Produccin de protenas recombinantes implica la clonacin del gen apropiado en un vector de expresin bajo el control de un promotor inducible.

Sin embargo, la expresin eficaz del gen recombinante depende de una variedad de factores : las seales ptimas de expresin (tanto a nivel de la transcripcin y la traduccin) plegado de protena correcta caractersticas de crecimiento de las clulas.

Factores que influyen en el nivel de expresin: la estabilidad y la eficiencia de ARNm correcta eficiente plegamiento de la protena el uso de codones la degradacin de la protena recombinante por las proteasas dependientes de ATP la toxicidad de la protena. OBJETIVOS revisar la posible influencia de los diferentes parmetros sobre el rendimiento de protenas recombinantes

Tres secuencias de ADN involucrados en la transcripcin de los genes: (1) el promotor, (2) el terminador de la transcripcin, (3) la secuencia reguladora, y (4) la ARN polimerasa la mayora de las especies poseen genes que codifican factores mltiples s.El factor principal o de limpieza s y est implicado en la transcripcin de todos los genes necesarios para el crecimiento durante la fase vegetativa. Los factores secundarios o alternativa s y se necesitan slo bajo condiciones de crecimiento especficas

el factor s es responsable del reconocimiento del promotor -35 y el -10 la secuencia de consenso para s 70 es TTGACA - N 17 TATAAT. no hay un nico promotor presente en el E. coli En la mayora de los casos, hay una o dos desviaciones tanto en el -35 y el cuadro de -10algunos promotores contienen una cuarta regin, la UP elemento situado arriba de la caja -35. secuencia rica en AT esto aumenta la fuerza del promotor. Pero ningn terminador dar lugar a la disociacin de cada molcula de ARN polimerasa que resulta en la lectura a travs de transcripcin en el gen vecino (s) Son eficaces los dos terminadores de la transcripcin tndem T1 y T2, derivado del opern de E. coli Los represores se unen a operadores situados ya sea dentro de la regin promotora o abajo de la misma y, en la mayora de los casos, evita la unin de la polimerasa de ARN-promotor o actuar como un control de carretera. Para aliviar la represin, el represor tiene que disociarse de su operador

Activadores transcripcionales se unen arriba del promotor (UAS)Al unirse el activador aumenta la posibilidad de la ARN polimerasa se una a su promotor y activa la iniciacin de la transcripcin

Secuencias de ADN implicados en la traduccin

La regin de iniciacin de la traduccin comprende cuatro secuencias diferentes: (1) la secuencia de Shine-Dalgarno, (2) el codn de inicio, (3) de la regin espaciadora entre la secuencia de ShineDalgarno y el codn de inicio, y (4) potenciadores traduccionales.

En E. coli, el codn de iniciacin AUG ,GUG,UUG El espacio entre la secuencia Shine-Dalgarno y el codn de iniciacin vara de 5 a 13 nucletidos e influye en la eficacia de la traduccin La secuencia Shine-Dalgarno UAAGGAGG permite 3 - para la produccin de protenas el espaciamiento ptimo para UAAGGAGG ,4 a 8 nucletidos y de 5 a 7 para AAGGA la oclusin de la secuencia de Shine-Dalgarno y / o el codn de inicio por una estructura de tallo-bucle impide la accesibilidad a la subunidad ribosmica 30S e inhibe la traduccin. la mutacin de nucletidos especficos arriba o abajo de la secuencia de Shine-Dalgarno suprimi la formacin de estructuras secundarias de ARNm y mejor la eficiencia de la traduccin.

Chaperones moleculares son protenas ubicuos y altamente conservada que ayudan a otros polipptidos a alcanzar su conformacin nativa sin convertirse en parte de la estructura final. evitan reacciones de agregacin fuera de la va por los dominios hidrofbicos el plegamiento es un proceso dirigido por la secuencia de aminocidos y las condiciones del disolvente tiempo para el plegamiento puede variar desde milisegundos a das Las clulas han desarrollado un sistema de control de calidad de la protena elaborada que consiste de chaperones moleculares y proteasas dependientes de ATP que actan juntos para prevenir la agregacin, ayudar a replegamiento y degradar polipptidos mal plegadas

La agregacin de protenas se observa con frecuencia en la sntesis de protenas recombinantes en E. coli, que pueden conducir a la formacin de cuerpos de inclusin insolubles.

Degradacin proteoltica : (1) el reconocimiento (2) La translocacin (3) La protelisis

Hay dos sistemas diferentes implicados en la translocacin de protenas a travs de la membrana interna, la Sec y la ruta Tat. Ambos sistemas difieren tanto en los componentes que facilitan el paso translocacin y la conformacin de la protena sustrato. Para llegar a ser secretada por la ruta Sec, las protenas tienen que ser mantenidos en un estado de exportacin-competente (1) La protena es trasladado a travs de la membrana citoplasmtica de forma simultnea con la traduccin. (2) Las protenas que se exportan despus de la traduccin se impide que se pliegue en el citoplasma por chaperones moleculares. 3 en algunos casos la secuencia seal actua como chaperona el complejo Seca-polipptido interacta con SecYEG que forma un poro dentro de la membrana interna translocon.Seca cataliza la translocacin de la cadena de polipptido a travs del translocn est impulsado por la hidrlisis de ATP.

La expresin de pptidos en la superficie E. coli, se ha logrado por la fusin gentica de la protena heterloga con motivos de anclaje presentes en las protenas portadoras en la superficie exterior de la envoltura celular bacteriana, como las protenas de membrana externa y las partes de subunidades de fimbrias y flagelos. La protena de soporte debe suministrar toda la informacin para la translocacin eficiente y anclaje a la membrana del pptido de fusin. Flagelos bacterianos se compone de una sola subunidad estructural, flagelina, con una superficie expuesta de dominio hipervariable situado en la regin central de la protena, donde se pueden insertar pptidos heterlogos sin afectar a la estructura flagelar y la motilidad (He et al., 1994). Las notables propiedades inmunolgicas de flagelina y la posibilidad de expresar pptidos heterlogos en una forma polimrica hacen que el sistema de fusin de expresin flagelina especialmente adecuado para el desarrollo de vacunas contra microorganismos patgenos

clulas de E. coli que portan un sistema de expresin basado en l se hacen crecer hasta la fase exponencial media a baja temperatura y despus se transfirieron a alta temperatura para inducir la expresin del gen recombinante El sistema de expresin del fago T7 ARN polimerasa en el ADN de T7 los vectores de expresin contienen uno de los promotores T7 que se fusiona el gen recombinante. el gen se fusiona a un promotor inducible que permite su transcripcin y traduccin durante la fase de expresin. La ARN polimerasa de T7 se compone de una sola subunidad ejerce una capacidad de procesamiento mayor es insensible a la rifampicina. para mejorar la cantidad de protena recombinante mediante la adicin de este antibitico10 min despus de la induccin del gen que codifica la ARN polimerasa de T7 Durante ese tiempo, lo suficientemente polimerasa ha sido sintetizado para permitir la expresin de alto nivel del gen recombinante, y la inhibicin de la E. enzima coli impide una mayor expresin de todos los otros genes presentes tanto en el plsmido y el cromosoma. la lisozima enzima es una protena bifuncional que corta un enlace en la pared celular de E. coli y inhibe selectivamente la ARN polimerasa de T7 mediante la unin a la misma, un mecanismo de retroalimentacin que asegura una explosin controlada de la transcripcin durante la infeccin de T7

Estos autores tambin pudieron demostrar que los dos chaperones moleculares exhiben actividades plegables de alta protena in vitro a temperaturas de 4-12 C. Este resultado sugiere que una E. tales ingeniera cepa de E. coli puede producir grandes cantidades de protenas recombinantes correctamente plegadas a bajas Localizacin citoplasmtica o periplsmico de la protena recombinante? Hay cuatro razones para trasladar protenas recombinantes en el periplasma: (1) el ambiente oxidante facilita la formacin de enlaces disulfuro, (2) que contiene slo el 4% de la protena celular total (~ 100 protenas diferentes), (3) no se menos degradacin de la protena, y (4) la purificacin fcil mediante choque osmtico. una secuencia seal Tat.- Esta secuencia seal dirige la cadena de polipptido naciente a la va de la exportacin Esto asegura que la protena recombinante se transloca a travs de la membrana al mismo tiempo con la traduccin de la protena, previniendo as la formacin de estructuras secundarias en el citoplasma.

Factores responsables de reduccin de expresin 1-la estabilidad del ARNm 2.-aparicin de estructura secundaria cerca del extremo 5 'del ARNm, (3) rara codones y (4) dbil secuencia Shine Dalgarno. molculas de ARNm son relativamente de corta duracin con una vida media de alrededor de 2 min .Los siguientes factores estn involucrados en la degradacin de las transcripciones: exonucleasas, endonucleasas, estructuras secundarias y los sitios de unin al ribosoma. En E. coli, se han identificado dos exonucleasas, RNasa II (RNB) y polinucletidos fosforilasa Mientras que los codones AGA y AGG son codones raros en E. coli, representan con frecuencia codones utilizados en Saccharomyces cerevisiae y el Homo sapiens Codones raros cercanos al iniciador pueden estancar el ribosoma y prevenir la entrada de nuevos ribosomas entrantes

produccin de protenas recombinantes puede conducir a la formacin de agregados insolubles designados como cuerpos de inclusin grandes, esfricos separados desde el citoplasma La formacin de cuerpos de inclusin no se correlaciona con (1) el tamao del polipptido sintetizado, (2) el uso de la construccin de fusin, (3) la estructura de la subunidad y (4) la hidrofobicidad relativa de la protena recombinante. La sobreproduccin por s mismo puede ser suficiente para inducir la formacin de cuerpos de inclusin contienen varias impurezas tales como protenas del husped estrategias para prevenir la formacin de cuerpos de inclusin estn dirigidas a disminuir la produccin de protenas recombinantes e incluyen (1) los vectores de bajo nmero de copias, (2) los promotores dbiles, (3) a baja temperatura, (4) la coexpresin de chaperones moleculares, ( 5) el uso de un socio solubilizante, y (6) de fermentacin a valores de pH extremos. Crecimiento a temperaturas ms bajas facilita el plegamiento correcto un sistema de expresin que se induce especficamente a baja temperatura, y junto con las chaperonas moleculares derivadas de la bacteria del agua de mar Antrtico, puede crear un nuevo y potente sistema para obtener protenas correctamente plegadas.

el diseo de un sistema de expresin ptima para E. coli. compuesto de elementos de ADN que dirigen la transcripcin eficiente, la estabilizacin de la transcripcin, la traduccin de gran alcance, resulta en la protena recombinante autnticas y debe permanecer soluble y acumular a aproximadamente 20% de la protena celular total. Tal sistema de expresin contiene el promotor de consenso reconocida por el promotor de limpieza s70 y puede ser mejorada con la adicin de un elemento UP. La transcripcin en s se estabiliza por repeticiones invertidas presentes en ambos extremos capaces de formar estructuras de tallo-bucle ataque endonucleasa de perjudicar en el extremo 5 'y la degradacin exonucleoltica desde el extremo 3' pero no la traduccin. La traduccin eficiente est asegurada por una fuerte secuencia de Shine-Dalgarno, un codn de iniciacin situada a unos 8 pb abajo y el codn de parada de UAAU no hay sistema de expresin ptima de trabajo con todas las protenas recombinantes. Cada protena plantea un nuevo problema, y un alto nivel de sntesis tiene que ser optimizado en cada caso solo por la variacin emprica de los diferentes parmetros.

La produccin de protenas heterlogas en Escherichia coli K12 cepas se ha mantenido un ejercicio emprico en el que diferentes sistemas se prueban sin una visin cuidadosa en los diversos factores que afectan a la expresin adecuada de la protena codificada. La presente revisin se ocupar de E. coli como fbrica de protenas y cubrir algunos de los aspectos relacionados con las seales de expresin de transcripcin y traduccin, los factores que afectan la estabilidad de protenas y solubilidad y la orientacin de las protenas a diferentes compartimentos celulares.