzas, tijeras de diseccin y una fuente de luz se extraen la totalidad de las placas de Peyer del intestino, se cuenta el nmero total de placas extradas por rata y se colocan en placas Petri con 3 ml de solucin salina al 0,9 %. Finalizada la extraccin de las placas, se pasan a travs de papel de filtro con el fin de limpiar la mucosa intestinal y se lavan nuevamente en solucin salina con el fin de eliminar el mximo posible de restos de mucosa. Una vez limpias las placas de Peyer, se van macerando una a una suavemente con ayuda de pinzas y del mbolo de una jeringa sobre una malla fina de acero inoxidable estril de 3x3 cm puesta dentro de una caja Petri de poliestireno de 10 cm de dimetro, donde previamente se ha puesto de 3 a 4 cc de suero salino. Cuando las placas de Peyer estn dilaceradas en su totalidad, se coge de nuevo la malla con las pinzas y se lava con solucin salina. Se recoge la suspensin de clulas que ha quedado despus de dilaceradas con ayuda de la misma jeringa de 5 cc que se haba utilizado para macerarlas. Se filtra la suspensin pasndola a travs de una malla de 20 m de poro, se coloca en un tubo cnico tipo Falcon de 15 ml, se lleva a un volumen de 5 ml con suero salino y se centrifuga durante 5 min. a 1800 rpm a 4C. Se decanta y se resuspende suavemente el botn, se lava nuevamente con 5 ml de solucin salina y se centrifuga de nuevo durante 5 min. a 1800 rpm a 4C. Se decanta y se resuspende nuevamente, llevndolo a un volumen de 5 ml con solucin salina al 0,9%. A continuacin, se monta la cmara de Neubauer con 10 l de la suspensin, con el fin de obtener la cantidad de linfocitos de la muestra y se ajusta a una concentracin final de 1x106 cel/ml. Finalmente se marcan los linfocitos con los anticuerpos monoclonales correspondientes. Controles: IgG-FITC, IgG-RPE Cy5, y los fenotipos: CD4-RPE, CD8-RPE, CD3-FITC, CD45RA-RPE, CD2-FITC, CD161-FITC, incubndolos en una zona protegida de la luz directa durante 30 min. a temperatura ambiente. El volumen final que se ha de obtener para su lectura es de 800 l. Posteriormente, las muestras marcadas se analizan por citmetra de flujo. 5.2.6. TRATAMIENTO ESTADSTICO
DE LOS
DATOS OBTENIDOS
EN
ANIMALES
DE
EXPERIMENTACIN
El tratamiento estadstico de los datos de los animales de experimentacin se llev a cabo en el Centro Tcnico de Informtica (CTI) del Consejo Superior de Investigaciones Cientficas (CSIC), mediante el programa estadstico SPSS 11.O en Windows XP.
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Anlisis descriptivo univariante Se realiz un clculo de los estadsticos bsicos (medias y varianzas) y se realizaron pruebas de ajuste de las distribuciones de las distintas variables de la muestra, observndose que todas seguan una distribucin normal, salvo las citoquinas. Se determinaron los valores missingdata y outliers, que pudieran ser sesgos en la muestra. Modelos lineales generales Se realiz el anlisis de varianza (ANOVA) de una va (grupo) de los cuatro grupos de ratas a estudiar. Se determin el grado de significacin estadstica de la diferencia entre las medias mediante el Test de Pares a posteriori de Bonferroni para contrastar las diferencias entre los grupos. Se realiz el anlisis de varianza (ANOVA) de una va (grupo) usando como covariantes, los parmetros de dieta y bebida. En los casos en que la distribucin normal no pudo ser asegurada, se aplicaron pruebas estadsticas no paramtricas como el test de Mann-Whitney y de KruskalWallis para establecer el grado de significacin entre los cuatro grupos. Modelos Multivariantes Se realiz una seleccin de las variables de mayor inters en el estudio; a partir de aqu se realizaron los siguientes anlisis:
Se realiz una estimacin de missing-data para las variables sealadas basada
en la media del grupo y la dependencia lineal. Los anlisis de regresin se realizaron para la variable peso, ajustado por da, dieta y bebida, viendo la evolucin del mismo a travs de los das de experimentacin, comparacin de pendientes. Los grficos realizados de lneas para el estudio de la evolucin y Grficos de Box-Wiskers.
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s DATOS EXPERIMENTALES
A continuacin se muestran todas las tablas correspondientes a los resultados obtenidos en los parmetros evaluados tanto en humanos como en animales de experimentacin. En las Tablas 1-45 se presentan los datos obtenidos en el estudio realizado en humanos. En las Tablas 46-54 se presentan los datos obtenidos en el estudio realizado en animales de experimentacin. Los datos se expresan como media desviacin estndar.
6.1. ESTUDIO
EN
HUMANOS
Tabla 1. Valoracin de la ingesta diettica media diaria de energa, macronutrientes y fibra en mujeres durante el perodo de abstinencia alcohlica y con un consumo moderado de cerveza
Abstinencia (n=22) Energa (kcal) Protenas (g) Lpidos (g) Carbohidratos (g) Fibra (g) 1776,86410,39 79,3214,40 71,2419,29 212,9162,61 14,734,10 Cerveza (n=22) 1887,68476,58 78,6415,38 71,6823,19 226,0566,34 16,396,49
Valores expresados como media desviacin estndar. No existen diferencias significativas en el test de muestras pareadas.
Tabla 2. Valoracin de la ingesta diettica media diaria de minerales en mujeres durante el perodo de abstinencia alcohlica y con un consumo moderado de cerveza.
Abstinencia (n=22) Calcio (mg) Hierro (mg) Yodo (g) Magnesio (mg) Zinc (mg) Sodio (mg) Potasio (mg) Fsforo (mg) Selenio (g) 870,95190,25 11,192,14 327,10148,38 258,1448,15 8,551,99 2825,731240 2650,64480,35 1089,91202,23 42,5718,29 Cerveza (n=22) 820,82191,51 11,813,29 281,23135,02* 279,9570,68 9,002,37 2595,64696,25 2678,50607,30 1144,00225,02 46,0925,97
Valores expresados como media desviacin estndar. * Diferencias significativas (p<0,05) entre abstinencia alcohlica y consumo moderado de cerveza. Test t Student para muestras pareadas.
36
Tabla 3. Valoracin de la ingesta diettica media diaria de vitaminas en mujeres durante el perodo de abstinencia alcohlica y con un consumo moderado de cerveza.
Abstinencia (n=22) Vitamina B1 (mg) Vitamina B2 (mg) Eq. Niacina (mg) Vitamina B6 (mg) Folato (g) Vitamina B12(g) Vitamina C (mg) Vit. A: Eq. Retinol (g) Retinol (g) Carotenos (g) Vitamina D (g) Vitamina E (mg) 1.000,22 1,370,27 25,174,51 1,240,32 139,5339,88 3,871,46 76,5738,62 614,45224,75 286,95223,05 1984,141161,10 3,881,92 4,701,91 Cerveza (n=22) 1,100,30 1,410,25 25,514,88 1,270,34 153,3756,32 5,782,76 * 79,3538,01 788,27486,14 * 408,57463,09 2322,681640,00 3,804,30 4,752,94
Tabla 4. Valoracin de la ingesta diettica media diaria de colesterol y cidos grasos en mujeres durante el perodo de abstinencia alcohlica y con un consumo moderado de cerveza.
Abstinencia (n=22) Colesterol (mg) AGS (g) AGM (g) AGP (g) AG trans (g) AG no identificados (g) AG cis (g) 307,14107,06 24,246,81 27,528,00 10,323,23 1,460,52 1,330,41 30,338,88 Cerveza (n=22) 300,14160,64 24,087,98 27,619,80 10,154,88 1,550,67 1,280,36 29,6111,00
Tabla 5. Valoracin de la ingesta diettica media diaria de energa, macronutrientes y fibra en hombres durante el perodo de abstinencia alcohlica y con un consumo moderado de cerveza.
Abstinencia (n=24) Energa (kcal) Protenas (g) Lpidos (g) Carbohidratos (g) Fibra (g) 2250,58762,49 103,0833,35 87,9932,50 278,90112,75 20,2511,78 Cerveza (n=24) 2306,75496,21 100,8621,02 87,1721,99 263,2176,37 18,448,05
37
Tabla 6. Valoracin de la ingesta diettica media diaria de minerales en hombres durante el perodo de abstinencia y con un consumo moderado de cerveza.
Abstinencia (n=24) Calcio (mg) Hierro (mg) Yodo (g) Magnesio (mg) Zinc (mg) Sodio (mg) Potasio (mg) Fsforo (mg) Selenio (g) 979,04425,35 14,725,09 296,25151,61 306,58116,47 11,954,48 3514,251576,84 3066,33968,35 1353,00547,99 59,3530,00 Cerveza (n=24) 920,63284,85 13,973,54 303,75148,90 322,6762,96 11,924,08 3143,131244,60 3124,25724,60 1351,00271,01 53,6122,74
Tabla 7. Valoracin de la ingesta diettica media diaria de vitaminas en hombres durante el perodo de abstinencia alcohlica y con un consumo moderado de cerveza.
Abstinencia (n=24) Vitamina B1 (mg) Vitamina B2 (mg) Eq. Niacina (mg) Vitamina B6 (mg) Folato (g) Vitamina B12 (g) Vitamina C (mg) Vit. A: Eq. retinol (g) Retinol (g) Carotenos (g) Vitamina D (g) Vitamina E (mg) 1,300,50 1,640,62 30,018,13 1,530,63 153,2368,70 6,002,77 65,7728,42 901,96550,83 476,92478,79 1719,541420,55 3,703,54 4,872,12 Cerveza (n=24) 1,280,33 1,790,46 32,286,26 1,390,37 162,5646,73 7,323,63 61,7827,14 868,42547,07 498,42533,26 1805,331212,81 4,381,88 4,601,44
Tabla 8. Valoracin de la ingesta diettica media diaria de colesterol y cidos grasos en hombres durante el perodo de abstinencia alcohlica y con un consumo moderado de cerveza.
Abstinencia (n=24) Colesterol (mg) AGS (g) AGM (g) AGP (g) AG trans (g) AG no identificados (g) AG cis (g) 364,12130,14 29,3512,65 32,2211,89 12,825,87 1,831,00 1,580,65 36,6614,26 Cerveza (n=24) 397,58119,30 28,928,33 31,818,24 12,984,85 2,031,08 1,520,37 35,3911,55
38
Tabla 9. Valoracin de la ingesta diettica media diaria en mujeres (1) y hombres (2), durante el perodo de abstinencia alcohlica y con consumo moderado de cerveza.
Abstinencia (n=22) Alcohol (g) (1) Alcohol (g) (2) 00,01 00,01 Cerveza (n=22) 11,445,59 * 20,500,02*
Tabla 10. Consumo semanal de alimentos clasificados por grupos en mujeres durante el perodo de abstinencia y con un consumo moderado de cerveza.
Abstinencia (n=22) Cereales (g) Lcteos (g) Huevos (g) Azcares (g) Aceites (g) Verduras y hortalizas (g) Legumbres (g) Frutas (g) 1316580,5 26321027 213,1137,2 117,167,23 117,958,76 1524658,1 105,366,21 1457828,3 Cerveza (n=22) 1339624,7 2203770,9 * 199,41151,8 132,9106,6 98,0051,47 1352626,1 146,3138,7 1628901,4
Valores expresados como media desviacin estndar. * Diferencias significativas (p<0,05) entre abstinencia alcohlica y consumo moderado de cerveza. Test-t muestras pareadas.
Tabla 11. Consumo semanal de alimentos clasificados por grupos en mujeres, en un perodo de abstinencia alcohlica y con un consumo moderado de cerveza.
Abstinencia (n=22) Carnes (g) Pescados (g) Bebidas alcohlicas (g) Bebidas no alcohlicas (g) Salsas y condimentos (g) Precocinados (g) Aperitivos (g) 875,9300,2 676,3307,8 0,40,00 29161583 36383918 208,5176,5 61,9143,03 Cerveza (n=22) 908,8342,1 545,9342,9 2364244,78* 18701295 * 21262498 * 315,0237,5 * 157,5162,3
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Tabla 12. Consumo semanal de alimentos clasificados por grupos en hombres, en un perodo de abstinencia alcohlica y con un consumo moderado de cerveza.
Abstinencia (n=25) Cereales (g) Lcteos (g) Huevos (g) Azcares (g) Aceites (g) Verduras y hortalizas (g) Legumbres (g) Frutas (g) 16721037 27151756 238,5157,0 151,43127,7 98,3669,00 1446736,4 231,0219,0 16261089 Cerveza (n=25) 1530661,4 24461027 272,0129,7 149,5111,3 93,8058,76 1347571,0 205,0182,6 13871179
Tabla 13. Consumo semanal de alimentos clasificados por grupos en hombres, en un perodo de abstinencia alcohlica y con un consumo moderado de cerveza.
Abstinencia (n=25) Carnes (g) Pescados (g) Bebidas alcohlicas (g) Bebidas no alcohlicas (g) Salsas y condimentos (g) Precocinados (g) Aperitivos (g) 1196485,2 594,7360,5 0,50,01 24621933 44224617 340,1275,2 92,9287,91 Cerveza (n=25) 1329645,8 528,2390,8 46200,626 * 1415891,4 * 18892157 * 344,2224,3 91,0064,64
Tabla 14. Antropometra en mujeres en estado basal, despus del perodo de abstinencia alcohlica y despus de un consumo moderado de cerveza.
Basal (n=27) Peso (kg) Talla (cm) Pliegue bicipital (mm) Pliegue tricipital (mm) Pliegue subescapular (mm) Pliegue suprailaco (mm) * Permetro brazo (cm) * Permetro cintura (cm) Permetro cadera (cm) IMC (kg/m2) ndice cintura/cadera 60,894,26 159,550,04 7,262,31 17,144,19 20,177,30 17,505,80a 29,322,58a 77,605,46 96,536,15 24,022,75 0,800,05 Abstinencia (n=27) 60,954,03 159,550,04 7,351,68 17,004,16 20,895,65 18,835,69a 28,932,59b 77,675,02 95,694,68 24,032,49 0,810,03 Cerveza (n=27) 61,992,82 159,550,04 7,341,78 17,564,31 20,655,83 20,294,88b 28,712,59b 77,564,58 95,404,45 24,052,47 0,810,04
Valores expresados como media desviacin estndar. * Diferencias significativas (p<0,05) entre abstinencia alcohlica y consumo moderado de cerveza. Test-t muestras pareadas. Letras distintas indican diferencias significativas (p<0,05) entre los puntos (a,b,c).
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Tabla 15. Antropometra en hombres en estado basal, despus del perodo de abstinencia alcohlica y despus de un consumo moderado de cerveza.
Basal (n=30) Peso (kg) Talla (cm) Pliegue bicipital (mm) Pliegue tricipital (mm) * Pliegue subescapular (mm) Pliegue suprailaco (mm) Permetro brazo (cm) Permetro cintura (cm) Permetro cadera (cm) IMC (kg/m2) ndice cintura/cadera 73,008,32 172,870,75 5,652,57 10,393,22a 13,794,19 13,876,22 31,773,00 85,496,42 95,354,02 24,452,63 0,890,03 Abstinencia (n=30) 73,108,68 172,870,75 5,872,80 10,733,56ab 13,743,80 14,195,85 31,673,03 86,016,52 94,833,90 24,472,61 0,900,03 Cerveza (n=30) 73,548,40 172,870,75 5,842,68 10,983,51b 13,933,92 14,925,94 31,873,17 85,826,08 94,693,93 24,622,57 0,900,03
Valores expresados como media desviacin estndar. * Diferencias significativas (p<0,05) entre abstinencia alcohlica y consumo moderado de cerveza. Test-t muestras pareadas. Letras distintas indican diferencias significativas (p<0,05) entre los puntos (a,b,c).
Tabla 16. Parmetros hematolgicos (serie eritrocitaria) en mujeres en estado basal, despus de un perodo de abstinencia alcohlica y despus de un consumo moderado de cerveza.
Basal (n=27) Hemates (x1012/l) * Hemoglobina (g/dl) * Hematocrito (%) * VCM (fl) * HCM (pg) * CHCM (g/dl) * IDH (%) 4,220,26a 13,071,08a 38,133,19a 90,265,02a 30,931,92a 34,260,55a 14,161,97 Abstinencia (n=27) 4,260,25a 13,101,14a 37,893,10a 88,835,07b 30,722,05a 34,570,80a 14,011,69 Cerveza (n=27) 4,370,28b 13,331,28b 39,443,35b 90,265,19a 30,482,13b 33,760,88b 14,151,45
Valores expresados como media desviacin estndar. * Diferencias significativas (p<0,05) entre abstinencia alcohlica y consumo moderado de cerveza. Test-t muestras pareadas. * Letras distintas indican diferencias significativas (p<0,05) entre los puntos (a,b,c). Test-t muestras pareadas entre: estado basal, perodo de abstinencia y consumo moderado de cerveza.
Tabla 17. Parmetros hematolgicos (serie blanca), en mujeres en estado basal, despus de un perodo de abstinencia alcohlica y despus de un consumo moderado de cerveza.
Basal (n=27) Leucocitos (x109/l) * Neutrfilos (x109/l) * Linfocitos (x109/l) * Eosinfilos (x109/l) Monocitos (x109/l) Basfilos (x109/l) * 6,341,26a 3,430,88 a 2,140,50 0,190,18 0,510,15 0,050,02 a Abstinencia (n=27) 6,761,44b 3,691,17ab 2,320,55b 0,190,12 0,470,14 0,050,03ab Cerveza (n=27) 7,271,97b 4,131,53b 2,380,63b 0,180,12 0,490,15 0,060,03b
Valores expresados como media desviacin estndar, Diferencias significativas (p<0,05) entre abstinencia alcohlica y consumo moderado de cerveza. * Letras distintas indican diferencias significativas (p<0,05) entre los puntos (a,b,c). Test-t muestras pareadas entre: estado basal, perodo de abstinencia y consumo moderado de cerveza.
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Tabla 18. Parmetros hematolgicos (perfil leucocitario), en mujeres en estado basal, despus de un perodo de abstinencia alcohlica y despus de un consumo moderado de cerveza.
Basal (n=27) Neutrfilos (%) Linfocitos (%) Monocitos (%) * Eosinfilos (%) Basfilos (%) 53,756,36 34,025,90 8,313,06a 2,962,14 0,840,36 Abstinencia (n=27) 53,828,42 35,127,95 7,131,76ab 2,851,71 0,850,44 Cerveza (n=27) 55,937,95 33,597,50 6,801,68b 2,661,71 0,870,42
Valores expresados como media desviacin estndar. * Letras distintas indican diferencias significativas (p<0,05) entre los puntos (a,b,c). Test-t muestras pareadas entre: estado basal, perodo de abstinencia y consumo moderado de cerveza.
Tabla 19. Parmetros hematolgicos (serie trombocitica), en mujeres en estado basal, despus de un perodo de abstinencia alcohlica y despus de un consumo moderado de cerveza.
Basal (n=27) Plaquetas (x109/l) * VPM (fl) PDW (%) PTC (%) * 251,5948,89a 9,560,83 2,880,19 0,240,04a Abstinencia (n=27) 275,6249,34b 9,520,80 2,950,32 0,260,04b Cerveza (n=27) 279,1753,02b 9,660,80 2,910,27 0,260,04b
Valores expresados como media desviacin estndar. * Letras distintas indican diferencias significativas (p<0,05) entre los puntos (a,b,c). Test-t muestras pareadas entre: estado basal, perodo de abstinencia y consumo moderado de cerveza..
Tabla 20. Parmetros hematolgicos (serie eritrocitaria), en hombres en estado basal, despus de un perodo de abstinencia alcohlica y despus de un consumo moderado de cerveza.
Basal (n=30) Hemates (x1012/l) * Hemoglobina (g/dl) Hematocrito (%) * VCM (fl) * HCM (pg) * CHCM (g/dl) * IDH (%) 4,860,31a 14,870,82 43,352,48a 89,223,70a 30,591,23a 34,290,52a 14,190,76 Abstinencia (n=30) 4,930,37ab 14,991,01 43,153,00a 87,543,39b 30,411,36a 34,630,69b 14,200,70 Cerveza (n=30) 4,990,33b 15,020,96 44,702,76b 89,623,64a 30,121,41b 33,610,66c 14,170,86
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Tabla 21. Parmetros hematolgicos (serie blanca), en hombres en estado basal, despus de un perodo de abstinencia alcohlica y despus de un consumo moderado de cerveza.
Basal (n=30) Leucocitos (x109/l) Neutrfilos (x109/l) Linfocitos (x109/l) Eosinfilos (x109/l) Monocitos (x109/l) Basfilos (x109/l) * 6,191,28 3,330,88 2,110,57 0,170,10 0,480,17 0,050,03a Abstinencia (n=30) 5,951,05 3,060,79 2,170,43 0,180,09 0,460,14 0,060,02ab Cerveza (n=30) 6,141,34 3,241,10 2,200,51 0,180,09 0,450,14 0,060,03b
Tabla 22. Parmetros hematolgicos (perfil leucocitario), en hombres en estado basal, despus de un perodo de abstinencia alcohlica y despus de un consumo moderado de cerveza.
Basal (n=30) Neutrfilos (%) Linfocitos (%) Monocitos (%) * Eosinfilos (%) Basfilos (%) * 53,597,68 34,537,20 7,902,19ab 2,841,60 0,890,45a Abstinencia (n=30) 51,066,87 36,936,44 7,822,04a 3,091,69 0,990,40ab Cerveza (n=30) 52,138,01 36,357,19 7,361,68b 3,011,59 1,050,43
Tabla 23. Parmetros hematolgicos (serie tromboctica), en hombres en estado basal, despus de un perodo de abstinencia alcohlica y despus de un consumo moderado de cerveza.
Basal (n=30) Plaquetas (x109/l) * VPM (fl) * PDW (%) PTC (%) * 228,6641,82a 9,821,22a 3,000,36 0,220,03a Abstinencia (n=30) 243,0737,74b 10,251,59b 2,930,19 0,240,03b Cerveza (n=30) 238,1736,76ab 10,291,79ab 2,930,19 0,240,04b
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Tabla 24. Parmetros bioqumicos en mujeres, en estado basal, despus de un perodo de abstinencia alcohlica y despus de un consumo moderado de cerveza.
Basal (n=27) Glucosa basal (mg/dl) Colesterol total (mg/dl) * Colesterol HDL (mg/dl) * Colesterol LDL (mg/dl) Triglicridos (mg/dl) cido rico (mg/dl) * Urea (mg/dl) 88,079,73 190,4031,57ab 60,7011,50a 114,7031,71 4,250,37 4,190,81ab 28,775,05 Abstinencia (n=27) 90,448,08 186,1130,21a 57,7714,25a 113,0726,29 4,280,33 4,000,81a 28,145,57 Cerveza (n=27) 90,9612,72 196,1834,04b 66,8812,44b 114,2229,97 4,250,36 4,200,88b 29,076,01
Tabla 25. Parmetros bioqumicos (enzimas y protenas) en mujeres, en estado basal, despus de un perodo de abstinencia alcohlica y despus de un consumo moderado de cerveza.
Basal (n=27) GOT (U/l) GPT (U/l) GGT (U/l) * Protenas totales (g/dl) Albmina (g/dl) * Prealbmina (mg/dl) Ferritina (ng/ml) * 15,554,58 7,594,57 14,229,20ab 7,180,39 4,240,28a 23,962,84 3,690,91a Abstinencia (n=27) 15,514,07 8,774,61 13,857,34a 7,120,28 4,260,20a 24,372,28 3,680,84ab Cerveza (n=27) 16,253,54 9,705,48 14,887,44b 7,160,36 4,090,28b 24,033,19 3,570,95b
Tabla 26. Parmetros bioqumicos en hombres, en estado basal, despus de un perodo de abstinencia alcohlica y despus de un consumo moderado de cerveza.
Basal (n=30) Glucosa basal (mg/dl) Colesterol total (mg/dl) Colesterol-HDL (mg/dl) * Colesterol-LDL (mg/dl) Triglicridos (mg/dl) cido rico (mg/dl) Urea (mg/dl) 88,9329,96 209,4031,38 44,206,68a 138,4027,35 4,860,55 6,081,20 35,837,12 Abstinencia (n=30) 92,965,88 204,8634,9 41,337,0b 138,5633,37 4,790,41 5,891,04 37,838,47 Cerveza (n=30) 92,967,77 211,2029,67 46,507,92a 138,6828,25 4,840,52 6,111,06 35,136,36
44
Tabla 27. Parmetros bioqumicos (enzimas y protenas) en hombres, en estado basal, despus de un perodo de abstinencia alcohlica y despus de un consumo moderado de cerveza.
Basal (n=30) GOT (U/l) GPT (U/l) * GGT (U/l) * Protenas totales (g/dl) Albmina (g/dl) * Prealbmina (mg/dl) * Ferritina (ng/ml) 20,135,67 13,005,82a 22,9314,98ab 7,300,38 4,430,20a 27,803,04a 4,870,85 Abstinencia (n=30) 20,735,13 15,007,17b 19,969,51a 7,240,38 4,420,21a 29,163,09b 4,860,91 Cerveza (n=30) 20,865,12 14,006,09ab 21,639,34b 7,190,43 4,220,24b 29,563,52b 4,830,91
Tabla 28. Capacidad fagoctica y oxidativa en mujeres, en estado basal, despus de un perodo de abstinencia alcohlica y despus de un consumo moderado de cerveza.
Basal (n=27) B Coli (%) * F Coli (%) 33,9019,00a 54,0223,49 Abstinencia (n=27) 42,9023,37ab 53,5822,75 Cerveza (n=27) 48,8621,83b 62,3321,09
Valores expresados como media desviacin estndar. * Letras distintas indican diferencias significativas (p<0,05) entre los puntos (a,b,c). Test-t muestras pareadas entre: estado basal, perodo de abstinencia y consumo moderado de cerveza
Tabla 29. Capacidad fagoctica y oxidativa en hombres, en estado basal, despus de un perodo de abstinencia alcohlica y despus de un consumo moderado de cerveza.
Basal (n=30) B Coli (%) * F Coli (%) 27,3918,13a 50,7429,17 Abstinencia (n=30) 34,9825,40ab 51,1623,97 Cerveza (n=30) 39,2524,53b 57,2926,93
Tabla 30. Factores del complemento, en mujeres, en estado basal, despus de un perodo de abstinencia y despus de un consumo moderado de cerveza.
Basal (n=27) Complemento C3 * (g/l) Complemento C4 * (g/l) 1,090,16ab 0,210,06a Abstinencia (n=27) 1,060,13a 0,190,05b Cerveza (n=27) 1,140,21b 0,210,06a
45
Tabla 31. Factores del complemento, en hombres, en estado basal, despus de un perodo de abstinencia y despus de un consumo moderado de cerveza.
Basal (n=30) Complemento C3 (g/l) Complemento C4 (g/l) 1,310,18 0,250,06 Abstinencia (n=30) 1,300,17 0,240,05 Cerveza (n=30) 1,310,19 0,250,06
Valores expresados como media desviacin estndar. No existen diferencias significativas en el test de muestras pareadas
Tabla 32. Subpoblaciones linfocitarias en valores absolutos, en mujeres, en estado basal, despus de un perodo de abstinencia alcohlica y despus de un consumo moderado de cerveza.
Basal (n=29) CD2 (cel/ml) CD3 * (cel/ml) CD4 * (cel/ml) CD8 * (cel/ml) CD19 * (cel/ml) 1379,87616,60 1045,31532,97a 669,78371,95a 374,50217,18 a 146,2689,80a Abstinencia (n=29) 1511,43644,66 1291,05626,07a 816,85476,66ab 459,33218,51ab 188,26125,21ab Cerveza (n=29) 1547,97599,10 1465,34519,65b 911,44393,40b 499,86210,19b 212,76100,39b
Tabla 33. Subpoblaciones linfocitarias en valores absolutos, en hombres, en estado basal, despus de un perodo de abstinencia alcohlica y despus de un consumo moderado de cerveza.
Basal (n=29) CD2 (cel/ml) CD3 (cel/ml) CD4 (cel/ml) CD8 (cel/ml) CD19 (cel/ml) 1485,18663,26 1159,25547,42 689,23329,34 439,43236,66 258,64196,18 Abstinencia (n=29) 1424,76499,88 1141,84478,84 727,07325,44 432,91222,37 212,79132,75 Cerveza (n=29) 1278,98597,61 1228,51531,72 768,50327,34 459,24218,38 218,41138,07
Valores expresados como media desviacin estndar. No existen diferencias significativas.
46
Tabla 34. Porcentaje de subpoblaciones linfocitarias y cociente CD4/CD8, en mujeres, en estado basal, despus de un perodo de abstinencia alcohlica y despus de un consumo moderado de cerveza.
Basal (n=27) CD2 * (%) CD3 * (%) CD4 (%) CD8 (%) CD19(%) CD4/CD8 73,7011,62a 55,9113,84a 35,2011,16 19,418,15 7,953,26 2,111,16 Abstinencia (n=27) 65,0315,69b 54,7717,09a 37,0910,60 19,568,06 7,763,74 2,051,15 Cerveza (n=27) 64,909,88b 59,6710,89b 38,079,25 20,305,83 8,892,98 2,021,07
Valores expresados como media desviacin estndar. * Letras distintas indican diferencias significativas ( p<0,05) entre los puntos (a,b,c). Test-t muestras pareadas entre: estado basal, perodo de abstinencia y consumo moderado de cerveza
Tabla 35. Porcentaje de subpoblaciones linfocitarias y cociente CD4/CD8, en hombres, en estado basal, despus de un perodo de abstinencia alcohlica y despus de un consumo moderado de cerveza.
Basal (n=30) CD2 * (%) CD3 (%) CD4 (%) CD8 (%) CD19 (%) CD4/CD8 72,6312,20a 57,1511,05 34,719,52 21,345,72 11,544,81 1,690,58 Abstinencia (n=30) 67,4212,21a 57,3412,47 36,0510,50 21,438,52 9,965,13 2,061,64 Cerveza (n=30) 60,2216,97b 58,0715,22 35,1810,29 21,857,23 10,344,44 1,961,44
Valores expresados como media desviacin estndar. * Letras distintas indican diferencias significativas ( p<0,05) entre los puntos (a,b,c). Test-t muestras pareadas entre: estado basal, perodo de abstinencia y consumo moderado de cerveza.
Tabla 36. Test cutneo, en mujeres, en estado basal, despus de un perodo de abstinencia alcohlica y despus de un consumo moderado de cerveza.
Basal Nmero de respuestas positivas * Score (mm) 1,900,87a 6,282,57 Abstinencia 1,251,03b 4,864,37 Cerveza 2,111,61ab 7,833,95
47
Tabla 37. Test cutneo, en hombres, en estado basal, despus de un perodo de abstinencia alcohlica y despus de un consumo moderado de cerveza.
Basal Nmero de respuestas positivas * Score (mm) 3,571,39a 10,646,48 Abstinencia 2,430,97b 7,673,39 Cerveza 3,140,90ab 11,213,06
Tabla 38. Clasificacin por tipo de respuesta en el test cutneo, en mujeres, en estado basal, despus de un perodo de abstinencia alcohlica y despus de un consumo moderado de cerveza.
Basal Anergia (%) Hipoergia (%) Respuesta baja (%) Respuesta normal (%)
Valores expresados en porcentajes.
Abstinencia 22,22 33,33 33,33 11,1
Cerveza 11,11 11,11 33,33 44,44
0 40 50 10
Tabla 39. Clasificacin por tipo de respuesta en el test cutneo, en hombres, en estado basal, despus de un perodo de abstinencia alcohlica y despus de un consumo moderado de cerveza.
Basal Anergia (%) Hipoergia (%) Respuesta baja (%) Respuesta normal (%)
Valores expresados en porcentajes.
Abstinencia 0 57,1 42,9 0
Cerveza 0 42,8 57,2 0
0 42,8 42,8 14,4
48
Tabla 40. Produccin de citoquinas por PMBC,en mujeres, en estado basal, despus de un perodo de abstinencia alcohlica y despus de un consumo moderado de cerveza.
Basal (n=27) Abstinencia (n=27) Cerveza (n=27) 352,33421,20b,2 9659,2413546,01b,2 67,6357,91b,2 923,86744,85c,3 1751,3081597,72b 40554,8722046,27b,2
IL-2 * # (pg/ml) 68,73135,05a,1 85,53143,82a,1 IFN- * # (pg/ml) 5975,3016302,93a,1,2 3084,84 253,59a,2 IL-4 * # (pg/ml) 22,4625,57a,1 19,8527,01a,1 IL-10 * # (pg/ml) 84,7086,46a,1 388,33542,30b,2 TNF- * (pg/ml) 1313,211994,822a 1197,681066,06ab IL-6 * # (pg/ml) 20978,6624889,43a,1 41162,2457291,06a,12
Valores expresados como media desviacin estndar. * Letras distintas indican diferencias significativas (p<0,05) entre los puntos (a,b,c). Test-t muestras pareadas entre: estado basal, perodo de abstinencia y consumo moderado de cerveza # Nmeros distintos indican diferencias significativas (p<0,05) entre los puntos (a,b,c). Test aplicado: rangos de Wilcoxon con clculo de probabilidad exacta.
Tabla 41. Produccin de citoquinas por PMBC,en hombres, en estado basal, despus de un perodo de abstinencia alcohlica y despus de un consumo moderado de cerveza.
Basal (n=30) IL-2 * # (pg/ml) 122,21152,56a,1 IFN- * # (pg/ml) 13671,0730351,68ab,1 IL-4 * # (pg/ml) 29,9035,15ab,1 IL-10 * # (pg/ml) 110,083100,972a,1 TNF- * (pg/ml) 1324,65900,18 IL-6 * # (pg/ml) 20546,2921519,52 Abstinencia (n=30) 98,69113,19a,1 2670,362769,31a,2 24,4627,74a,1 243,10294,08b,2 1266,731044,92 26335,2619995,10 Cerveza (n=30) 541,27774,818b,2 8878,907811,81b,2 43,3032,83b,2 801,526957,72c,3 1391,14721,80 25256,2715457,54
Valores expresados como media desviacin estndar. * Letras distintas indican diferencias significativas (p<0,05) entre los puntos (a,b,c). Test-t muestras pareadas entre: estado basal, perodo de abstinencia y consumo moderado de cerveza # Nmeros distintos indican diferencias significativas (p<0,05) entre los puntos (a,b,c). Test aplicado: rangos de Wilcoxon con clculo de probabilidad exacta.
Tabla 42. Valores mximos y mnimos de la produccin de citoquinas por PBMC, en mujeres, en estado basal, despus de un perodo de abstinencia alcohlica y despus de un consumo moderado de cerveza.
Basal (n=22) Mnimo Mximo IL-2 * # (pg/ml) IFN- * # (pg/ml) IL-4 * # (pg/ml) IL-10 * # (pg/ml) TNF- * (pg/ml) IL-6 * # (pg/ml) 00,0 19,40 1,90 00,0 22,00 14,60 687,3 83978 116,4 327,2 7782 99035 Abstinencia (n=22) Mnimo Mximo 2,40 3,30 1,20 2,30 26,90 73,60 550,9 38673 115,6 1907 3562 303363 Cerveza (n=22) Mnimo Mximo 39,30 50,00 15,40 57,50 92,60 10115 1631 1381 225,6 3500 7549 123668
49
Tabla 43. Valores mximos y mnimos de la produccin de citoquinas por PBMC, en hombres, en estado basal, despus de un perodo de abstinencia alcohlica y despus de un consumo moderado de cerveza.
Basal (n=27) Mnimo Mximo IL-2 * # (pg/ml) IFN- * # (pg/ml) IL-4 * # (pg/ml) IL-10 * # (pg/ml) TNF- * (pg/ml) IL-6 * # (pg/ml) 0,00 19,10 4,70 6,60 190,7 12,10 583,7 154340 184,6 369,9 3099 94226 Abstinencia (n=27) Mnimo Mximo 0,00 36,20 0,00 0,00 23,60 1,90 451,1 8650 121,7 1433 4126 77832 Cerveza (n=27) Mnimo Mximo 5,70 335,6 3,3 51,00 173,1 4767 3797 35844 119,2 4285 3570 59988
Tabla 44. Inmunoglobulinas sricas, en mujeres, en estado basal, despus de un perodo de abstinencia alcohlica y despus de un consumo moderado de cerveza.
Basal (n=27) Ig G (mg/dl)* Ig A (mg/dl)* Ig M (mg/dl)* 1071,81202,56a 201,0370,93a 156,1461,90a Abstinencia (n=27) 1039,66184,87b 207,7775,91b 148,4860,79b Cerveza (n=27) 1130,85203,03c 214,5977,58c 157,8160,08a
Tabla 45. Inmunoglobulinas sricas, en hombres, en estado basal, despus de un perodo de abstinencia alcohlica y despus de un consumo moderado de cerveza.
Basal (n=27) Ig G (mg/dl)* Ig A (mg/dl)* Ig M (mg/dl)* 966,23181,32a 204,2084,30a 136,5068,73ab Abstinencia (n=27) 957,73193,29a 206,0385,81a 123,9353,65a Cerveza (n=27) 1027,00217,40b 215,3682,91b 136,5663,41b
50
6.2. ESTUDIOS
EN
ANIMALES
DE
EXPERIMENTACIN
Tabla 46. Parmetros dietticos en ratas control, con consumo moderado de cerveza, con cerveza sin alcohol o con consumo moderado de etanol.
Control (n=10) Ingesta de dieta (g)* Sustancia fresca (ssf) (g)* Sustancia seca (sss) (g)* Ingesta de bebida (ml)* 22,394,74a 22,394,74a 20,804,80a 22,983,70a Cerveza (n=10) 17,852,77bc 17,852,77bc 17,032,65b 33,194,45b Cerveza sin alcohol (n=10) 18,332,42bc 18,332,42bc 18,062,37ac 57,5529,53c Etanol (n=10) 18,781,62ac 18,781,62ac 17,361,79ab 18,451,70a
Valores expresados como media desviacin estndar. * Valores de varianza (ANOVA) de una va, factor fijo (grupo), corregido por la dieta y la bebida (covariantes). Letras distintas indican diferencias significativas entre los grupos de control, con consumo moderado de cerveza, cerveza sin alcohol y etanol. Test de pares de Bonferroni entre grupos (p=0,05).
Tabla 47. Parmetros ponderales en ratas control, con consumo moderado de cerveza, con cerveza sin alcohol o con consumo moderado de etanol.
Control (n=10) Cerveza (n=10) Cerveza sin alcohol (n=10) 272,7811,90 369,7134,53 96,9326,68 3,4610,95 265,9377,23 0,190,037b 0,5530,086 0,7510,077 0,1510,026 0,2040,022 21,003,80 Etanol (n=10) 272,9511,57 381,8116,48 108,8613,01 3,8870,46 296,9936,67 0,220,034ab 0,6050,087 0,7770,08 0,1580,020 0,2040,022 20,503,37
Peso inicial 280,268,52 272,4720,16 Peso final 397,7817,38 387,2547,80 Ganancia de peso (g/da) 117,5217,02 114,7834,63 Incremento de peso 4,1970,61 4,0991,24 Porcentaje de incremento de peso (%) 329,146,21 315,79111,54 Eficacia alimentaria * 0,2070,037ab 0,2380,044a Peso de timo (g) 0,5900,080 0,6120,156 Peso de bazo (g) 0,7760,12 0,7510,13 ndice timo-somtico 0,1490,021 0,1600,039 ndice espleno-somtico 0,1950,031 0,1940,026 Nmeros de placas de Peyer 22,502,95 19,303,77
Valores expresados como media desviacin estndar. * Valores de varianza (ANOVA) de una va, factor fijo (grupo), corregido por la dieta y la bebida (covariantes). Letras distintas indican diferencias significativas entre los grupos de control, con consumo moderado de cerveza, cerveza sin alcohol y etanol. Test de pares de Bonferroni entre grupos (p<0,05).
51
Tabla 48. Estudio en timo: subpoblaciones linfocitarias, y cociente CD4/CD8, en ratas control, con consumo moderado de cerveza, con cerveza sin alcohol o con consumo moderado de etanol.
Control (n=10) CD4+CD8+ (%) CD4+CD8- (%) CD4-CD8+ (%) CD4/CD8 80,614,64 10,181,39 5,231,10 1,970,44 Cerveza (n=10) 82,933,92 9,712,49 4,731,20 2,110,61 Cerveza sin alcohol (n=10) 78,864,01 11,093,32 5,762,23 2,040,69 Etanol (n=10) 79,175,41 11,312,60 6,482,32 1,960,94
Valores expresados como media desviacin estndar.
Tabla 49. Estudio en bazo: subpoblaciones linfocitarias, y cocientes CD4/CD8 y CD2/CD45RA en ratas control, con consumo moderado de cerveza, con cerveza sin alcohol o con consumo moderado de etanol.
Control (n=10) CD2 (%) CD3 (%) CD4 (%) CD8 (%) CD45RA (%) CD4/CD8 CD2/CD45RA 44,1310,05 43,737,82 27,485,58 16,513,72 38,946,45 1,7530,536 1,1810,411 Cerveza (n=10) 45,874,71 38,106,33 28,433,17 15,572,39 38,646,10 1,8620,336 1,2250,295 Cerveza sin alcohol (n=10) 45,004,50 39,964,42 29,224,47 14,792,23 40,596,50 2,0170,333 1,1450,267 Etanol (n=10) 45,576,32 31,945,60 26,295,89 17,753,69 37,954,87 1,5460,465 1,2330,300
Tabla 50. Estudio en placas de peyer: subpoblaciones linfocitarias, y cocientes CD4/CD8 y CD2/CD45RA en ratas control, con consumo moderado de cerveza, con cerveza sin alcohol o con consumo moderado de etanol.
Control (n=10) CD2 (%) CD3 (%) CD4 (%) CD8 (%) CD45RA (%) CD161 (%) CD4/CD8 CD2/CD45RA 51,5319,78 53,4915,43 17,696,06 3,062,30 42,0012,37 6,435,38 11,048,74 1,511,28 Cerveza (n=10) 54,7722,17 47,3516,96 16,725,02 2,261,43 40,2812,48 6,594,58 11,087,97 1,661,16 Cerveza sin alcohol (n=10) 54,5722,82 50,8616,95 16,314,69 3,615,39 43,2011,48 5,214,15 8,595,13 1,470,84 Etanol (n=10) 55,6726,08 51,9323,67 15,694,42 4,433,94 36,0010,05 5,783,27 6,455,48 1,841,36
52
Tabla 51. Estudio en sangre perifrica: subpoblaciones linfocitarias, y cocientes CD4/CD8 y CD2/CD45RA en ratas control, con consumo moderado de cerveza, con cerveza sin alcohol o con consumo moderado de etanol.
Control (n=10) CD2 (%) CD3 (%) CD4 (%) CD8 (%) CD45RA (%) CD161 (%) CD4/CD8 CD2/CD45RA 47,107,83 35,1110,62 33,086,08 11,646,02 27,245,71 4,192,14 3,511,88 1,790,43 Cerveza (n=10) 46,135,97 29,798,51 31,314,50 10,364,17 27,406,15 5,340,87 3,481,67 1,750,43 Cerveza sin alcohol (n=10) 47,375,67 29,9110,05 36,663,74 11,443,10 26,078,48 4,931,57 3,370,80 1,950,55 Etanol (n=10) 48,648,73 36,4911,53 36,766,62 11,334,28 25,707,00 4,402,09 3,410,83 2,010,64
Tabla 52. Capacidad fagoctica de ratas control, con consumo moderado de cerveza, con cerveza sin alcohol o con consumo moderado de etanol.
Control (n=10) Fago control (%) Fago coli (%) 0,300,29 43,8812,37 Cerveza (n=10) 0,320,39 56,3715,85 Cerveza sin alcohol (n=10) 0,110,14 52,0432,18 Etanol (n=10) 0,220,15 39,2725,38
Tabla 53. Citoquinas en ratas control, con consumo moderado de cerveza, con cerveza sin alcohol o con consumo moderado de etanol.
Control (n=10) IL-2 (pg/ml) TNF- (pg/ml) Cerveza (n=10) Cerveza sin alcohol (n=10) Etanol (n=10)
121,9077,59 192,90206,43 185,18118,50 143,0773,83 385,98156,09 358,13283,86 352,70217,44 455,83270,78
Tabla 54. Valores mximos y mnimos de citoquinas en ratas control, con consumo moderado de cerveza, con cerveza sin alcohol o con consumo mooderado de etanol.
Control Cerveza Cerveza sin (n=10) (n=10) alcohol (n=10) Mnimo Mximo Mnimo Mximo Mnimo Mximo IL-2 (pg/ml) TNF- (pg/ml) 75,96 214,0 334,97 659,2 53,70 103,4 765,4 879,6 43,06 130,9 453,0 795,1 Etanol (n=10) Mnimo Mximo 53,70 158,4 293,0 1156
53

10 Estudio Cerveza y Sistema Inmunologico 69 PDF

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Consumo moderado de cerveza.

Estudio nutricional e inmunolgico en humanos y animales de experimentacin

DATOS EXPERIMENTALES ........................................................................ 36

Cuadro 2. Diseo experimental del estudio.

Antropometra Hematologa Bioqumica Inmunologa

RCA 7 das Antropometra Hematologa Bioqumica Inmunologa

RCA 7 das Antropometra Hematologa Bioqumica Inmunologa

5.1.3. PARMETROS ESTUDIADOS Cuadro 3. Parmetros dietticos

Cuadro 4. Parmetros antropomtricos e ndices calculados

Cuadro 5. Parmetros biolgicos

5.1.4.2. PARMETROS 5.1.4.2.1. TALLA

5.1.4.5. PARMETROS 5.1.4.5.1. CAPACIDAD

Y PORCENTAJE DE SUBPOBLACIONES LINFOCITARIAS

5.1.4.5.5. FUNCIN INMUNE (CYTOMETRIC BEAS ARRAY).

VITRO": SECRECIN DE CITOQUINAS MEDIDAS POR

Se realiz una estimacin de missing-data para las variables sealadas basada

5.2. METODOLOGA DEL ESTUDIO EN ANIMALES DE EXPERIMENTACIN

Cuadro 8. Composicin de la dieta (AIN93G)

Cuadro 10. Parmetros inmunolgicos estudiados en animales

Valores expresados como media desviacin estndar. No existen diferencias significativas.

Abstinencia 22,22 33,33 33,33 11,1

Cerveza 11,11 11,11 33,33 44,44

Abstinencia 0 57,1 42,9 0

Cerveza 0 42,8 57,2 0

0 42,8 42,8 14,4

Valores expresados como media desviacin estndar.

Valores expresados como media desviacin estndar.

Valores expresados como media desviacin estndar.

Valores expresados como media desviacin estndar.

Valores expresados como media desviacin estndar.

121,9077,59 192,90206,43 185,18118,50 143,0773,83 385,98156,09 358,13283,86 352,70217,44 455,83270,78

Valores expresados como media desviacin estndar.

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