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Pruebas bioqumicas de identificacin

Bioq. Mara de los ngeles Sosa

Pruebas de Identificacin rpidas


1. Prueba de la catalasa 2. Prueba de la coagulasa 3. Prueba de PYR 4. Prueba de oxidasa

Pruebas de Identificacin para Cocos Gram +


1. 2. 3. 4. 5. 6. DNasa Prueba del manitol salado Bilis esculina CAMP Hidrlisis del hipurato Voges Proskauer

Pruebas de sensibilidad a ATB 1. Disco de Optoquina 2. Disco de novobiocina 3. Disco de Bacitracina

catalasa

Prueba de la catalasa
Fundamento: Detecta la presencia de la enzima catalasa. Procedimiento: En portaobjetos colocar sobre una colonia unas gotas de H202 3 %. H202 H20 + 02 Liberacin de burbujas rpida y sostenida indica la produccin de oxgeno molecular = prueba (+) Consideraciones: No Agar sangre (peroxidasa en los eritrocitos).

coagulasa

Prueba de la coagulasa
Fundamento: Detecta un factor de agregacin clumping factor en la superficie de la bacteriana. Procedimiento: se coloca una colonia sospechosa de pertenecer a una especie de Staphylococcus y se emulsifica en una gota de plasma de conejo. Interpretacin: arracimamiento bacteriano en 1 minuto = prueba (+). Si el resultado es negativo ensayar la produccin de coagulasa en tubo. Consideraciones: Utilizar plasma con EDTA y no citratado, ya que organismos capaces de metabolizar el citrato (Enterococcus spp.) pueden dar resultados falsos (+). Las pruebas (-) luego de 4 hs de incubacin a 35C, dejar a temperatura ambiente y leer luego de 18-24 hs a fin de evitar la fibrinlisis que producen algunas cepas al ser incubadas en forma prolongada a 35C.

Prueba de PYR

Prueba del PYR:


Fundamento: detecta la enzima pirrolidonil arilamidasa se utiliza como sustrato el reactivo L-pirrolidonil- beta-naftilamida (PYR), para la identificacin rpida de enterococos. Procedimiento: Realizar un alto inculo (2 MacFarland) e introducir un disco de PYR. Tiempo y T de incubacin: 30 minutos a 35 C. Tiempo de lectura: 5 minutos. Interpretacin: Disco rosado o rojo (+) Disco y/o solucin amarillo a incoloro (-). Consideraciones: Algunas especies de Staphylococcus y los estreptococos del grupo A dan, tambin, una prueba positiva.

DNAsa

Prueba de la DNAsa
Fundamento: El S. aureus produce una DNAasa termoestable que hidroliza DNA. La produccin de DNAsa puede determinarse incorporando cido desoxirribonucleico (DNA) en agar nutritivo . Procedimiento: Se inocula el microorganismo en manchas densas sobre agar DNA y despus de 18 a 24 hs de incubacin. Revelar con HCl al 1%, que precipita el DNA nativo del medio.

Interpretacin: colonias rodeadas por una zona clara donde el ADN ha sido despolimerizado e hidrolizado = prueba (+)

Manitol salado

Agar Manitol salado


Fundamento: el medio contiene manitol (1%), cloruro de sodio (7,5 %), rojo de fenol y peptonas. Procedimiento: Sembrar la cepa e incubar 18 a 24 hs a 35C. Interpretacin: Crecimiento y viraje S. aureus Crecimiento sin viraje. S. epidermidis

Consideraciones: La alta concentracin de sal inhibe otros microorganismos excepto enterococos (por lo tanto usar la placa para identificacin, no para aislamiento).

Bilis Esculina

Prueba de la bilis-esculina:
Fundamento: Se basa en la capacidad de ciertas bacterias (estreptococos del grupo D) para hidrolizar la esculina en presencia de 1-4% de sales biliares. Procedimiento: Se inocula el microorganismo en la superficie de un pico de flauta. Incubar 24 hs. Interpretacin: La beta glucosidasa escinde la esculina en glucosa y esculetina. Esta ultima es soluble en el medio y forma un complejo de color negro con Fe 3+ .La hidrlisis de esculina se observa como un oscurecimiento del medio (color negro) en 24 hs de incubacin a 35C, raramente se requieren 48 hs de incubacin hasta que la hidrlisis sea aparente. Consideraciones: Es importante que el medio contenga 40% de bilis, ya que algunos productos contienen menos cantidad lo que lleva a confundir algunos estreptococos viridans con enterococos

Prueba de CAMP
Fundamento: Los estreptococos grupo B secretan el factor CAMP que interacta con la -hemolisina secretada por una cepa hemoltica de S. aureus (ATCC 25923) lo que causa un acrecentamiento o sinergismo de la hemlisis. Procedimiento: En placa de agar sangre sembrar una estra de la cepa de S. aureus y perpendicularmente a sta (lo ms cerca posible, sin llegar a tocarla) sembrar la cepa de estreptococo en estudio. Tiempo y T de incubacin: Incubar 24 hs a 35C en aerobiosis (en CO2 aumentan los falsos positivos). Interpretacin: El sinergismo se observa como un rea de Hemlisis en forma de punta de flecha en la zona de desarrollo ms cercana a ambas estras.

Prueba de CAMP

Prueba del hipurato de sodio


Fundamento: Ciertas cepas son capaces de hidrolizar el hipurato de sodio. La produccin de hipuricasa resulta en la hidrlisis del hipurato de sodio con la formacin de benzoato de sodio y glicina. Procedimiento: Inocular un tubo con medio hipurato de sodio con el microorganismo. Incubar 24 hs a 35C. Centrifugar. Pipetear 0.8 ml el sobrenadante. Agregar 0.2 ml de cloruro frrico 7%. Inocular un tubo con 0.4 ml de medio hipurato de sodio con el microorganismo. Incubar 2 hs a 35C. Agregar 0.2 ml de Ninhidrina. Interpretacin: La formacin de un precipitado denso y persistente por 10 minutos = prueba (+) Benzoato de sodio La aparicin de un color prpura profundo = prueba (+) glicina.

Hidrlisis de hipurato

Prueba de la susceptibilidad a la Novobiocina


Fundamento: Se basa en que ciertas bacterias son sensibles a la novobiocina. Procedimiento: Se inocula el microorganismo en agar Mueller Hinton segn tcnica de Kirby-Bauer, utilizando discos de Novobiocina (5 g). Interpretacin: Sensible: inhibicin del desarrollo con un dimetro mayor o igual a 16 mm Staphylococcus R Micrococcus S Consideraciones: Kirby Bauer (Difusin en disco) Inoculo sin incubacin previa Tiempo de lectura: 24 hs. T de incubacin: 33 a 35

Prueba de la Bacitracina:
Fundamento: Se basa en que ciertas bacterias son sensibles a la bacitracina. Procedimiento: Se inocula el microorganismo en AS segn tcnica de Kirby-Bauer utilizando discos de Bacitracina (0.04 U). Interpretacin: Sensible: Cualquier zona de inhibicin del desarrollo. Consideraciones: Kirby Bauer (Difusin en disco) Inoculo sin incubacin previa Tiempo de lectura: 18 a 24 hs. T de incubacin: 33 a 35 en CO2 Recordar que el uso de discos de Bacitracina en forma directa en las placas primarias de cultivo puede dar como resultado un 40% a 50% de falsos negativos.

Prueba de la Bacitracina

Prueba de la optoquina

Pruebas de Identificacin para enterobacterias


1. Prueba OF 2. Prueba de la oxidasa o citocromooxidasa 3. TSI 4. SIM (Sulfhdrico- Indol- Movilidad) 5. Rojo de metilo - Voges Proskauer 6. ONPG (O-nitrofenil-b-galactopiranosido) 7. Citrato 8. Ureasa 9. Fenil-alanina-desaminasa 10.Descarboxilasas

Oxidasa

NEG

POS

CITOCROMOOXIDASA O PRUEBA DE LA OXIDASA


Fundamento: El sistema citocromooxidasa, se halla en microorganismo aerobios, microaerfilos y anaerobios facultativos. Procedimiento: Hacer una suspensin del microorganismo con solucin fisiolgica (inculo) en un tubo de vidrio, agregar un disco (disco comercial de papel impregnado de tetrametil-paradifenilamina) se agita y antes de los 2 minutos se debe leer. Interpretacin: Un cambio de color del disco a rosado o violeta = prueba (+). Si no hay cambio de color el microorganismo es oxidasa negativo.

Consideraciones Esta prueba no puede realizarse con colonias que provengan de medios de cultivo que contenga hidratos de carbono ni indicadores, por lo que si se la va a realizar se debe incubar los microorganismos en un placa de AS o bien un TSA (tripteina-soya-agar)

Prueba OF

PRUEBA DE OXIDACIN FERMENTACIN (O-F)


Fundamento: Determinan el metabolismo oxidativo o fermentativo de un hidrato de carbono o su falta de utilizacin. Se usa el medio O-F de Hugh y Leifson que contiene peptonas e hidratos de carbono en una relacin 1:5. Al ser menor la concentracin de peptonas, hay menor produccin de productos de oxidacin a partir de los AA que tienden a elevar el pH y pueden neutralizar los cidos dbiles producidos por los microorganismos no fermentadores. Procedimiento: Se utilizan 2 tubos con el medio O-F, se hace la siembra con ansa de punta hasta el fondo de los dos tubos. Uno de los tubos queda expuesto al aire, y el otro se cubre con vaselina estril. Interpretacin: Microorganismos oxidativo: producen cido solo en el tubo abierto, expuesto al O2 atmosfrico. Por lo que solamente el tubo expuesto al aire atmosfrico cambia su color original a amarillo. Microorganismos fermentadores: producen cido en los 2 tubos. O sea que los dos tubos viran del verde al amarillo. Bacterias sacarolticas: son inertes a este medio que conserva su pH alcalino despus de la incubacin, conservando su color original.

Triple Azcar Hierro

TSI (TRIPLE AZCAR HIERRO AGAR)


Fundamento: Sirve para detectar la fermentacin de hidratos de carbono. El medio contiene: glucosa al 0.1%, lactosa 1%, sacarosa al 1% y peptonas; tambin tiene un indicador rojo de fenol y sulfato de hierro para evidenciar la formacin de SH2. Procedimiento: El medio se fracciona en picos de flauta con una capa basal profunda (2 cm. por lo menos). Con el ansa en punta se siembra por puncin y estra. El medio no inoculado es anaranjado-rojizo o rojo plido. Incubar 24 hs a 35 C.

TSI (TRIPLE AZCAR HIERRO AGAR)


Interpretacin: Fermentacin de la glucosa (alcalino/cido) Primero los microorganismos empiezan a fermentar la glucosa, produciendo cidos y virando totalmente el medio a color amarillo. Como solamente utilizan la glucosa, no pueden usar la sacarosa ni la lactosa, cuando la glucosa que se halla en baja concentracin se consume (antes de las 24hs) los microorganismos comienzan a utilizar la peptonas con produccin de amonaco que alcaliniza el medio dando un color rojo, pero solamente en el pico, quedando el fondo cido. Fermentacin de glucosa, lactosa y sacarosa (cido/cido) Como la lactosa y sacarosa estn en una proporcin 10 veces mayor que la glucosa, en un perodo de 24hs., la lactosa y sacarosa, an no se consumen quedando cido el medio o sea totalmente amarillo. 3) No fermentacin de lactosa, sacarosa ni glucosa (alcalino/alcalino). Un microorganismo incapaz de obtener sus nutrientes de los hidratos de carbono, lo obtiene de las peptonas. Cuando las peptonas son degradadas libran amonaco y alcalinizan el medio. Producindose entonces intensificacin del color.

Consideraciones del TSI


Es importante respetar el tiempo de lectura, porque si el caso 1 se lee antes de las 24hs. se va a interpretar como ac/ac y no lo es. Si el 2 se lee despus de las 24hs, los microorganismo ya se quedan sin hidratos de carbono, entonces comienzan a utilizar las peptonas y se alcaliniza el medio. Con respecto al sulfhdrico pueden presentarse distintas modalidades: Pico rojo, fondo amarillo con precipitado negro y formacin de gas, esto se puede dar en Salmonella, se lee: alc/ac (SH2) (gas) Tambin se puede ver totalmente amarillo y el fondo negro: se lee: ac/ac (SH2). Adems se puede visualizar en el tubo la produccin de gas por parte del microorganismo, entonces en el medio se observan burbujas, resquebrajamiento, o si no todo el medio de cultivo aparece levantado.

SIM

SIM (SULFHDRICO INDOL MOVILIDAD)


Fundamento: Es un medio semi-slido transparente que pone en evidencia la movilidad, la produccin de triptofanasa y de SH2. Contiene: Triptofano: la enzima triptofanasa, lo desdobla, produce indol, que se pone de manifiesto con el reactivo de Erlich o Kovac Citrato de hierro y amonio: los microorganismos productores de SH2 ennegrecen el medio de cultivo Si los microorganismos son mviles, al ser ste un medio semi-slido se produce enturbiamiento del medio de cultivo, caso contrario solo crece en la puncin. Procedimiento: se inocula el microorganismo por puncin con ansa de punta. Se deja incubar a 35C durante 24hs. y luego de este tiempo se agregan unas gotas del reactivo de Erlich o Kovac dejndolo resbalar por las paredes del tubo. Interpretacin: Triptfano (+): observar la interfase, la aparicin de un color rojo fucsia brillante por la formacin de un complejo entre el indol y el pdimetilaminobenzaldehido. M (+) / SH2 (-) enturbiamiento del medio M (+) / SH2 (+), se ennegrece todo el medio M (-) / SH2 (-) se observa crecimiento solamente en la estra M (-) / SH2 (+), se observa precipitado negro alrededor de la estra (pero no ennegreciendo de todo el medio).

SIM
SH2+ Ind+ Mot+ SH2+ IndMotSH2- Ind+ Mot+
SH2- IndMot-

Prueba de VP y RM

ROJO DE METILO VOGES PROSKAUER:


Fundamento: El acido pirvico, un compuesto fundamental formado en la fermentacin de la glucosa, es metabolizado an mas a travs de cierto numero de vas metablicas. Una de ellas da como resultado la produccin de acetona (acetil-metil-carbinol) un producto final de reaccin neutra. En presencia de oxigeno e KOH al 40%, la acetona es convertida en diacetilo y el naftol sirve como catalizador para producir un complejo de color rojo. Procedimiento: Se usa el mismo caldo de enriquecimiento para las dos pruebas (2ml), se hace la inoculacin del microorganismo, y se lleva a incubar a 35C durante como mnimo 24-72hs.. Luego se lo divide en dos partes, una para la prueba de RM y otra para la de VP. Rojo de metilo: se agregan 3 gotas del reactivo de metilo, si en la superficie del medio aparece un color rojo intenso es RM (+) = microorganismos que utilizan la glucosa fermentndola hasta llegar a un pH menor a 4,4. VP: Se agrega 0.6 ml de alfa-naftol seguidos de 0,2 ml de KOH al 40%. Es esencial que los reactivos se agreguen en este orden. El tubo se sacude suavemente y luego se deja quieto de 10 a 15 min. La aparicin de color rojo = prueba (+) (presencia de acetil-metil-carbinol).

ONPG

ONPG (O-NITROFENIL-GALACTOPIRANSIDO)
Fundamento: Lo microorganismos lactosa (+) tienen -galactosidasa y permeasa, dos enzimas necesarias para la formacin de cidos a partir de la lactosa La permeasa es necesaria para que la molcula de lactosa ingrese en la clula bacteriana. Hay algunos microorganismo que son falsos lactosa (-) por carecer de permeasa, pero s tienen -galactosidasa, en realidad son lactosas (+). Esta prueba se hace con los microorganismo que dan lactosa (-) Procedimiento: Hacer un inculo con SF estril, agregar un disco de papel comercial, se agita y antes de los 2 minutos se debe leer. Interpretacin: Un color amarillo intenso nos indica que el microorganismo es productor de -galactosidasa= prueba (+). Consideraciones Se hace un inculo del microorganismo en solucin fisiolgica estril, se agrega un disco de papel. Se lleva a incubar a 37C durante 24hs.

Citrato

CITRATO
Fundamento: Sirve para poner de manifiesto aquellos microorganismos que utilizan el citrato como nica fuente de carbono, el indicador es azul de bromo timol. Procedimiento: El color original del medio es verde, y se encuentra fraccionado en pico de flauta, la siembra se hace por estra, se incuba 24-72hs a 35C. Interpretacin: Si el microorganismo utiliza citrato, se produce alcalinizacin del medio de cultivo pasando ste a color azul intenso, lo cual indica prueba positiva para el citrato.

Ureasa
Positivo Negativo

UREA:
Fundamento: Sirve para poner de manifiesto aquellos microorganismo que poseen la enzima ureasa. Procedimiento: El medio fraccionado en pico de flauta contiene urea y rojo de fenol como indicador, el color original del medio es amarillo (o sea cido) La siembra se realiza con ansa de punta tanto en profundidad como en la superficie. Se deja incubar 24 hs a 35 C. Interpretacin: Si el microorganismo es productor de ureasa, desdobla la urea produciendo amonaco, consecuentemente produce alcalinidad que se manifiesta porque el medio toma un color fucsia.

Fenilalanina
(-) (+)

FENIL-ALANINA-DESAMINASA:
Fundamento: Sirve para poner de manifiesto aquellos microorganismo que poseen la enzima FENILALANINA-DESAMINASA. El medio se prepara con un pico de flauta largo, pues la lectura se hace sobre la superficie del medio de cultivo.

Procedimiento: Se siembra sobre la superficie del medio solamente, se incuba 24 hs a 35 C, se revela con cloruro frrico. Interpretacin: El color original es amarillo, si el microorganismo es productor de la enzima, al agregar sobre el medio cloruro frrico, sta se pone de manifiesto, dando a la superficie un color verde intenso.

Lisina Decarboxilasa

AMINOCIDOS: DESCARBOXILASAS:
Fundamento: Las descarboxilasas son enzimas sustratoespecficas (presentes o no en los microorganismos) capaces de reaccionar con la porcin carboxilo (COOH) de AA formando aminas de reaccin alcalina. Esta reaccin, conocida como descarboxilacin, forma C02 como producto secundario. Cada descarboxilasa es especfica para un aminocido. Lisina, arginina y ornitina son los aminocidos evaluados de rutina en la identificacin de enterobacterias. El medio Moeller es la base (semi-slida) que se emplea con ms frecuencia. El aminocido se agrega a la base. El color original es lila. Procedimiento: Se inoculan por puncin 2 tubos y se sellan con aceite mineral. Uno de los tubos contiene el AA y el otro no. Interpretacin: Si el aminocido es descarboxilado, se forman aminas alcalinas y el medio pasa a violeta ms intenso. Si no es descarboxilado pero fermenta la glucosa, vira al amarillo por la formacin de cidos

Lisina Hierro Agar (LIA)

LIA SH2 -

LIA + SH2 -

LIA + SH2 -

LIA: Agar de ensayo para la demostracin simultnea de lisina decarboxilasa (LD) y de la formacin de hidrogeno sulfurado (H2S) para la identificacin de enterobacterias. La lisina puede ser descarboxilada por microorganismos LD positivas que la transforman en la amina cadaverina. Esto produce un viraje al violeta del indicador de pH prpura de bromocresol,puesto que la descarboxilacin slo tiene lugar en medio cido (pH inferior a 6.0). Es necesario que se produzca previamente la acidificacin del medio decultivo, por fermentacin de la glucosa. Este medio de cultivo solo puede utilizarse para la diferenciacin de bacterias que fermentan glucosa. Los microorganismos LD negativos, pero fermentadores de la glucosa, producen un viraje al amarillo de la totalidad del medio de cultivo. La incubacin prolongada puede ocasionar alcalinizacin en la zona de la superficie del medio de cultivo y en consecuencia, se produce un viraje al violeta. La formacin de H2S produce una coloracin negra debido al sulfuro de hierro producido.

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