LUCRARE PRACTIC|

DIFUZIUNEA {I OSMOZA

A. Studiul influen]ei unor factori fizici asupra ratei difuziunii

A1. Definirea [i explicarea fenomenelor de agita]ie termic\, difuziune [i osmoz\ A2. Legile osmozei. Solu]ii false [i solu]ii adev\rate A3. Osmolalitate [i osmolaritate. Calculul presiunii osmotice A4. Aplica]ii medicale

B. Metoda celor dou\ micrometre pentru m\surarea dimensiunilor celulare

B1. Microscopul optic B2. Micrometrul ocular [i micrometrul obiectiv

C. Evaluarea cantitativ\ a fenomenului de osmoz\

C1. Osmoza la celulele vegetale C2. Osmoza la nivelul hematiei

D. Exerci]ii [i ntreb\ri La nivelul membranelor naturale se petrec schimburi de substan]\ f\r\ de care celulele vii nu ar putea supravie]ui. Acestea implic\ fenomene de transport ale solventului sau/[i ale solvi]ilor intra- [i extracelulari. Lucrarea de fa]\ v\ permite s\ observa]i [i s\ `n]elege]i fenomenul de transport membranar al solventului, osmoza, utiliznd drept modele de studiu c e l u l a v e g e t a l \ [i h e m a t i a , comparativ. Ca urmare a transportului transmembranar de ap\ (solventul uzual al solu]iilor biologice), celulele `[i modific\ dimensiunile. Pentru a observa aceste modific\ri de ordin microscopic vom utiliza m i c r o s c o p u l o p t i c , iar pentru a le evalua cantitativ, vom ata[a acestuia dou\ micrometre, utiliznd m e t o d a c e l o r d o u \ micrometre.

LUCRARE PRACTIC|

a) Materiale necesare : 3 eprubete cu agar solu]ii 5 mM de : metil orange bicromat de potasiu sulfat de cupru

PARTEA PRACTIC|

Difuziunea poate fi influen]at\ de greutatea molecu-lar\ [i de concentra]ia moleculelor. a ) Efectul greut\]ii moleculare Mod de lucru: 1. Lua]i trei eprubete con]innd deja o coloan\ de agar (10 ml gel polizaharidic, `n stare semifluid\).

Substan]a Metil orange Bicromat de potasiu Sulfat de cupru

Distan]a (timp: 2 ore)

2. Ad\uga]i 3 ml din solu]iile de aceea[i concentra]ie a unor compu[i colora]i, cu masa molecular\ diferit\ (prezentate al\turat). 3. Nota]i nivelul la care se g\se[te limita de separa]ie a celor dou\ medii, pentru fiecare eprubet\. 4. La sfr[itul orelor de lucr\ri practice: nota]i nivelul la care a ajuns solu]ia colorat\ [i m\sura]i distan]a pe care a difuzat.

Tabel de rezultate

Nota]i datele `n tabelul de rezultate. b) Materiale necesare: 3 eprubete cu agar solu]ii de metil orange de b)Efectul gradientului de concentra]ii : concen-tra]ie 1 mmol, 5 mmol, 10 mmol Mod de lucru: sol. metil Distan]a 1. Lua]i alte trei eprubete cu agar. orange (timp: 2 ore) 1 mmol 2. Ad\uga]i `n fiecare eprubet\ 3 ml din solu]ia aceluia[i 5 mmol compus (metil orange) dar de concentra]ii diferite. 10 mmol Tabel de rezultate 3. 3. Realiza]i acelea[i m\sur\tori ca [i la punctul a) [i nota]i rezultatele `n tabelul de rezultate.

LUCRARE PRACTIC|

B. Metoda celor dou\ micrometre pentru m\surarea dimensiunilor celulare

Participarea fenomenului de osmoz\ la schimbul de substan]\ dintre celul\ [i mediul `nconjur\tor poate fi observat\ prin experien]e simple, utiliznd microscopul optic. Descrierea microscopului optic Microscopul optic obi[nuit (fig. 4) este un sistem de lentile convergente astfel realizat `nct s\ poat\ fi folosit pentru observarea unor structuri cu dimensiuni `n general de ordinul micrometrilor (10-6 m) format din: Partea optic\ optic\, care se compune dintr-un sistem de iluminare [i dou\ sisteme de lentile convergente: obiectivul cu distan]\ focal\ de c]iva milimetri [i ocularul, cu distan]\ focal\ de ordinul centimetrilor. Sistemul obiectiv este alc\tuit dintr-un sistem centrat de lentile a[ezate `ntr-o anumit\ ordine `ntr-un tub metalic montat direct sau prin intermediul sistemului revolver la partea inferioar\ a tubului microscopului. Obiectivele au notat\ puterea m\ritoare care variaz\ `ntre x10 [i x90. Sistemul ocular este alc\tuit dintr-un sistem de lentile situate la partea superioar\ a tubului microscopului. Puterea m\ritoare a ocularelor care variaz\ `ntre x5 [i x15. Exist\ microscoape monoculare [i binoculare (cu dou\ oculare).

surs\ de lumin\

lentil\ condensor preparat lentil\ obiectiv

lentil\ ocular imagine a) Mersul razelor de lumin\ la microscop Fig. 4 (a, b) Microscopul optic - schem\ b) Este reprezentat\ schematic alc\tuirea [i formarea imaginii n microscop: Oc = ocular; Ob = obiective; R = sistem revolver; Mv = macroviza; mv = microviza; c = condensor; d = diafragm\; l = surs\ de lumin\ (poate fi plasat\ [i la exterior, `n fa]a microscopului).

Oc

R Ob Pl
Mv mv c, d l 3

LUCRARE PRACTIC|

obiectiv

u
?

mediu cu indice n

preparat lam\
Fig. 4

lamel\

Sistemul de iluminare serve[te pentru a aduce la obiectul examinat lumina de la o surs\ natural\ sau artificial\. Este situat sub platina microscopului [i se compune din surs\ de lumin\ (natural\ sau, de obicei, artificial\ - bec electric), oglind\, diafragm [i condensor. Unele microscoape au un sistem de iluminare cu bec situat `n piciorul microscopului [i oglinda deta[abil\. Partea mecanic\ serve[te la sus]inerea p\r]ii optice [i a obiectului examinat. Ea se compune din picior, coloan\, platin\ [i un dispozitiv de punere la punct format din [urubul macrometric [i cel micrometric. Puterea m\ m \ ritoare a microscopului este dat\ de produsul dintre puterea m\ritoare a obiectivului [i cea a ocularului. Microscoapele optice actuale ating o putere m\ritoare de x2000.

(c) Microscopul optic detaliu la nivelul obiectivului (d) Imagine de ansamblu

Principalele m\rimi caracteristice unui microscop optic:

Puterea de rezolu]ie (sau separatoare) rezolu]i e separatoare reprezint\ calitatea cea mai important\ a unui microscop. Ea reprezint\ capacitatea unui sistem optic de a separa dou\ puncte apropiate (al\turate) astfel `nct aceste puncte s\ fie percepute distinct la nivelul imaginii finale. Prin termenul general de rezolu]ie se `n]elege abilitatea unui sistem optic de a detecta detaliile unui obiect. Puterea de rezolu]ie este invers propor]ional\ propor]ional \ cu distan]a minim\ minim \ ( ) `ntre dou\ dou \ puncte luminoase luminoa se ale obiectului, percepute separat. Prin urmare, dac\ se noteaz\ puterea de rezolu]ie cu P, rezult\ c\ . Cu ct este mai mic cu att puterea de rezolu]ie P este mai mare. Distan]a minim\ , denumit\ [i distan]\ distan] \ minim\ minim \ rezolutiv\ rezolutiv \ sau minimum separabil este dat\ de formula lui Abb: Abb
P= 1

Puterea de rezolu]ie a microscopului este limitat\ de distan]\ minim\ . Astfel, `n cazul microscopului optic este de 0,38 m. La valori mai mici ale acestuia apar fenomene de difrac]ie [i, deci, nu mai este posibil\ formarea unei imagini clare.

=
unde:

1,22 2n sin u

= lungimea de und\ a luminii utilizate la microscop n = indicele de refrac]ie al mediului (aer) prin care trece lumina (dintre obiectiv [i lama din sticl\ pe care se afl\ preparatul care este observat la microscop)
4

LUCRARE PRACTIC|

~n condi]iile actuale, pentru examenul `n lumina alb\, jum\tatea unghiului de deschidere maxim al unui obiectiv neputnd dep\[i 71, distan]a minim\ dintre dou\ puncte care pot fi v\zute separat este de 0,38 m.

Din formula lui Abb se poate observa c\ puterea de rezolu]ie se poate m\ri prin utilizarea unei surse cu ct mai mic, ca `n cazul microscopului cu radia]ii ultraviolete [i, `ndeosebi, `n cazul microscopului electronic (v. [i curs).

u = jum\tatea unghiului de deschidere a conului luminos ce cade pe obiectiv (v. fig. 4c). Se observ\ c\ este cu att mai mic (iar rezolu]ia este mai mare) cu ct n [i u sunt mai mari. M\rimea n X sinu se nume[te apertur\ apertur \ nume nu meri me ric ri c \ [i poate fi m\rit\ `n dou\ moduri: 1. M\rind indicele de refrac]ie al mediului existent `ntre obiectiv [i lama ce con]ine preparatul; astfel, obiectivele sunt de dou\ feluri: uscate [i umede (cu imersie), dup\ cum `ntre ele [i lamel\ exist\ aer (n = 1) sau un mediu cu indicele de refrac]ie mai mare dect 1 (ex: ulei de cedru, n = 1,52). 2. M\rind unghiul u, prin construc]ie (obiective cu distan]a focal\ foarte mic\, care s\ poat\ fi apropiate foarte mult de preparat). Puterea separatoare a unui microscop optic este, deci, limitat\ de lungimea de und\ a radia]iei utilizate (vizibil, 390 720 nm), de indicele de refrac]ie al mediului (care nu poate dep\[i 1,5) [i de construc]ia obiectivului, care impune o valoare maxim\ a unghiului u. Puterea de m\ m\rire (P) este m\rimea numeric egal\ cu raportul dintre unghiul u sub care se vede imaginea la microscop [i m\rimea obiectului AB. u' P= AB Puterea de m\rire se exprim\ `n dioptrii [i este invers propor]ional\ cu distan]ele focale ale obiectivului [i ocularului. Puterea de p\ p\trundere este o calitate ce apar]ine obiectivelor cu putere de m\rire mic\. Datorit\ acestei calit\]i se poate vedea `n profunzimea obiectului examinat. Ea variaz\ `n raport invers cu m\rimea unghiului de deschidere a obiectivului.

A B

etin\ retin \

Fig. 5 Formarea imaginii la microscop

LUCRARE PRACTIC|

Ansamblul metodelor cu ajutorul c\rora se pot m\sura dimensiunile obiectelor microscopice se nume[te micro microme crometrie. metrie. Materiale necesare: necesare micrometru ocular micrometru obiectiv microscop optic

PARTEA PRACTIC|

Principiul metodei Se suprapune imaginea microscopic\ a obiectului de m\surat peste imaginea unei sc\ri gradate etalonat\ `n prealabil. Se utilizeaz\ dou\ tipuri de micrometre (fig. 6): ocular [i obiectiv. Micrometrul obiectiv este o lam\ de sticl\ pe care sunt marcate diviziuni echidistante cu valoare cunoscut\ de 10m. El serve[te la etalonarea micro microme crometru metrului trului ocular; ocular acesta este un disc de sticl\ introdus `n sistemul ocular [i la rndul lui are marcate diviziuni echidistante (sub form\ de re]ea). Imaginea lui este dat\ numai de lentila ocular, `n timp ce micrometrul obiectiv este m\rit de `ntreaga putere m\ri-toare a microscopului. A etalona micrometrul ocular `nseamn\ a stabili o coresponden]\ `ntre o diviziune a micrometrului ocular [i un anumit num\r de diviziuni ale micrometrului obiectiv. ~n acest fel, diviziunile micrometrului ocular pot fi exprimate `n unit\]i de lungime. Mod de lucru:

1) Se a[eaz\ pe platina microscopului lama micrometru obiectiv (cu scala `n sus). Aceasta se fixeaz\ cu ajutorul celor doi cavaleri. 2) Realiza]i acum imaginea la microscop: se aduce `n axul microscopului obiectivul x10 prin rotirea sistemului revolver. Privind din lateral, se rote[te viza macrometric\ spre `nainte [i se coboar\ tubul microscopic pn\ ce obiectivul se apropie de preparat. Viza macrometric\ se mic\ foarte `ncet. Apoi, privind prin ocular, cu ajutorul aceluia[i [urub macrometric, rotit `n sens invers, se ridic\ `ncet tubul pn\ ce apare imaginea `n cmpul microscopului. ~n continuare se procedeaz\ la completarea punerii la punct a imaginii cu ajutorul [urubului micrometric care va fi mi[cat `n ambele sensuri. Se recomand\ ca `ntotdeauna cnd examina]i un preparat la microscop s\ ]ine]i permanent mna pe [urubul micrometric. Folosind obiectivul x10 se formeaz\ imaginea diviziunilor micrometrului obiectiv.

Micrometrul ocular (cu p\trate) [i micrometrul obiectiv

10 20 30

Fig. 6

LUCRARE PRACTIC|

PARTEA PRACTIC|

Celule vegetale `n mediul hiperton

Fig. 10

a) Osmoza la alga Vallisneria spiralis Utiliznd microscopul optic, ve]i observa modific\rile unor celule vegetale ( alga Vallisneria spiralis) puse `n medii izoosmotice, hipoosmotice [i hiperosmotice. Cele mai evidente modific\ri apar `n privin]a volumului [i formei celulare. Pentru a le observa ave]i nevoie de a m\sura dimensiunile unei celule prin metoda descris\ anterior, micrometria. Mod de lucru:

Materiale necesare: microscop binocular lame [i lamele de sticl\ 3 vase Petri solu]ii cu osmolarit\]i diferite : - NaCl 9 g/l (mediu "izoton") - NaCl 20 g/l (mediu "hiperton") - ap\ distilat\ (mediu "hipoton") pipete Pasteur 3 frunze (segmente de 2-3 cm) de Valisneria spiralis lam\ pentru sec]ionarea frunzelor [i realizarea preparatului microscopic

1) Se pun `n cele 3 vase Petri respectiv cca 20 ml mediu hipoton, mediu izoton [i mediu hiperton [i `n fiecare cteva frunzuli]e de plant\. 2) Se las\ astfel 20 minute dup\ care se examineaz\ la microscop cte o frunz\ din fiecare mediu. Pentru a fi examinat\ la microscop, frunza, a[ezat\ pe lama de sticl\, se sec]ioneaz\ `n grosime (tangen]ial, cu o lam\ de ras pentru a ob]ine un fragment ct mai transparent). Se a[eaz\ fragmentul de frunz\ pe lama de sticl\, apoi se a[eaz\ pe platina microscopului `n a[a fel `nct frunza s\ se afle `n dreptul orificiului central al platinei. Se folose[te obiectivul x10. 3) Se rote[te dispozitivul revolver [i se formeaz\ imaginea cu obiectivul x20, care a fost folosit [i pentru etalonarea micrometrului ocular. 4) Se m\soar\ diametrul longitudinal [i transversal pentru un num\r de 10 celule; datele se trec n tabel, `n care: I = mediu izo- osmotic; II = mediu hipoosmotic; III = mediu hiperosmotic; L = diametru longitudinal; T = diametru transversal m = media aritmetic\ b) Osmoza la hematii Pentru a pune `n eviden]\ fenomenul de osmoz\ la nivelul biomembranelor, se poate realiza un experiment asem\n\tor, dar de data aceasta utiliznd eritrocitele;
7

LUCRARE PRACTIC|

I L T 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 m

II

III

acestea reprezint\ un model de studiu deosebit de accesibil `n raport cu alte celule animale. ~n plus aceast\ alegere este dictat\ [i de frecventa varia]ie a volumului celular, ca urmare a varia]iei presiunii osmotice, intra sau extraeritrocitar, `n raport cu o larg\ categorie de st\ri, fiziologice sau patologice, ale organismului (de exemplu simpla manevr\ de injectare intravenoas\ a unor solu]ii hipo- sau hiperosmolare poate avea un astfel de efect). Mod de lucru:

Ve]i observa dimensiunea transversal\ ("diametrul") celulelor. Se va lucra cu 5 recipiente: `n A ave]i o suspensie de eritrocite `n mediu izoosmotic lor (NaCl 9 g/l); `n B [i B1 ave]i solu]ii hipoosmotice de concentra]ii diferite (NaCl 3 g/l [i respectiv 6 g/l); `n C ave]i solu]ie izoosmotic\ (NaCl 9 g/l); `n D ave]i solu]ie hiperosmotic\ (NaCl 40 g/l).
tabel de rezultate

1) Pune]i cu o pipeta Pasteur cte 1 ml suspensie din recipientul A `n fiecare dintre recipientele B, C, D. 2) ~n continuare, la anumite intervale de timp (precizate `n tabel), ve]i lua cte o pic\tur\ din con]inutul recipientelor B, C [i D [i o ve]i examina la microscop. Ve]i remarca c\ celulele puse `n C (mediu izoosmotic) nu-[i modific\ dimensiunile. Celulele puse `n D (mediu hiper-osmotic) se ratatineaz\ (`[i mic[oreaz\ diametrele [i cap\t\ un aspect crenelat). Celulele puse `n B1 [i scoase dup\ primul interval de timp sunt turgescente (au diametrele m\rite) iar cele puse `n B sunt par]ial sau total distruse (fenomenul de hemoliz\).

pentru B pentru B1 pentru C pentru D

35 minute 35 minute 20 minute 30 minute

intervale de timp

Descrie]i ce observa]i.

LUCRARE PRACTIC|

t
~n organism, presiunea exercitat\ prin intermediul pistonului (`n fig.11) este `nlocuit\ de presiunea creat\ de pompa cardiac\ care men]ine o presiune hidrostatic\ superioar\ presiunii oncotice (presiunea oncotic\ poate fi definit\ ca fiind presiunea osmotic\ determinat\ doar de macromolecule, `n cazul `n care membrana este permeabil\ att la ap\ ct [i la molecule mici) la nivelul capilarelor glomerului renal. Aceasta determin\ un flux net de ap\ ([i microelemente) din plasm\ spre exteriorul capilarului (spa]iul Bowman), fenomen de ultrafilatrare plasmatic\ (primul satdiu `n formarea urinii). Este u[or de `n]eles de ce, `n caz de hipotensiune arterial\ marcat\, presiunea hidrostatic\ din capilarele glomerulare devine inferioar\ presiunii oncotice [i ultrafiltrarea renal\ se opre[te, clinic aprnd anuria.

a)

b)

a) Fenomenul de osmoz\; b) Fenomenul de osmoz\ invers\ Explica]ii n text.

Fig. 11

LUCRARE PRACTIC|

D. Exerci]ii [i ntreb\ri:
1. Un subiect de 60 kg prezint\ urm\toarele caracteristici: - masa lichidelor extracelulare = 20 % din masa corpului - masa lichidelor intracelulare = 50 % din masa corpului Ionograma a permis evaluarea presiunii osmotice a plasmei: 280 mOsmoli/l. a. Aceste cifre sunt normale? b. Calcula]i presiunea osmotic\ n fiecare compartiment. c. S\ consider\m c\ subiectul prime[te o perfuzie de NaCl intravenoas\ de 36,27 g n 2 litri de ap\. n care sens se vor face deplas\rile de ap\ [i ce volum de ap\ va trece dintr-un compartiment n altul, presupunnd c\ membrana care separ\ cele 2 compartimente este impermeabil\ la ioni [i c\ subiectul nu elimin\ nici o cantitate de ap\. Care va fi presiunea osmotic\ a plasmei la echilibru? ( Se dau : Na+ = 23; Cl- = 35.5) 2. Se utilizeaz\ un epiteliu simplu asimilabil unei membrane biologice pentru a realiza un osmometru. 2 Presiunea limit\ de ruptur\ a acestei membrane este de 1,013 x 105 N/m . Ce se ntmpl\ dac\ una dintre fe]ele membranei fiind n contact cu apa pur\, cealalt\ este introdus\ n: a. solu]ie de NaCl 4 g/l b. solu]ie de uree 10 g/l c. solu]ie de NaCl 1 g/l Se dau: T = 27 C R = 8,32 joule/mol/Kelvin 2 g = 9,8 m/s 3. Calcula]i puterea rezolutiv\ limit\ n cazul unei surse de lumin\ verde ( = 520 nm) la un microscop cu imersie bun\ (apertura numeric\ = 1,6). Cum este rezolu]ia n compara]ie cu a unui microscop cu apertura numeric\ = 0,65 [i lumin\ alb\ (0,55 x 10 6m)? 4. Lichidele fiziologice, din corpul uman, con]in mai mult\ sare dect apa dulce (din ruri) [i mai pu]in\ sare dect apa de mare. De ce n realitate nu se produce efectul din figura 10?

a) Ap\ de mare, b) Ap\ dulce (ru)

a) b)

Fig. 12

10