Mikrobiologi adalah ilmu pengetahuan yang mempelajari berbagai kehidupan makhluk kecil yang hanya dapat dilihat dengan

mikroskop. Bakteri sebagai mikroorganisme memiliki kemampuan untuk beradaptasi di berbagai habitat. Pertumbuhan dan perkembangbiakan bakteri dipengaruhi oleh beberapa hal, misalnya tingkat kandungan air (water activity) dan nutrisi yang diperoleh dari lingkungannya. Tujuan dari Praktikum Mikrobiologi ini adalah untuk mengetahui cara cara mensterilkan alat dan bahan, mengetahui cara pembuatan medium dan larutan pengencer dengan komposisi yang tepat, mengetahui cara menghitung jumlah mikroba, mengetahui cara pewarnaan !ram pada mikroba serta bentuk dan struktur mikroba yang terdapat dalam sampel. Man"aat Praktikum Mikrobiologi umum ini adalah agar dapat mengetahui proses pertumbuhan dan perkembangan mikroba dalam bahan pakan dimana mikroba mempunyai banyak hubungan dan peranan yang sangat penting dalam kehidupan makhluk hidup.

B#B $$

T$%&#'#% P'(T#)#

*.+. (terilisasi

,ara aseptik yang harus dilakukan dalam pekerjaan mikrobiologi merupakan cara kerja dimana terjadinya kontaminasi oleh mikroba lain yang tidak dikehendaki dicegah semaksimum mungkin, sedangkan substansi mikroba yang dikehendaki dipertahankan semaksimum mungkin (-ardia., +/0/). (terilisasi menurut pengertian medis merupakan suatu proses dengan metode tertentu dapat memberikan hasil akhir berupa suatu bentuk keadaan yang tidak dapat ditunjukkan lagi adanya mikroorganisme hidup. Metode sterilisasi cukup banyak, namun alternati" yang dipilih sangat bergantung pada keadaan dan kebutuhan. (terilisasi merupakan kegiatan khusus yang mengelola peralatan steril yang siap pakai (1armadi, *220). Mikroorganisme memiliki kerentanan berbeda terhadap bahan bahan yang digunakan untuk mematikannya. Terdapat perbedaan antara beberapa jenis tergantung dari kadar air dan p3 lingkungan, dan dari umur sel atau spora dan seterusnya ((chlegel, +//4). Metode panas kering memiliki prinsip dasar mekanisme konduksi, panas akan diabsorpsi oleh permukaan luar dari peralatan yang disterilkan. 5alu merambat ke bagian yang lebih dalam dari peralatan tersebut sampai suhu untuk sterilisasi tercapai secara merata. Mikroba terbunuh dengan cara oksidasi, dimana protein mikroba akan mengalami koagulasi. (terilisasi ini menggunakan udara panas pada sebuah alat yang disebut oven.

(uhunya dapat mencapai +62 +027 ,, membutuhkan waktu + * jam dan digunakan untuk sterilisasi alat alat dari gelas seperti tabung reaksi, labu, cawan petri, dan sebagainya (1armadi, *220). Masa sterilisasi dengan metode basah untuk mematikan spora bakteri yang mewakili jenis bakteri yang amat tahan terhadap pemanasan dalam reduksi maksimal. (uhu uap di bawah tekanan tergantung pada tekanan. )alau masih ada udara, suhu yang sesuai dengan tekanan tertentu jauh lebih rendah. Pematian dengan sterilisasi basah tergantung pada tinggi suhu dan tidak pada besar tekanan, maka penghilangan udara sebelum autokla" ditutup harus dilakukan secara teliti ((chlegel, +//4). Medium cair disterilkan dengan metode sterilisasi basah menggunakan alat yang bernama autokla" pada suhu +*+7,, tekanan * atm, dan selama +2 +8 menit ((uwahyono, *22/).

*.*. Medium dan 5arutan Pengencer

Bakteri dapat berproli"erasi sangat cepat apabila lingkungannya cocok, baik dalam habitat alami atau kultur di laboratorium. Bakteri sangat mudah beradaptasi, baik dalam pengertian adaptasi evolusioner melalui seleksi alam, maupun dalam pengertian proses "isiologis terhadap perubahan lingkungan oleh masing masing bakteri. (el bakteri membelah diri dengan pembelahan biner, yang didahului oleh replikasi kromosom bakteri (,ampbell et al., *22*). )omponen medium untuk pertumbuhan jasad renik dapat berupa campuran bermacam macam mineral anorganik yang konsentrasinya tertentu maupun berupa bahan bahan organik (9uwono, *220). Mikroorganisme memiliki kerentanan berbeda terhadap bahan bahan yang digunakan untuk mematikannya. Terdapat perbedaan antar beberapa jenis tergantung dari kadar air dan p3 lingkungan, dan dari umur sel atau spora dan seterusnya ((chlegel, +//4). Medium merupakan media yang digunakan untuk menumbuhkan mikroba. Medium dibedakan menjadi tiga, yaitu medium cair yang dapat digunakan untuk berbagai tujuan termasuk menumbuhkan atau membiakkan mikroba, "ermentasi, misalnya %utrient Broth, dan !lucose Broth. Medium padat misalnya %utrient #gar, Plate ,ount #gar dan Potato 1e:trose #gar yang digunakan untuk menumbuhkan mikroba pada permukaannya sehingga membentuk koloni yang dapat dihitung atau diisolasi. Medium setengah padat yang memiliki konsistensi di antara medium cair dan medium padat. 5arutan pengencer mengandung bu""er untuk menjaga keseimbangan ion dari tubuh mikroba (-ardia., +/0/). #gar merupakan campuran agarosa dan agaropektin. #gar tidak dipengaruhi oleh berbagai mikroorganisme. 3anya saja dapat diisolasi beberapa bakteri dari air laut dan ganggang laut yang dapat menghisrolisis agar ((chlegel, +//4). #gar merupakan suatu jenis karbohidrat kompleks yang diisolasi dari alga. #gar membentuk matriks padat serupa gelatin (;lrod dan (tans"ield, *226).

Potato 1e:trose #gar (P1#) merupakan suatu medium yang mengandung sumber karbohidrat dalam jumlah cukup, yaitu terdiri dari *2< ekstrak kentang dan *< glukosa, sehingga baik untuk pertumbuhan kapang dan khamir tetapi krang baik untuk pertumbuhan bakteri. #kan tetapi karena beberapa bakteri juga mem"ermentasi karbohidrat dan menggunakannya sebagai sumber energi, maka beberapa bakteri masih mungkin tumbuh pada P1# (-ardias, +//=). Terdapat lusinan medium pertumbuhan untuk inokulasi biakan aerobik. Pemilihan medium sesuai si"at spesimen atau tempat asal spesimen diambil. (uhu inkubasi standar untuk biakan bakteri aerobik adalah =8 =>7,. Pencegahan biakan rusak oleh pertumbuhan spesies spesies lain yang lebih cepat berkembangbiak selama inkubasi dapat dilakukan dengan pemberian bahan kimia untuk mematikan kontaminan secara selekti" ((acher dan McPherson, *224). (elain menyediakan nutrien yang sesuai untuk kultivasi bakteri, juga perlu disediakan kondisi "isik yang memungkinkan pertumbuhan optimum untuk bakteri. (uhu mempengaruhi laju pertumbuhan dan jumlah total pertumbuhan mikroorganisme pada suatu medium. p3 optimum pertumbuhan bagi kebanyakan bakteri antara 6,8 >,8, namun beberapa spesies mikroba dapat tumbuh dalam keadaan p3 sangat asam atau sangat basa. !as gas utama yang mempengaruhi pertumbuhan bakteri ialah oksigen dan karbondioksida. #pabila medium dibuat dengan cara penuangan agar dalam, maka di"usi oksigen dari udara melalui medium menjadi terhambat, sehingga daerah didasar medium tidak mengandung oksigen (aerobik) (Pelc.sar dan ,han, +/06). Bakteri yang tumbuh di atas agra atau pada lapis tipis cairan yang berkontak dengan udara, biasanya mendapat suplai oksigen yang cukup. Mikroorganisme hanya dapat mengolah oksigen yang terlarut. Mikroorganisme menunjukkan perbedaan yang signi"ikan dari segi tuntutan keperluan akan kadar air. Mikroorganisme dapat tumbuh pada aiktivitas air dari 2,//0 sampai 2,6 ((chlegel, +//4).

*.=. Metode 3itungan ,awan

Metode hitungan cawan tidak berdasarkan jenis mikroorganisme, tatapi secara kasar terhadap kelompok atau golongan besar mikroorganisme umum atau terhadap bakteri tertentu ((uriawiria, +//=). Pertumbuhan pada bakteri dide"inisikan pada pertambahan berat sel. )arena berat sel relati" sama pada setiap siklus sel, maka pertumbuhan mikroba dapat dide"inisikan sebagai pertambahan jumlah sel (Purwoko, *22>). (etiap koloni dapat dianggap berasal dari satu sel yang membelah menjadi banyak sel. Penghitungan jumlah koloni dapat menggunakan rumus ? jumlah koloni : +@"aktor pengenceran. 3asil penghitungan menggunakan dua angka. #pabila koloni yang terhitung kurang dari =2 koloni, hanya jumlah koloni pada pengenceran terendah yang dihitung. #pabila koloni yang terhitung jumlahnya lebih dari =22, maka jumlah koloni pada pengenceran yang tertinggilah yang

dihitung. &ika cawan dari dua tingkat pengenceran menghasilkan koloni dengan jumlah antara =2 =22, dan perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah dari kedua pengenceran tersebut lebih kecil atau sama dengan *, tentukan rata rata dari kedua nilai tersebut dengan memperhitungkan pengencerannya. &ika perbandingannya lebih dari *, yang digunakan adalah pengenceran yang paling kecil (-ardias, +//=). &umlah sel hidup yang dihitung adalah jumlah koloni yang berasal dari sel sel yang mampu terus hidup pada kondisi pertumbuhan yang menguntungkan ((chlegel, +//4). &umlah kapang dan khamir di dalam contoh makanan dapat dihitung dengan metode hitungan cawan dapat menggunakan medium Potato 1e:trose #gar (P1#) (-ardias, +//=). (esuai dengan namanya, teknik ini adalah teknik menyebar sampel (yang telah diencerkan) diatas permukaan pelat agar dalam cawan petri. 'mumnya antara 2,+ ml dan + ml sampel disebarkan di permukaan media padat dengan menggunakan tangkai gelas steril. ,awan kemudian diinkubasi dalam kurun waktu tertentu dan jumlah koloni yang muncul dihitung. 3asil yang baik adalah cawan petri yang mengandung koloni berkisar antara =2 =22 koloni (3armita dan Aadji, *226). Mikroorganisme dibiakkandi laboratorium pada bahan nutrient yang disebut medium (Pelcs.ar dan ,han, +/06). #gar hasil yang didapatkan semaksimal mungkin mendekati keadaan alami, pengenceran dapat dilakukan sampai ke nilai tertinggi, umumnya +2 +2. 1engan pengenceran tertinggi perhitungan jumlah sel berdasarkan koloni ataupun pewarnaan jauh lebih baik hasilnya kalau dibandingkan dengan pengenceran rendah ((uriawiria, +//=). (uspensi dapat disebarkan pada permukaan pelat agar atau dicampur dengan agar cair, yang kemudian dituangkan di dalam cawan petri dan dibiarkan memadat. Pelat agar tersebut kemudian diinkubasi pada kondisi yang memungkinkan mikroorganisme untuk bereproduksi dan membentuk koloni yang terlihat tanpa bantuan mikroskop. 1engan menghitung jumlah koloni dan memperhitungkan "aktor pengenceran, jumlah bakteri pada sampel asal dapat ditentukan. )elemahan utama metode tersebut adalah keselekti"an sehingga hasil perhitungan kadang kala bias. )ondisi pertumbuhan, termasuk komposisi media yang digunakan, waktu inkubasi, suhu, dan p3 sangat menentukan jenis bakteri yang dapat tumbuh ari seluruh populasi yang ada (3armita dan Aadji, *226). )ultur diencerkan sampai batas yang diinginkan (lebih tinggi pengenceran lebih baik), kultur encer ditumbuhkan kembali pada media, sehingga diharapkan setiap sel tumbuh menjadi satu koloni beberapa saat berikutnya, misalnya 4 +* jam. #kan tetapi cara ini memiliki keterbatasan, yaitu jumlah sel yang terhitung biasanya lebih kecil dari sebenarnya (kemungkinan besar satu koloni dapat berasal dari dua sel) dan tidak dapat diaplikasikan pada bakteri yang pertumbuhannya lambat. Pada metode ini, yang perlu diperhatikan adalah jumlah sel bakteri harus mendekati kelipatan +2 pada setiap pengencernannya. &ika tidak, maka perhitungan dianggap gagal (Purwoko, *22>).

Metode hitungan cawan pada bakteri ditentukan berdasarkan penanaman bahan dalam jumlah dan pengenceran tertentu ke dalam media yang umum untuk bakteri ((uriawiria, +//=). Terdapat empat "ase pertumbuhan bakteri ketika ditumbuhkan pada kultur curah (batch culture), yaitu "ase adaptasi, "ase perbanyakan, "ase statis dan "ase kematian. Proses adaptasi meliputi sintesis en.im baru yang sesuai dengan medianyadan pemulihan terhadap metabolit yang bersi"at toksik (misalnya asam, alkohol, dan basa) pada media sebelumnya. Pada "ase ini belum dijumpai penambahan sel, akan tetapi terjadi penambahan volume sel. Pada "ase perbanyakan jumlah sel meningkat sampai batas tertentu. (el melakukan konsumsi nutrien pada proses "isiologis lainnya. Pada "ase statis, biasanya sel melakukan adaptasi terhadap kondisi yang kurang menguntungkan. #daptsi ini dapat menghasilkan senyawa yang diinginkan manusia misalnya antibiotika dan antioksidan. Penyebab utama kematiaan adalah autolisis sel dan penurunan energi seluler (Purwoko, *22>). *.4. Pewarnaan !ram

,ara pewarnaan !ram diciptakan pertama kali tahun +004 oleh seorang ahli bakteriologi yang bernama ,hristian !ram. ,ara pewarnaan ini merupakan cara pewarnaan di"erensial, dimana dengan cara ini bakteri dapat dibedakan menjadi dua grup yaitu bakteri gram positi" dan bakteri gram negati" (-ardia., +/0/). )ebanyakan sel bakteri tidak berwarna, sehingga jika dilarutkan di dalam air dan dilihat di bawah mikroskop tidak memperlihatkan warna yang kontras dengan medium di sekelilingnya ((acher dan McPherson, *224). (ebelum dilakukan pewarnaan, maka sel sel bakteri harus terlebih dahulu di"iksasi pada gelas objek. &ika kultur diambil dari medium cair, maka penyebaran dapat langsung dilakukan diatas kaca objek yang bersih menggunakan jarum loop atau jarum ose. Tetapi jika kultur diambil dari agar padat, maka sebelumnya diatas kaca objek harus diberi setetes air, kemudian kultur diambil sedikit menggunakan jarum ose yang telah dipijarkan, dan diratakan di atas kaca objek sehingga terbentuk lapisan tipis. Bakteri 5actobacillus, (treptococcus, (taphylococcus dan (teptococcus merupakan bakteri yang termasuk bakteri gram positi". (edangkan bakteri ;. coli, ;nterobacter aerogenes, dan Pseudomonas tergolong bakteri gram negati" (-ardia., +/0/). Pada proses ini yang harus dihindari adalah "iksasi panas berlebihan, yang dapat merusak integritas struktural bakteri dan mor"ologi sel. #lasan keberhasilan metode pewarnaan !ram adalah bahwa mikroorganisme yang tidak diwarnai, dan bakteri terwarnai dapat dibedakan berdasarkan perbedaan struktur dinding selnya. Bakteri gram positi" terwarnai ungu memiliki dinding sel yang tebal, dan bakteri gram negati" yang terwarnai merah memiliki dinding sel yang relati" tipis, dilapisi oleh membran luar yang mengandung lipopolisakarida. ;tanol merupakan decolori.er yang lebih lambat dibandingkan dengan aseton ((acher dan McPherson, *224). Bakteri gram positi" adalah bakteri yang memepertahankan .at warna gram # yang mengandung kristal violet sewaktu proses pewarnaan !ram. Bakteri

negati" akan berwarna merah atau merah muda, karena warna ungu dapat dilunturkan kemudian mengikat warna gram 1 (sa"ranin) (Brooks et al., *22+). #da banyak perbedaan dalam ukuran panjang dan lebar di antara berbagai spesies basilus. 'jung beberapa basilus tampak persegi, yang lain bundar, dan yang lain lagi meruncing atau lancip seperti ujung cerutu. )adang kadang basilus tetap saling melekat satu dengan lainnya, ujung dengan ujung, sehingga memberikan penampilan rantai. )okus memperlihatkan penataan yang berbeda beda, diplokokus ? sel membelah diri pada satu bidang pada satu bidang dan tetap saling melekat terutama berpasangan. (treptokokus ? sel membelah diri pada satu bidang dan tetap melekat membentituk rantai, tetrakokus ? sel membelah diri pada dua bidang dan membentuk kelompok yang terdiri dari empat sel. (ta"ilokokus ? sel membelah diri pada tiga bidang dan membentuk gerombolan kokus, sarsina ? membentuk kubus (Pelcs.ar dan ,han, +/06). Bakteri terdapat dalam berbagai bentuk ? basilus (seperti batang), kokus (bentuk bulat), spirilus (spiral), spiroketa (ulir atau heliks) dan bercabang. )arena sel sel individual bakteri terlampau kecil, sehingga memiliki variasi dalam bentuk dan ukuran (;lrod dan (tans"ield, *226).

B#B $$$

M#T;A$ 1#% M;TB1;

Praktikum Mikrobiologi dilaksanakan pada hari (elasa, = Mei *2++ pada pukul 2/.22 +4.22 C$B dan Aabu, 4 Mei *2++ pada pukul +=.22 +8.22 C$B di 5aboratorium -isiologi dan Biokimia Ternak -akultas Peternakan 'niversitas 1iponegoro (emarang.

Materi

Praktikum (terilisasi, medium dan larutan pengencer, metode hitungan cawan, dan pewarnaan gram menggunakan bahan antara lain %utrient Broth yang dugunakan untuk pembuatan %utrient #gar (%#), agar, kentang, dendeng, aDuades, larutan alkohol, larutan lugol, asam tartarat, ungu violet, etanol /8 <, sa"ranin, de:trose, dan kapas. #lat alat yang digunakan dalam praktikum adalah tabung reaksi yang digunakan untuk tempat larutan, cawan petri sebagai tempat penumbuhan media, erlenmeyer untuk menampung larutan, labu ukur untuk mengukur larutan, pipet ukur untuk mengambil larutan dengan akurat, kertas saring digunakan untuk menyaring "iltrat yang akan digunakan, mikroskop untuk mengamati bakteri gram positi" dan negati", alumunium "oil untuk penutup saat mensterilkan sampel cair, mikropipet dan tip + ml, pengaduk magnetik untuk

menghomogenkan larutan, colony counter untuk memudahkan penghitungan koloni setelah diinkubasi, inkubator untuk menginkubasi mikroba pada suhu yang terkontrol, autokla" untuk mensterilkan berbagai macam alat dan bahan yang digunakan menggunakan uap air panas bertekanan, api bunsen digunakan untuk pemijarn jarum ose atau jarum inokulum sebagai pemindah biakan ke media baru, kaca objek untuk meletakkan sampel yang akan diamati pada pewarnaan gram, tissue untuk membersihkan sisa aDuades pada kaca objek, dan alat tulis untuk mencatat hasil praktikum.

Metode

(terilisasi

(terilisasi kering bertujuan untuk mensterilkan alat alat yang akan digunakan dengan cara menyiapkan cawan petri, kemudian membersihkan cawan petri dengan alkohol dan membungkus cawan petri dengan kertas pembungkus. Bersihkan pipet hisap dan sumbat bagian pangkal pipet dengan kapas, kemudian bungkus pipet dengan kertas. Memasukkan cawan petri dan pipet ke dalam oven selama + jam pada suhu +>22 , atau * jam selama +62E,. (etelah selesai cawan petri dikeluarkan dari oven dan menunggu hingga dingin sebelum digunakan. (terilisasi basah bertujuan untuk menseterilkan medium dan bahan. Memasukkan medium yang akan disterilkan ke dalam erlenmeyer, kemudian menutup rapat dengan menggunakan kapas. Menyiapkan +2 tabung reksi yang masing masing terisi aDuades / ml dan menyumbatnya dengan kapas. Memasukkan erlenmeyer dan tabung reaksi tersebut ke dalam autokla", kemudian menutup autokla" dengan rapat. Menyalakan autokla" dan menunggu hingga manometer serta termometer menunjukkan suhu +*+2 , dan * atm selama +8 menit. Membuka katup pengaman setelah selesai dan biarkan hingga autokla" tidak lagi bertekanan dan mengeluarkan mediumnya.

Medium dan 5arutan Pengencer

Medium %utrient #gar (%#) dibuat dengan menyiapkan +,8 gr agar dan +,= gr %B dan +22 ml aDuades memasukkannya ke dalam gelas erlenemeyer dan mencampur keduanya dengan alat pengaduk. )emudian tutup gelas enlemeyer dengan alumunium "oil, memasukan larutan agar tersebut ke dalam autokla" sampai batas yang ditentukan, kemudian meniriskan larutan agar, setelah itu baru dapat digunakan sebagai medium. (edangkan Potato 1e:trose #gar (P1#) dibuat dengan cara mengupas kentang dengan ukuran +:+:+ cm sebanyak >8 gr. Memasukkan kentang ke dalam bekerglass dan menambahkan +82 ml

aDuades, kemudian menutup bekerglass dengan aluminium "oil. Mengambil "iltrat kentang dengan cara menyaringnya menggunakan kain saring. Membuat medium P1# dengan komposisi 62 ml "iltrat kering, +,* gr de:trose, +,* gr agar dengan p3 diatur 6,0 >,*. (terilkan medium P1# dan larutan asam tartarat +2< ke dalam autokla" pada suhu +*+2 ,, * atm selama =2 menit. (etelah steril memasukkan medium P1# ke dalam inkubator bersuhu 822 ,. (etelah keduanya mencapai suhu 82E, menambahkan dengan pipet ukur steril larutan asam tartarat +2< kedalam medium P1# secara aseptis. 5arutan pengencer memerlukan perlakuan pengenceran pada bahan pangan yang diperkirakan mengandung lebih dari =22 sel mikroba per ml. Menimbang irisan dendeng sekitar *22 gr lalu melarutkannya dengan air pada erlenmeyer yang sudah disterilisasikan menggunakan pengaduk magnetik. Perlakuan pengenceran dilakukan sebelum mencampurkan bahan dengan medium agar atau medium lain di dalam cawan petri, sehingga setelah inkubasi akan terbentuk koloni pada cawan tersebut dalam jumlah yang dapat dihitung, dimana jumlah terbaik adalah diantara =2 F =22 koloni. menggunakan larutan untuk pengenceran dapat berupa larutan bu""er pospat, larutan garam "isiologis 2,08 <, larutan ringer maupun aDuades.

=.*.=. Metode 3itungan ,awan

Metode Tuang dengan menyiapkan larutan sebanyak + ml atau 2,+ ml tersebut di pipet ke dalam cawan petri menggunakan pipet + ml menuangkan ke dalam cawan petri tidak boleh lebih dari =2 menit. )emudian memasukan ke dalam cawan tersebut agar cair steril yang telah didinginkan sampai 4> 82 2 , sebanyak +2 F +8 ml. (elama penuangan medium, tutup cawan tidak boleh dibuka terlalu lebar untuk menghindarkan kontaminasi dari luar. (etelah penuangan cawan menggerakan diatas meja secara hati F hati untuk menyebarkan sel mikroba secara merata yaitu dengan gerakan angka delapan. (etelah memadat, cawan F cawan tersebut dapat diinkubasi di dalam inkubator dengan posisi terbalik. Penghitungan koloni dilakukan dengan cara memilih dan menghitung cawan yang mengandung jumlah koloni antara =2 F =22. Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan koloni yang besar dimana jumlah koloninya diragukan, dapat dihitung sebagai satu koloni. (uatu deretan koloni yang terlihat sebagai suatu garis tebal dihitung sebagai satu koloni. Mencatat hasil penghitungan pada buku hasil pengamatan.

=.*.4. Pewarnaan !ram

Menggenangi objek dengan larutan gram # selama + menit. Membuang sisa .at warna pada nampan, kemudian membilas objek dengan aDuades. Menggenangi objek dengan larutan gram B selama * menit. Membuang sisa .at warna pada nampan, kemudian membilas objek dengan aDuades. Membilas objek dengan larutan gram , sampai warna birunya tidak luntur lagi, lalu membilas dengan aDuades. Menggenangi objek dengan larutan gram 1 selama =2 detik. Membuang sisa .at warna pada nampan, kemudian membilas objek dengan aDuades. Membersihkan sisa aDuades dengan tissue. )emudian mengamati dengan bantuan mikroskop dengan perbesaran +22 kali. Menggambar bentuk bakteri yang tampak pada mikroskop.

B#B $G

3#($5 1#% P;MB#3#(#%

4.+. (terilisasi

(terilisasi yang dilakukan ada dua macam, yaitu sterilisasi kering dan sterilisasi basah. #lat yang mendapat perlakuan sterilisasi kering adalah alat alat yang terbuat dari gelas, misalnya pipet, tabung reaksi dan cawan petri. Pipet, tabung reaksi dan cawan petri yang disterilkan masing masing berjumlah +2 buah. Tujuan dari sterilisasi ini adalah untuk mematikan segala bentuk kehidupan termasuk mikroba, hal ini sesuai dengan pendapat -ardia. (+/0/) yang menyatakan bahwa sterilisasi merupakan cara aseptik yang harus dilakukan dalam pekerjaan mikrobiologi merupakan cara kerja dimana terjadinya kontaminasi oleh mikroba lain yang tidak dikehendaki dicegah semaksimum mungkin, sedangkan substansi mikroba yang dikehendaki dipertahankan semaksimum mungkin. (terilisasi kering menggunakan oven selama + * jam. 3al ini sesuai dengan pendapat yang dinyatakan oleh 1armadi (*220) yaitu sterilisasi kering dilakukan dengan udara panas pada sebuah alat yang disebut oven, suhunya dapat mencapai +62 +027 ,, membutuhkan waktu + * jam dan digunakan untuk sterilisasi alat alat dari gelas seperti tabung reaksi, labu, cawan petri, dan sebagainya. (terilisasi basah dilakukan pada larutan yang akan digunakan untuk bahan pembuatan medium dan larutan pengencer. (terilisasi ini dilakukan dengan autokla" pada suhu +*+7, dan dalam waktu +2 +8 menit, hal ini sesuai dengan pendapat (uwahyono (*22/) medium cair disterilkan menggunakan alat yang bernama autokla" pada suhu +*+7,, takanan * atm, dan selama +2 +8 menit. (ebelum autokla" digunakan, terlebih dahulu menghilangkan udara yang ada di dalam autokla", untuk menyesuaikan tekanan pada medium yang akan disterilkan. 3al ini sesuai dengan pendapat (chlegel (+//4) yang menyatakan

bahwa )alau masih ada udara, suhu yang sesuai dengan tekanan tertentu jauh lebih rendah, maka penghilangan udara sebelum autokla" ditutup harus dilakukan secara teliti.

4.*. Medium dan 5arutan Pengencer

Pembuatan medium %utrient #gar membutuhkan bahan %utrient Broth, agar dan aDuades. Pembuatan Potato 1e:trose #gar membutuhkan "iltrat kentang, aDuades, de:trose, agar, serta penyesuaian p3 pada medium yang akan dibuat menjadi medium biakan bakteri. Penyesuaian p3 pada medium yang akan dibuat dikarenakan pertumbuhan bakteri dipengaruhi juga oleh p3. 3al ini sesuai dengan pendapat Pelcs.ar dan ,han (+/06) yang menyatakan bahwa p3 optimum pertumbuhan bagi kebanyakan bakteri antara 6,8 >,8, namun pada beberapa spesies dapat tumbuh dalam keadaan sangat asam atau sangat basa. Pembuatan larutan pengencer dilakukan dengan menggunakan 6 tabung reaksi, memasukkan masing masing / ml pada tabung reaksi dan menutupnya dengan kapas dan di sterilisasi menggunakan autokla". (etelah medium dan larutan pengencer disiapkan, maka disterilkan dalam autokla" dengan suhu +*+7, selama +2 +8 menit, hal ini sesuai dengan pendapat yang dikemukakan oleh (uwahyono (*22/) yaitu medium cair disterilkan menggunakan alat yang bernama autokla" pada suhu +*+7,, takanan * atm, dan selama +2 +8 menit. 4.=. Metode 3itungan ,awan

Berdasarkan hasil praktikum denagn menggunakan metode hitungan cawan diperoleh hasil pengamatan ?

Tabel +. Metode 3itungan ,awan (ampel (P, +2 4 +2 8 +2 6 TB'1 TB'1 =,* : +26 +8* =/6 +04 +,8 : +26 Pengenceran

%utrient #gar (%#) =*2

Potato 1e:trose #gar (P1#)

(umber ? 1ata Primer Praktikum Mikrobiologi, *2++.

Berdasarkan pengamatan diketahui jumlah bakteri pada sampel %utrient #gar (%#) sebanyak =,* : +26 ,-'@ml. Pengenceran +2 8 dan +2 6 diperoleh hasil

TB'1 (terlalu banyak untuk dihitung) yang berarti bahwa jumlah koloni yang terhitung lebih dari =22 koloni, hasil ini mungkin dikarenakan terjadinya kontaminasi pada saat penanaman bakteri. 3al ini sesuai dengan pendapat yang dikemukakan oleh 3armita dan Aadji (*226) yang menyatakan bahwa hasil yang baik adalah cawan petri yang mengandung koloni berkisar antara =2 =22 koloni. 3asil perhitungan jumlah koloni yang dapat digunakan adalah pada pengenceran +2 4, hal ini dikarenakan pada hasil penghitungan, syarat penghitungan koloni yang memiliki range =2 =22 tidak terpenuhi, sehingga digunakan hasil perhitungan koloni yang memiliki kedekatan dengan range yang telah ditentukan. 3al ini sesuai dengan pendapat yang dikemukakan oleh -ardias (+//=) yang menyatakan bahwa pabila koloni yang terhitung jumlahnya lebih dari =22, maka jumlah koloni pada pengenceran yang tertinggilah yang dihitung. Berdasarkan pengamatan, diketahui jumlah bakteri pada sampel Potato 1e:trose #gar (P1#) sebanyak +,8 : +26 ,-'@ml. Pada sampel Potato 1e:trose #gar pada pengenceran +2 4, diperoleh hasil perhitungan koloni bakteri sebanyak +8*, pada pengenceran +2 8 diperoleh =/6 koloni yang terhitung dan pada pengenceran +2 6 koloni yang terhitung sebanyak +04. )arena pada pengenceran +2 4 dan +2 6 memenuhi persyaratan range =2 =22 koloni, maka dengan mencari rata ratanya dan kemudian membagi hasil pengenceran tetinggi dan pengenceran terendah apabila hasil rata ratanya lebih dari *, lalu diperoleh hasil +,8: +26 ,-'@ml. 3al ini sesuai dengan pendapat yang dikemukakan oleh -ardias (+//=) yang menyatakan bahwa jika cawan dari dua tingkat pengenceran menghasilkan koloni dengan jumlah antara =2 =22, dan perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah dari kedua pengenceran lebih dari *, yang digunakan adalah pengenceran yang paling kecil. Penghitungan pada metode hitungan cawan dapat dilihat tanpa bantuan mikroskop, hal ini sesuai dengan pendapat yang diungkapkan oleh 3armita dan Aadji (*226) yaitu pelat agar kemudian diinkubasi pada kondisi yang memungkinkan mikroorganisme untuk bereproduksi dan membentuk koloni yang terlihat tanpa bantuan mikroskop.

4.4. Pewarnaan !ram

Berdasarkan hasil pengamatan terhadap pewarnaan !ram yang dilakukan terhadap kultur padat 5actobacillus acidophillus dan (treptococcus thermophilus dengan perbesaran +22:, diperoleh hasil sebagai berikut ?

$lustrasi +. (truktur 5actobacillus acidophillus

Bentuk

? bacillus (batang)

)oloni ? berkelompok Carna? biru gelap !ram ? positi"

Bentuk

? bacillus (batang)

)oloni ? berkelompok Carna? biru keunguan !ram ? positi" (umber ? 1ata Primer Praktikum (umber ? sitemaker.umich.edu Mikrobiologi, *2++.

Berdasarkan pewarnaan !ram pada 5actobacillus acidophillus, diperoleh hasil ? bentuk bakteri basil (batang), koloninya berkelompok dengan jumlah koloni *2, warna biru gelap. Carna biru gelap pada dinding sel 5actobacillus acidophillus menunjukkan bahwa bakteri tersebut merupakan bakteri gram positi", hal ini sesuai dengan pendapat yang dikemukakan (acher dan McPherson (*224) yaitu bakteri gram positi" terwarnai ungu atau biru gelap memiliki dinding sel yang tebal. Bentuk basil pada bakteri 5actobacillus acidophillus panjang dan ramping serta ada pula yang tidak panjang dan ramping, hal ini sesuai dengan pendapat Pelc.sar dan ,han (+/06) yang menyatakan bahwa ada banyak perbedaan dalam ukuran panjang dan lebar di antara berbagai spesies basilus.

$lustrasi *. (truktur (treptococcus thermophilus

Bentuk

? coccus (bulat)

)oloni ? berkelompok Carna? biru gelap !ram ? positi"

Bentuk

? coccus (bulat)

)oloni ? berkelompok Carna? biru gelap

!ram ? positi" (umber ? 1ata Primer Praktikum (umber ? pica.illa.co.cc Mikrobiologi, *2++.

Berdasarkan pewarnaan !ram pada (treptococcus thermophilus, diperoleh hasil ? bentuk bakteri coccus (bulat), jumlah koloni TB'1 dan warna dinding selnya biru gelap. 3al ini sesuai dengan pendapat -ardia. (+/0/) yang menyatakan bahwa bakteri 5actobacillus, (treptococcus, (taphylococcus dan (teptococcus merupakan bakteri yang termasuk bakteri gram positi". Pada hasil pengamatan, bakteri (treptococcus thermophilus tampak bulat dan tidak menggerombol, hal ini menunjukkan bahwa bentuknya berpasangan (diplokokus). 3al ini sesuai dengan pendapat yang dikemukakan oleh Pelc.sar dan ,han (+/06) yaitu kokus memperlihatkan penataan yang berbeda beda, diplokokus ? sel membelah diri pada satu bidang pada satu bidang dan tetap saling melekat terutama berpasangan. B#B G

($MP'5#%

8.+. (impulan

Berdasarkan hasil praktikum sterilisasi, sterilisasi dilakukan berdasarkan bentuk alat atau bahan yang akan disterilkan. Berdasarkan hasil praktikum medium dan larutan pengencer, pembuatannya harus dilakukan dalam kondisi yang benar benar steril agar tidak terkontaminasi mikroorganisme yang lain. Berdasarkan hasil praktikum metode hitungan cawan, bakteri yang dapat dihitung diantara =2 =22 koloni. Berdasarkan hasil praktikum pewarnaan !ram, bakteri yang bereaksi positi" akan berwarna biru gelap.

8.*. (aran

Pelaksanaan Praktikum Mikrobiologi pada dasarnya sudah dilaksanakan dengan baik, namun perlu pemahaman yang lebih untuk memahami metode yang digunakan. #lat dan bahan yang digunakan pun sudah memadai, namun diperlukan persiapan yang lebih matang lagi agar proses praktikum berjalan dengan waktu yang e"ekti" dan e"isien.

1#-T#A P'(T#)#

Brooks, !. -., &anet, (. B., dan (tephen #. M. *22+. Mikrobiologi )edokteran Penerbit (alemba Medika, &akarta.

,ampbell, %.#., &. B. Aeece, dan 5. !. Mitchell. *22*. Biologi &ilid + ;disi )elima. ;rlangga, &akarta.

1armadi. *220. $n"eksi %osokomial. Penerbit (alemba Medika, &akarta.

;lrod, (. 5. dan C. 1. (tans"ield. *226. !enetika ;disi )eempat. ;rlangga, &akarta.

-ardia., (. +/0/. Mikrobiologi Pangan. Penerbit $PB, Bogor.

-ardias, (. +//=. #nalisis Mikrobiologi. PT. Aaja !ra"indo Persada, &akarta.

3armita dan Aadji, M. *226. Buku #jar #nalisis 3ayati ;disi =. Penerbit Buku )edokteran ;!,, &akarta.

Pelc.sar, M. &. dan ,han ;(,. +/06. 1asar 1asar Mikrobiologi &ilid +. '$ Press, &akarta.

Purwoko, T. *22>. -isiologi Mikroba. Bumi #ksara, &akarta.

(acher, A. #. dan A. #. McPherson. *224. Tinjauan )linis 3asil Pemeriksaan 5aboratorium. Penerbit Buku )edokteran ;!,, &akarta.

(chlegel, 3. !. +//4. Mikrobiologi 'mum. !adjah Mada 'niversity Press, 9ogyakarta.

(uriawiria, '. +//=. Mikrobiologi #ir. Penerbit #lumni, Bandung.

(uwahyono, '. *22/. Biopestisida. Penebar (wadaya, &akarta.

http?@@www.sitemaker.umich.edu

http?@@www.pica.illa.co.cc

9uwono, T. *220. Boiologi Molekuler. ;rlangga, &akarta.

5#MP$A#%

5ampiran +. Pertanyaan

Pertanyaan (terilisasi

&elaskan perbedaan sterilisasi kering dan sterilisasi basah H &awab ? (terilisasi kering digunakan untuk mensterilkan alat alat yang terbuat dari gelas, misalnya cawan petri, pipet dan tabung reaksi. (terilisasi kering menggunakan oven dengan jangka waktu + * jam. (terilisasi basah digunakan untuk mensterilkan medium cair. (terilisasi menggunakan autokla" pada suhu +*+7, selama +2 8 menit. &elaskan tujuan sterilisasi H &awab ? tujuan dari sterilisasi adalah untuk menghilangkan segala bentuk kehidupan, bahkan sampai tingkat mikroba.

Pertanyaan Medium dan 5arutan Pengencer

&elaskan "ungsi dari masing masing komponen di bawah ini dalam medium ? Pepton #gar c. ekstrak sapi d. %a,l

&awab ? a. pepton ber"ungsi sebagai sumber utama nitrogen organic dari sumber nutrisi agar ber"ungsi sebagai pemadat medium P1# ;kstrak sapi ber"ungsi sebagai perangsang spermiasi pada sapi %a,l ber"ungsi sebagai media pendingin &elaskan perbedaan masing masing medium di bawah ini ? %utrien #gar Potato 1e:trose #gar 5actose Broth Plate ,ount #gar Brilliant !reen 5actose Bile Broth &awab ? %utrient #gar merupakan medium umum untuk uji air dan prosuk diary yang digunakan untuk pertumbuhan mayoritas dari mikroorganisme yang tidak selekti", dalam artian mikroorganisme heterotro". Potato 1e:trose #gar merupakan medium mikroorganisme yang terbuat dari in"us kentang dan de:trosenya atau gula jagung. 5actose Broth merupakan medium yang digunakan untuk pendektesian bakteri coli"orm (;schericia dan ;nterobacter), sebagai preenrichment untuk (almonella dan studi "ermentasi laktosa bakteri secara umum. Plate ,ount #gar merupakan media pertumbuhan umum yang digunakan untuk menila atau memantau pertumbuhan bakteri yang layak sampel. Briliant !reen 5actose Bile Broth merupakan medium yang digunakan untuk mendeteksi bakteri coli"orm dalam air, makanan, dan produk susu.

(ebut dan jelaskan klasi"ikasi medium H &awab ? Medium berdasarkan si"at "isik

Medium padat yaitu media yang mengandung agar +8 < sehingga setelah dingin dingin menjadi media yang padat. Medium setengah padat yaitu media yang mengandung agar 2,= +,4

Pertanyaan Metode 3itungan ,awan

Bagaimana prosedur perhitungan total mikroba pada sampel susu bubuk hingga pengenceran +2 8. 3itung pula kebutuhan alat dan bahan H 5aporkan I(tandard Plate ,ountJ dari sampel di bawah ini H (ampel +2 * +2 = Pengenceran +2 4 +2 8 *02 (P,

)aldu daging *6* *0 + 48 =

(usu segar TB'1 TB'1 TB'1 >20 >0* =2* +80

TB'1

(osis TB'1 */4 1endeng 88

=8 +8

8 + 2

&awab ?

Pertanyaan Pewarnaan !ram

&elaskan perbedaan bakteri gram positi" dan bakteri gram negati" H

&awab ? bakteri !ram positi" menunjukkan warna ungu apabila diuji menggunakan pewarnaan !ram, sedangkan bakteri !ram %egati" menunjukkan warna merah. (ebutkan jenis dan bentuk koloni bakteri yang termasuk patogen H &awab ?

5ampiran *. 3asil Perhitungan Metode 3itungan ,awan

(ampel +2 4 +2 8

Pengenceran +2 8

(P,

%utrient #gar (%#) =*2

TB'1 TB'1 =,* : +26 +8* =/6 +04 +,8 : +26

Potato 1e:trose #gar (P1#)

%utrient #gar (%#) )arena perhitungan pada ketiga pengenceran yang dapat dihitung adalah pada pengenceran +2 4, maka yang dihitung adalah ? (P, K L koloni : +@("aktor pengenceran) K =*2 : +@+2M( 4) K =, * : +26

Potato 1e:trose #gar (P1#) )arena terdapat dua hasil hitungan yang memenuhi syarat range antara =2 =22, maka dihitung terlebih dahulu rata ratanya. #pabila lebih dari dua maka yang digunakan adalah perhitungan pada "actor pengenceran yang paling kecil. Aata rata K (pengenceran +2M( 6))@(pengenceran +2M( 4) ) K (+,04 : +2M0)@(+,8* : +2M6 ) K +*+, .. +2* N O* , maka (P, K L koloni : +@("aktor pengenceran) K +8* : +@+2M( 4) K +,8 : +26

5ampiran =. !ambar dan -ungsi #lat Praktikum

Tabung reaksi ? (ebagai tempat untuk mereaksikan bahan kimia, melakukan reaksi kimia dalam skala kecil.

,awan Petri ? Terbuat dari porselen dan biasa digunakan untuk wadah larutan.

Bven ? 1igunakan untuk pemanasan alat alat pada sterilisasi kering dengan suhu +>22 ,.

Timbangan 1igital ? 1igunakan untuk menimbang bahan yang akan digunakan dengan ketelitian yang sangat tinggi.

Tabung 'kur ? 1igunakan untuk mengukur cairan dalam volume yang kecil.

Pipet hisap ? Ber"ungsi untuk mengambil larutan dan memindahkan larutan pada lubang yang kecil.

Bunsen @ pembakar spiritus ? 1igunakan untuk memanaskan bahan kimia.

Magnetic stirrer ? Ber"ungsi untuk mengaduk atau menghomogenkan suatu campuran larutan.

!elas ukur ? 'ntuk mengukur volume larutan tidak memerlukan tingkat ketelitian yang tinggi dalam jumlah tertentu.

5abu ;rlenmeyer ? 'ntuk menyimpan dan memanaskan larutan dan menampung "iltrat hasil penyaringanm menampung titran (larutan yang dititrasi) pada proses titrasi.

&arum $nokulasi ? 1igunakan untuk memindahkan mikroba pada biakan atau pun pada pewarnaan.

#utokla" ? 1igunakan dalam sterlisasi basah yaitu untuk memanaskan dengan derejat dan tekanan tertentu juga untuk mensterilkan alat alat gelas seperti erlenmeyer, cawan petri, pipet hisap, tabung reaksi, dsb.