Universidad Nacional Hermilio Valdizn

PREGRADO-2007

DETERMINACIN PRECISA DEL MOMENTO DE LA OVULACIN

DR. Jos Goicochea Vargas

IMPORTANCIA
- Permite

un ptimo manejo reproductivo

Dificultades clnicas

La correlacin entre los cambios fsicos y de comportamiento durante el estro y el tiempo de ovulacin es pobre.

RECORDAR LA ENDOCRINOLOGA DE LA OVULACIN

-

La cc. de E2

en el proestro tardo.

Estimula el pico de LH y la ovulacin .

La cc. de LH en suero, de 7 a 50 ng/ml, dura 24 a 40 horas antes de retornar a niveles bsales.

- La ovulacin ocurre 2.0 +/- 0.1 das despus del pico de LH

-

La cc. P4, desde niveles bsales coincide con el descenso de la cc. del E2 y el pico de LH.

La P4 en el da del pico de LH, aprox. 2 das antes de la ovulacin, es de 2.0 a 2.9 ng/ml.
La P4, en el da de la ovulacin es de 4 a 10 ng/ml. La E2 y el P4 , marca el comienzo del comportamiento de estro. Una perra ovula 2 das antes, hasta 6 das despus del comienzo del comportamiento de estro.

- Estro: 50% de estas clulas epiteliales aparentemente son anucleadas.

-

06 das despus de la ovulacin (8.0 +/- 0.3 das despus del pico de LH), la perra entra en diestro citolgico- epitelio no-cornificado.

Acontecimientos y correlaciones clnicas durante el proestro y Estro con relacin a los das del pico preovulatorio de LH.

RESUMEN DE ALGUNOS ASPECTOS CLNICOS Y PARACLINICOS DEL PROESTRO Y ESTRO DE LA PERRA Proestro endocrino
Alza LH

Estro endocrino
Alza LH
Maduracin de ovocitos

Periodo de fertilidad Potencial

Periodo mximo de fertilidad Periodo de fertilizacin

Progesterona < 1 ng/ml

Incremento de la turgencia vulvar Incremento del edema vaginal

Aumento progresivo de P4
Vulva blanda

Vagina arrugada
Cel. Sperf. Poli. - cornificadas

GR.Cel. (PyG) en aumento

Das del peak ovulatorio de LH

Modificado de Concannon, et al 2002

El Perodo de fertilizacin

Cuando los oocitos viables ( maduros) es decir como oocitos secundarios

para ser fertilizados por los espermatozoides.

Das

LH
0

El Perodo frtil

El perodo frtil es el tiempo durante el cual un servicio una IA puede dar lugar una preez.

-2 a-3

LH

das

Tabla 1. Sincronizacin de los perodos de fertilidad, de la maduracin de los oocitos, y de la

fertilizacin de los oocitos con espermatozoides previamente depositados en relacin al da del pico de LH y al da de la ovulacin en la perra domstica.

Perodo
Perodo de fertilidad potencial, el "Perodo Fertil" Perodo de fertilidad reducida con apareamientos tempranos Perodo de mxima fertilidad dentro del perodo frtil en perras con alta fertilidad (monta natural) Momento preferido dentro del "Perodo Frtil" para monta programado por servicio natural IA con semen fresco Momento de maduracin del oocito (estimado) El "Perodo de Fertilizacin" - perodo de fertilizacin potencial de oocitos maduros Momento dentro del "Perodo de Fertilizacin" para el manejo crtico del servicio inseminacin artificial con semen congelado

Das desde el Pico de LH

Das desde la Ovulacin

-

-3 a +7 ( ms) -3 a -1 0 a +6

5 a +5 ( ms) -5 a -3 -2 a +4 0 a +4 +2 a +3

+2 a +6 + 4 a +5 +4 a +6, ms

+2 a +4, ms +2 a +4 +5 a + 7, y ms

+ 4 a +6

Perodo de reducida fertilidad con servicios inseminaciones en estro tardo

+7 a +9, y ms

Momento de ovulacin en las perras

I.- Cambios de comportamiento y fsicos II.- Cambios en el fluido vaginal III.- Cambios en el epitelio IV.- Cambios ecogrficos V.- Cambios Hormonales.

I.- Comportamiento o cambios fsicos en las perras

Ovulacin : 2 das antes hasta 6 das despus del comienzo del celo ( Bouchard et al.,1991)

Es posible que las perras dominantes nunca exhiban celo, y las perras sumisas pueden permitir las montas cuando no estn en estro

Los cambios fsicos: disminuida turbidez vulvar al comienzo del estro, disminuido del ancho vulvar en el momento del peak de LH Cambios en el color de la descarga vaginal : serosanguinolenta a color pajizo al comienzo del celo
(Hewitt et al.,2000)

comportamiento y los cambios fsicos: en las perras durante el estro son variables, y pobremente correlacionadas con la
ovulacin (Root,K. 2001)

II.- Cambios en el fluido vaginal

cc de P4 del fluido vaginal - cc.P4 srica, la correlacin es pobre (Schulz et al., 2000) pH del fluido vaginal se encuentra disminuido al comienzo del estro Resistencia elctrica de las secreciones vaginales

CC. de glucosa en el fluido vaginal , incrementan al momento del comienzo del estro, pero la utilidad clnica de estos cambios es limitada (Holst
,2001)

La arborizacin (helecho) del fluido vaginal, es mxima 2.3 +/- 1.2 das despus del pico de LH. Servicios a tiempo fijo (10 y 12 das despus del comienzo del estro) 60% - 78% de fertlidad Servicio en el momento mximo de arborizacin del fluido vaginal, tasa de gestacin del 92% ( England , G.,1992)

III.- Cambios en el Epitelio

A.- Citologa vaginal
APLICACIONES CLNICAS DE LA CITOLOGA VAGINAL Fisiologa reproductiva Deteccin de problemas reproductivos
(analizaremos en infertilidad de la perra)

1.- ASESORAMIENTO CON RESPECTO AL MOMENTO DE LOS SERVICIOS:

El Perodo de mxima fertilidad coincide con:

80% de clulas superficiales queratinizadas (CSQ) - servicios cada 48- 72 horas

Aparear todo el tiempo que persista este

cuadro citolgico (80% CSQ)

Es recomendable realizar un mnimo de 2-3 frotis en un lapso de 4-7 das. (80% CSQ)

Recomendaciones

La hembra deber presentarse para el servicio. Si la cpula no ocurre en 1-2 das deber obtenerse un segundo frotis. Si este frotis no sugiere diestro debera intentarse otro apareamiento o I.A. .

Cambios de importancia en la citologa vaginal con respecto a la ovulacin

La cornificacin vaginal aumenta gradualmente en el proestro.

La cornificacin completa generalmente ocurre antes del peak de LH (Mestre et al.,1990) El estro citolgico se define, como la cornificacin completa con ms del 50% de las clulas anucleadas.

Hay una pobre correlacin entre el comienzo del estro citolgico y la ovulacin

El comienzo del diestro citolgico, ocurre 6 das despus de la ovulacin (Holst et al., 1975), ayuda a determinar el da de la ovulacin . La vaginoscopa puede diferenciar :

Proestro

: mucosa vaginal edematosa, acolchonada, rosada

Estro : Mucosa

vaginal deshidratada de bordes cortantes y plida de ( Hewitt et al.,2000) .

La correlacin entre el comienzo del estro y la ovulacin es variable

Tinciones para citologa vaginal:

La seleccin de la tincin a emplear depende si sta se desea realizar para un diagnstico rpido en el consultorio o no

Monocromicas
Dicromicas
DIFF-QUIK

Giensa , Azul de metilerno, Wright

tricromicas

Harris-schorr, Wright Giemsa modificada (Harleco Diff-Quik )

Tincin Monocromica Giensa

Toma de muestra

Realizar el extendido

Sumergir en Metanol

Cubrir con Giensa

Observacin 100 x y 400 x.

Introduccin correcta de la trula para toma de muestra vaginal

Tincin Dicromica DIFF-QUIK

Metanol-Eosina-Azul de metileno

Wright Giemsa modificada (Harleco Diff-Quik )

La secuencia incluye 5 a 10 inmersiones de un-segundo cada una, en fijador, colorante naranja, colorante azul y aclaracin en agua.

TINCIN 15

Solucin 1 ( Xantenicos ) Solucin 2 ( Tiazinicos ) Fijador ( colorantes disueltos en alcohol metilico etanol)

5 inmersiones de 1 seg. c/u- fijador Papel absorbente escurrir 5 inmersiones de 1 seg. c/u- Sol. 1 Papel absorbente escurrir 5 inmersiones de 1 seg. c/u- Sol. 2 Papel absorbente escurrir Lavado con agua de cao 10 seg. Dejar secar en el aire en posicin vertical

Tincin Tricromica de HARRISSCHORR:

Sumergir 10 veces en alcohol /70 Sumergir 10 veces en alcohol/ 50 Agua destilada / 1 vez Sumergir en hematoxilina de Harris / 2 min. Sumergir en agua destilada/ 2 veces Sumergir en NH3/ 1 vez Agua destilada /1 vez Alcohol 70 /10 veces Alcohol 90 /10 veces Solucin de Schorr/ 2 min. Alcohol 90 /10 veces Observar al microscopio

Desventaja muchos pasos

SHORR simplificada (Diagnoestrus RAL)

El kit se presenta en dos cajas separadas: Caja A que contiene los reactivos de coloracin. Caja B con los componentes de lavado. Constituye el producto idneo para el seguimiento de la queratinizacin de la clulas epiteliales superficiales por una progresiva eosinofilia.

Ventaja de las tinciones tricromicas

La coloracin roja de las clulas con tincin tricromica indica que todas estas se encuentran cornificadas, teniendo un ndice eosinfilo de 100%.

A.-Caractersticas de las clulas epiteliales:

Observacin de la morfologa, tamao y forma del ncleo y citoplasma. ( Snchez,1998).

Tamao celular: incrementa mientras mas superficial es la clula. Tamao e integridad del ncleo : Es mayor en las clulas de los estratos mas profundos. Forma : Las clulas mas superficiales pierden su forma redondeadas para hacerse ovaladas y finalmente poligonales.

Las clulas del epitelio vaginal de la perra se clasifica de la siguiente manera:

1.-Clulas parabasales

( 10 a 20 mcm). Son las mas pequeas y compactas del epitelio vaginal , de forma redonda o ligeramente ovaladas con ncleo vesicular grande y definido y con citoplasma relativamente escaso.

Celulas parabasales

2.-Intermedias :

- pequeas ( 20 a 35mcm). Redondas a

ovaladas, ncleo redondo integro y central con un aumento relativo del citoplasma. - Intermedias grandes ( 40 a 75 mcm.) forma ovalada a poligonal , con ncleo pequeo y abundante citoplasma.

3.- Clulas superficiales ( 40 a 75 mcm.) forma irregular, bordes rectos , aspecto anguloso ( a veces con bordes plegados). Ncleo pequeo por lo general picntico.

4.- Clulas superficiales anucleadas ( 60 a 80 mcm.) Son de forma poligonal y muchas veces con fondo plegados. Tambin se le denominan placas o escamas

Otros tipos de clulas encontradas en la citologa vaginal

Neutrofilos abundantes durante diestrus temprano, y no son infrecuentes en otras etapas, aunque raras durante estro. No indicativos de vaginitis. Bacterias pueden verse en gran cantidad, cubriendo las clulas o esparciadas en los espacios

CLULAS ESPUMOSAS: Son clulas parabasales que contienen vacuolas citoplasmticas. Su significado se desconoce.

CLULAS EPITELIALES CONTENIENDO MELANINA:

Se ha observado en frotis vaginales de perras normales de coloracin de piel oscura, como por ejemplo Labrador Retrievers. No deben confundirse con clulas de melanoma.
CLULAS DE LA FOSA DEL CLTORIS: Son clulas queratinizadas, anucleadas y fusiformes

Proestro

Clulas intermedias (grandes y pequeas) estan presentes en todas las fases del ciclo excepto en el Estro

Estro

Clulas superficiales, poligonales-cornificadas

Estro temprano
(Diff-Quik)

Diestro

8 - 9 das despus del pico de LH Final del estro y comienzo del diestro

4 das del diestro

Anestro

Clulas parabasales e intermedias (Thrall y Olson, 1989). Raras en el proestro temprano

Tabla 3. clulas observadas en la citologa vaginal en diversos estados fisiolgicos y patolgicos

CPB
Anestro +

CI
+

CS
-

GR
-

GB
+

BA
-

DE
-

MU
+/-

ESP
-

Proestro temprano
Proestro tardo Estro Estro silente Diestro Preez

+
+ +

+
+

+ + + -

+
+

+/+ +

+/+ +

+/+/+/+/-

+/+/+/-

+/+/+/-

+/+/+ +

+/+/-

Tumor de granulosas
Endometritis

cl.

+ + +

+ + +

+
+ -

+
+ +

+
+ +

+
+ +

+ + +

Pimetra cerrada Pimetra abierta

+/+

+/-

CPB= Clulas parabasales; CI= Clulas intermedias; CS= Clulas superficiales; GR= Glbulos rojos; GB= Glbulos blancos; BA= Bacterias; DE= Detritus; MU= Mucus: ESP= Espermatozoides

B.- Vaginoscopa

La vaginoscopa, diferencia entre la mucosa vaginal edematosa, acolchonada, rosada de proestro de la

Mucosa vaginal deshidratada de bordes cortantes y plida de estro ( Hewitt et al.,2000)

La correlacin entre el comienzo del estro y la ovulacin es variable

Endoscopia

Equipo de vaginoscopa canina

hiperplasia inducida por los estrgenos

3 a 4 das despus del pico de LH

9 das despus del pico de LH

C.- Cambios Ecogrficos

Figura 1. Ultrasonograma trans-abdominal de una perra que muestra un ovario con tres folculos anecoicos, grandes 1 da antes de la ovulacin. Las flechas blancas indican el folculo de 6 mm de dimetro a la izquierda. Figura 2. Ultrasonograma trans-abdominal de una perra que muestra un ovario 1 da despus de la ovulacin, sin la evidencia de estructuras anecoicas esfricas distintivas presentes 1 a 2 das antes.

V.- Cambios Hormonales

A.- Determinacin LH

Es el mtodo ms exacto para determinar la fecha de ovulacin. El pico de LH dura alrededor de 24 h.; por lo que el monitoreo debe ser diario a partir de un ndice eosinofilico de 80. 48 horas antes de la ovulacin, la CC. de LH aumenta hasta 40 veces su valor basal. Se emplean kits de ELISA para su determinacin. No es muy utilizado por su costo

1.- Ensayo Cualitativo (StatusLH, Synbiotics, San Diego CA).

Se guarda a temperatura ambiente y tiene un duracin relativamente corta.

No es exacto si es utilizado ms all de la fecha de vencimiento, o si el paquete metalizado se expone demasiado tiempo en el medio ambiente.
La muestra preferida es suero. La muestra no debe ser lipmica ni hemolizada. Se utiliza el suero fresco o refrigerado, pero no congelado.

Figura 1. Kit Status-LH para la medicin de hormona luteinizante en suero canino (Synbiotics, San Diego CA). Figura 2. Componentes del kit Status-LH para la medicin (Synbiotics, San Diego CA). El paquete metalizado que contiene el dispositivo del kit y la pipeta no debe ser abierto sino hasta momentos antes de ejecutar la prueba. Figura 3. Resultado final de la prueba para hormona luteinizante usando el kit Status-LH (Synbiotics, San Diego CA). La lnea rosada es el control, indicando que el test est terminado y fue ejecutado correctamente. La ausencia de una lnea rosada similar debajo de l marcador control, al lado de la letra T en el dispositivo del kit, es indicativa de una concentracin de LH en la muestra de menos de 1 ng/ml.

2.- El ensayo semi-cuantitativo (ELISA-LH)

Para determinar el peak de LH da un resultado de menos de 1 ng/ml y mayor a 1 ng/ml. La prueba de ELISA ha mostrado dar resultados consistentes con un s preciso RIA ( Nishiyama, 1999) Debido a que la duracin del pico de LH (24horas) promedio aprox. es un da las muestras se deben tomar diariamente, aprox. a la misma hora. El fabricante recomienda verificar con la medicin de P4

la vida corta del kit, la necesidad de pruebas diarias, y el requisito de evaluar P4, para verificar la exactitud, no es recomendable utilizar este ensayo en la prctica

B.- Determinacin de P4
Tabla 2. Esquema clnico para la prediccin de la ovulacin en la perra con ensayo de cc. de P4, srica usando mtodos cuantitativos y semicuantitativos. Tipo de ensayo de P4, usado
Ensayo comercial (radioinmunoensayo [RIA] o quimioluminiscencia) -

Manejo clnico para momento de ovulacin

La sangre debe tomarse para medicin de la cc. de P4 , en principio cuando la perra tiene cerca de 70% de las clulas epiteliales vaginales cornificadas. Las muestras se toman y re-evalan cada 3 - 4 das hasta que se alcanza la concentracin en el rango predecible (2 - 10 ng/ml; ver Tabla 1). La sangre debe tomarse para medir la cc. de P4, comenzando alrededor del 4to. da del comienzo del proestro. Las muestras se toman y evalan diariamente hasta que se alcanza una alta cc. (mayor de 4 a 10 ng/ml). El primer da que el ensayo detecta valores en el rango alto se considera como el da de ovulacin (ver Tabla 1).

1.- Resultado cuantitativo

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas [ELISA] - Resultado

2.- Semi-cuantitativo

2.- Ensayos Semi-cuantitativos :

(ELISA-P4)
- Ventaja primaria : tiempo corto de anlisis

- Los resultados pueden estar disponibles a los 20 min. despus de tomada la muestra.
- Desventajas principales : mayor trabajo y disminuida exactitud (Manothaiudom et al., 1995) - Tiempo de muestreo y los intervalos, vara con RIA u ELISA. (Tabla 2).

Tabla 1. Correlacin de la cc. de P4, srica suero con eventos reproductivos significativos en la perra. El margen de error se estim ser aproximadamente +/1 da.

P4 Srica (ng/ml)
Menos de 1.0 1.0 - 1.9 2.0 - 2.9 3.0 - 3.9

Eventos
Anestro o proestro Ovulacin menos de 3 das - se recomienda rechequeo Ovulacin menos 2 das Ovulacin menos 1 da

4.0 - 10.0
-

Da de Ovulacin
Ovulacin ms 2 das es el da ptimo para servicio Ovulacin ms 1 a 5 das

Mayor de 10.0 con epitelio vaginal cornificado

4 ensayos semi-cuantitativos para medir P4, estn disponibles comercialmente

1.- El kit K9 Proges-Check ELISA (Endocrine technologies, Inc., Newark CA).

Conservacin temperatura de refrigerador y a temperatura ambiente antes de usar.

Suero o plasma heparinizado. No hemolizadas, lipmicas, o ictricas.

El suero se puede refrigerar o congelar pero antes de ejecutar la prueba debe estar a temperatura ambiente.

Figura 4. Kit K9 Proges-Check para medicin de P4, en suero canino (Endocrine Technologies, Inc., Newark CA). Figura 5. Componentes del kit K9 Proges-Check para medicin de P4, en suero canino (Endocrine Technologies, Inc., Newark CA). El kit se ejecuta en pocillos transparentes con tres controles. Figura 6. Resultado final del test para P4, en suero canino usando el kit K9 Proges-Check para medicin de P4, en suero canino (Endocrine Technologies, Inc., Newark CA). El pocillo a la izquierda (el azul oscuro) es equivalente con 0 ng/ml de P4, el segundo pocillo (azul claro) con 2 ng/ml, y el tercer pocillo (el azul ms claro) con 10 ng/ml. La muestra desconocida, a la derecha, no contiene progesterona.

Interpretacin del El kit K9 Proges-Check ELISA

Los tres controles dan colores de :

Azul marino
= =
=

0 ng/ml de P4 2 ng/ml de P4 10 ng/ml de P4.

Azul claro
Azul ms claro

Comparacin e interpretacin con el control.

El fabricante no hace ninguna recomendacin con respecto al momento de apareamiento basndose en estas cc. Variadas

2.- Interpretacin del PreMate -ELISA

(Camelot Farms, College Station TX).

- Conservacin T de refrigerador y a T ambiente antes de usar. - Se pueden utilizar tanto suero como plasma heparinizado.

Comparacin e interpretacin:
- Los 2 controles dan color rosa oscuro al parecer indicativo de menos de 4 ng/ml de P4 ("antes de la ovulacin", segn el fabricante),

 Rosa claro al parecer indicativo de ms de 4 ng/ml de P4 ("da de ovulacin o ms tarde", segn fabricante).

Luego se compara con los controles y se lee :

"antes de la ovulacin" si el color

es ms oscuro que la muestra rosa claro.

"da de ovulacin o ms tarde" si

el color es igual a o ms claro que el control rosa claro.

Recomendaciones fabricante :
Las muestras indicativas de "antes de ovulacin" sean revisadas otra vez en 48 h Las muestras indicativas de "da de ovulacin o ms tarde" sean apareadas inmediatamente.

Figura 7. Kit PreMate-P4, en suero (Camelot Farms, College Station, TX). Figura 8. Componentes del kit PreMate para medicin de P4. La prueba se ejecuta en pocillos transparentes con dos controles. Figura 9. Resultado final del test para P4, con el kit PreMate PreMate para medicin de P4. El pocillo de la izquierda (color rosa oscuro) es equivalente a menos de 4 ng/ml de P4, y el pocillo del centro (rosa claro) a ms de 4 ng/ml de P4. La muestra desconocida, a la derecha, no contiene P4.

3.- Status-Pro - ELISA (Synbiotics, San Diego CA).

Conservacin t de refrigerador y a temperatura ambiente antes de usar. Usar preferible suero, muestras no hemolizadas o lipmicas, se puede refrigerar o congelar, antes de ejecutar la prueba debe estar a T ambiente. La prueba se realiza en una taza conteniendo tres pocillos de papel que aparecen como puntos dentro de la taza.

Interpretacin Status-Pro
- 3 puntos indica : < 2 ng/ml - 2 puntos indica : 2 a 7 ng/ml - 1 punto indica : + 7 ng/ml

Recomendaciones fabricante :

Siempre debe haber por lo menos un punto presente; como control, para confirmar el funcionamiento del kit. Aparear varias veces, cada 2 o 3 das, comenzando cuando la cc. de P4 srica alcanza la etapa de los 2 puntos" (2 a 7 ng/ml de P4). Realizar las pruebas junto con los kits de StatusLH, si se utiliza semen refrigerado o congelado.
El kit de Status-Pro est an bajo revisin.

4.- Ovulation test

Ovulation Test
Kits de 6 sets. Estabilidad: 18 meses a partir de la fecha de prod. Conservacin: 2 - 4 C Muestra: suero o plasma Sensibilidad: 89 %

4 escalas de valores: c1; por debajo de 1 ng, c2; entre 1 y 2,5 ng, c3; entre 5 y 8 ng y c4; mas de 8 ng.

Especificidad: 95 %

Precio: 82.50

Como podemos Optimizar la reproduccin en un criadero canino?

Momento del Servicio

Las hembras ovulan ovocitos inmaduros que requiere cerca de 2 das para madurar antes de que puedan ser fecundados. La tasa de gestacin se incrementa si la hembra es servida ms de una vez en el periodo frtil (Van Haaften el tal., 1989)

SERVICIO NATURAL O I.A. CON SEMEN FRESCO : 3 servicios: das 2, 4 y 6 2 servicios: das 3 y 7 1 servicio: das 5 6
I.A CON SEMEN REFRIGUERADO: 2 insem. : das 4 y 6 3 y 5 I.A CON SEMEN CONGELADO: 2 insem. : das 4 5 y 6 1 insem. : das 5 6.

CONCLUSIN

La realizacin conjunta de frotis vaginales y determinaciones de P4, con buen criterio y siguiendo un protocolo preciso permite llevar a cabo un seguimiento del celo muy satisfactorio y econmicamente rentable, que conduce a un aumento de la fertilidad y la prolificidad. Una disminucin del nmero de desplazamientos intiles para apareamientos improductivos.

Cundo sirvo a mi perra?

1) El da 11. 2) Cuando se le retira la prdida 3) Cuando la prdida se aclara 4) Cuando la perra acepta al macho

Como todo mito, estos tienen

un fundamento: son ciertos en un 60 % de las perras

No hay nada nuevo solo lo que hemos olvidado

Lord Byron

Suelen hacer falta tres semanas para preparar un discurso improvisado

MARK TWAIN